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Article de méthode

Amélioration de la préparation et la conservation de l'hippocampe Tranches de souris pour un enregistrement très stable et reproductible de potentialisation à long terme

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DOI :

10.3791/50483

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26 juin 2013

 , 
1Department of Neurosciences, Research Institute for Biosciences, University of Mons

Dans cet article

Résumé

Cet article présente une méthodologie complète pour préparer et conserver In vitro Coupes d'hippocampe aiguë de souris adultes. Ce protocole permet l'enregistrement de potentialisation à long terme durable très stable (LTP) pendant plus de 8 heures avec un taux de réussite de 95%.

Résumé

Potentialisation à long terme (LTP) est un type de plasticité synaptique caractérisée par une augmentation de la force synaptique et censé être impliqué dans l'encodage de la mémoire. LTP a suscité dans la région CA1 de tranches d'hippocampe aiguë a été largement étudiée. Cependant, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la phase d'entretien de ce phénomène sont encore mal compris. Cela pourrait être dû en partie aux différentes conditions expérimentales utilisées par les différents laboratoires. En effet, la phase de maintien de la LTP est fortement dépendant de paramètres extérieurs tels que l'oxygénation, la température et l'humidité. Il dépend aussi de paramètres internes tels que l'orientation du plan de tranchage et la viabilité de la tranche après dissection.

L'optimisation de tous ces paramètres permet l'induction d'une potentialisation très reproductible et très stable à long terme. Cette méthode offre la possibilité d'explorer plus avant les mécanismes moléculaires impliqués dans l'augmentation stablela force synaptique dans des coupes d'hippocampe. Il souligne également l'importance des conditions expérimentales dans l'investigation in vitro de phénomènes neurophysiologiques.

Introduction

Aujourd'hui, il ya une compréhension limitée de la façon dont les souvenirs complexes sont mémorisés et rappelés au niveau du circuit neuronal. Cependant, une hypothèse unificatrice de stockage de mémoire est disponible et largement acceptée: les souvenirs sont stockés comme des changements dans la force des connexions synaptiques entre les neurones dans le système nerveux central. À elle seule, la recherche sur la plasticité synaptique a largement bénéficié de deux découvertes révolutionnaires. (1) Dans un essai séminal, Bliss et Lomo 1, en ​​utilisant le lapin anesthésié intact, a constaté que la livraison d'une brève haute fréquence (1 sec, 100 Hz) stimulation de la voie perforante de l'hippocampe a provoqué une longue durée (plusieurs heures) augmenter dans les connexions synaptiques liés. Ce phénomène fascinant s'appelait «potentialisation à long terme» ou LTP par Douglas et Goddard en 1975 2. (2) Par la suite, il a été constaté qu'un phénomène similaire pourrait être déclenché dans des tranches de cerveau (0,4 mm) maintenu artificiellement en vie in vitro . La LTP plus étudié a été observée in vitro en fournissant un ou plusieurs tetani à un faisceau d'axones (les soi-disant collatérales de Schaffer) tout en enregistrant le champ excitateur potentiel synaptique résultant évoqué dans les neurones pyramidaux de la région dite CA1. Les mécanismes de LTP induction ont été largement mis en évidence. Fondamentalement, un influx de Ca2 + à travers les récepteurs NMDA active les enzymes avec deux conséquences: une phosphorylation des récepteurs AMPA (ce qui augmente leur efficacité) et une incorporation de récepteurs AMPA supplémentaires dans la membrane post-synaptique 3. En revanche, les mécanismes de la phase de maintien de la LTP sont largement inconnues, notamment parce qu'elle est expérimentalement beaucoup plus difficile de maintenir une tranche santé pendant de nombreuses heures que pendant 30 à 60 min.

Beaucoup d'études ont été consacrées à la compréhension des mécanismes LTP et des théories intéressantes ont été élaborés au cours des années 4-11. Mais l'ONUjusqu'à présent, les mécanismes moléculaires précis qui sous-tendent l'augmentation stable de la force synaptique n'ont pas été élucidées. Cela pourrait être dû en partie à la difficulté de reproduire les résultats précédents dans différents laboratoires utilisant des techniques différentes pour la préparation et l'entretien des coupes d'hippocampe. Dans leur document de méthodologie, le 12 Sajikumar et al. Souligné l'importance des conditions expérimentales pour la préparation de coupes d'hippocampe de rat et l'enregistrement de LTP stable. Dans cette vidéo, nous vous présentons l'ensemble des étapes d'optimisation développés dans notre laboratoire au cours des années pour être en mesure d'enregistrer une LTP très stable dans les tranches d'hippocampe de souris.

Cette optimisation a été faite à partir des protocoles développés et utilisés avec succès par d'autres laboratoires qui étudient les mécanismes LTP chez les souris et les rats 13 11. Il permet aux chercheurs expérimentés pour induire et enregistrent une très longue durée LTP chez des souris adultes avec un taux de réussite élevé. Le physiological base de la LTP induite a été soigneusement vérifié et démontré 14. Dans ce document de méthodologie, nous montrons que les modifications des conditions expérimentales, telles que la température ou l'oxygénation peuvent avoir un impact profond sur l'entretien LTP alors que la procédure de dissection peut profondément modifier tranches excitabilité. Il faut également souligner que le contrôle précis de tous ces paramètres nécessite une formation de plusieurs mois pour les étudiants débutants.

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Protocole

Toutes les procédures d'animaux ont été effectuées en conformité avec les Instituts de réglementation de la Santé nationale pour le soin et l'utilisation des animaux en recherche et avec l'accord du comité d'éthique local.

1. Préparation de Artificial liquide céphalo-rachidien

Les mêmes médias sont utilisés pour disséquer, couper et perfuser tranches (1 ml / min) pendant la période de repos et les enregistrements électrophysiologiques. Ce support est composée de NaCl 124 mM, 4,4 mM de KCl, 26 mM NaHCO3, 1 mM de NaH 2 PO 4, 2,5 mM de CaCl2, 1,3 mM MgSO4 et 10 mM D-glucose.

  1. Peser les différentes composantes de 2 L de ACSF sauf MgSO 4, qui est déjà en solution (1 M). En utilisant une solution standard permet d'être sûr de la concentration exacte de Mg 2 +, car MgSO4 en poudre est fortement hygroscopique. Ca 2 +: Mg 2 + rapport influe grandement sur ​​l'induction et l'entretien LTP14 et donc leurs proportions doivent toujours être respectés.
  2. Mettez tous les composants à l'exception de CaCl2 dans un verre graduée et porter à 2 L d'eau distillée H 2 O.
  3. Remuer vigoureusement. Quand tout est dissous, ajouter carbogène par un bulleur d'aquarium et de tubes attachés à la cuve (95% O 2, 5% de CO 2). Attendez quelques minutes et ajouter du chlorure de calcium lorsque le pH est fixé à 7,4 par l'action de tampon bicarbonate.
  4. Gardez 600 ml dans un plat rectangulaire en verre réfrigéré et refroidir à 4 ° C avec de la glace autour de l'assiette. Ce support sera utilisé pour la dissection de l'hippocampe.
  5. Filtrer l'1,400 ml restants et conserver dans une fiole Erlenmeyer.

2. Préparation du Rig électrophysiologique et le cerveau Slice chambre d'enregistrement

Le circuit de perfusion est composé de 2 pompes péristaltiques, un pompage de fluide frais à partir d'un réservoir de réserve et l'autre de pompage de fluide utilisé de tchambre, il vous enregistrez sur une poubelle. Liquide frais est ajouté à un système de perfusion artisanale où elle est ré-oxygéné et chauffé avant d'atteindre la chambre d'enregistrement d'interface par gravité (figure 1A). La chambre d'enregistrement de l'interface été conçu par FST (Outils Fine Science, Vancouver, Canada, figure 1B). des tranches de tissu sont placés sur le filtre net tissés attachés à un anneau de puits amovible et peut être maintenue en permanence dans des conditions d'interface en réglant la hauteur du puits d'aspiration d'aiguille. Un tube en matière plastique fait maison est bloqué à son extrémité et perforé latéralement (0,5 mm) est fixé à l'aiguille d'aspiration pour augmenter la stabilité de ce niveau dans la chambre. La tête d'enregistrement est montée sur un bain d'eau contenant une pierre de dispersion de gaz qui contribue à maintenir un environnement humide en faisant passer de l'air humide à travers des orifices de déviation dans la tête d'enregistrement (pour diminuer la formation de gouttelettes d'eau). Bain et de la température du fluide sont contrôlées en faisant varier en continu le niveau de courant continu èmerugueux un caoutchouc de silicone incorporée élément de chauffage dans le bain d'eau. Thermistances dans le bain d'eau et les puits d'enregistrement de la température permettent de la chambre pour être réglée et contrôlée précisément à ces sites.

Le système de chauffage de la chambre est complétée par un système de chauffage global commander la température de l'ensemble du gréement. Le logiciel développé par des chercheurs de l'Université d'Edimbourg ( www.etcsystem.com ) surveille et égalise la température de l'air oxygéné, la tranche de cerveau, les électrodes et le gréement restant fournir un environnement stable pour les enregistrements à long terme (figure 1C) . La température utilisée pour des coupes d'hippocampe de souris est de 28 ° C.

  1. Rincez tout le circuit de perfusion à l'eau distillée H 2 O pour un minimum de 20 min et démarrer les systèmes de chauffage.
  2. Commencez le bouillonnement carbogène dans le circuit. Carbogen arrive dans les faits maison tubes de perfusion à travers fbougies ILTER et dans le bain d'eau au-dessous de la chambre d'enregistrement. Le débit dans le bain d'eau est contrôlé par un débitmètre. Si le débit est trop lent, le tissu pourrait devenir hypoxique. Inversement, si le débit est trop élevé, le gaz pourrait ne pas être suffisamment réchauffé et humidifié menant au séchage du tissu. Débit de gaz élevé peut aussi augmenter les chances de pulvérisation d'eau sur le tissu du bain d'eau au-dessous menant à un choc osmotique. Ceci peut être évité en ajoutant des bits de nylon de maille (100 um) à la sortie des orifices de déviation.
  3. Purger le circuit et remplir avec ACSF filtré.
  4. Mettez l'anneau qui soutiendra la tranche dans la chambre de retenue. Un filtre filet tissé avec des ouvertures de mailles allant de 500 à 750 um est étiré et fixé sur le noyau avec deux parties de la colle époxy à base de résine. Le filtre net tissé est composé de 87% polyamide et 13% élasthanne (culotte 15 den). Colle doit être appliquée avec soin pour éviter la formation de reliefs à la surface de la ring.
  5. Retirez soigneusement toutes les bulles d'air du circuit.
  6. Ajuster le niveau de ACSF dans la chambre d'enregistrement par la vis de l'aiguille d'aspiration. La vitesse des pompes péristaltiques est ajusté à 1 ml / min pour la pompe d'entrée et de 5 ml / min pour la pompe de sortie.

Le système de perfusion est placée sur une table rigide résistant aux vibrations et entouré d'une cage de Faraday.

3. Préparation de la zone de dissection

Instruments chirurgicaux: un scalpel avec une lame # 11, petits ciseaux standards de dissection, ciseaux, pinces à ressort courbes, deux Heidemann spatules et une cuillère.

Les données supplémentaires: une guillotine, une alèse, un hacheur de tissu McIlwain avec une lame de rasoir, un papier filtre, une pipette Pasteur en verre avec une tétine en caoutchouc, deux plastique Pasteur pipettes dont l'une avec une large ouverture, une boîte de Pétri, un cylindre métallique de 7 mm de diamètre (figure 2A).

  1. dans le plat rempli de dissection froide ACSF (préparé à l'étape 1), plonge un couvercle en verre réfrigéré d'un plat de coloration, enveloppé dans du papier filtre. Retirez délicatement les bulles d'air et oxygéner l'ACSF à travers un barboteur aquarium (figure 2A).
  2. Disposez les instruments dans l'ordre d'utilisation. Ajouter trois couches de papier filtre sur la plaque de découpage de tissu et d'une nouvelle lame de rasoir nettoyé avec de l'eau distillée et de l'éther (figure 2B). Lame de rasoir doit être horizontale lorsque la pile de papier. la force de la lame est ajustée à la moitié de la valeur maximale et la vitesse à environ un tiers de la valeur maximale.
  3. Vérifiez attentivement si tout est prêt (instruments, température ...) parce que vous n'aurez pas le temps par la suite.
  4. Demandez à quelqu'un de pulvériser la dissection avec une pipette Pasteur rempli avec ACSF froid.
  5. Anesthésier la souris avec IP Nembutal (100 mg / kg) avant la décapitation. anesthésie à l'halothane peut également être utilisé. Nous avons comparé les deux méthodes et bénéficier du droitminé mêmes résultats. Décapitation doit être réalisée sous anesthésie mais dislocation cervicale peut également être utilisé. Cependant dislocation cervicale a besoin d'une très bonne pratique pour éviter la souffrance animale.
  6. Disséquer le underpad aussi rapidement que possible sous ACSF douche froide continue.

4. Retrait du cerveau

  1. Tout en maintenant toujours la tête avec l'index et le pouce d'une main sur la bouche, faire une incision avec des ciseaux de dissection le long du milieu de la partie supérieure de la tête à partir du bord de la coupe guillotine et le fonctionnement rostralement à l'os frontal .
  2. Couper à travers le muscle cutané de chaque côté de la tête pour exposer pleinement les plaques de crâne et de supprimer les muscles sur le côté extrême de la tête.
  3. Avec des ciseaux de dissection, couper le muscle temporal de chaque côté, le long de la plaque temporal, puis couper les plaques frontales dans le milieu, transversalement. Ensuite, faire une petite coupure sur l'os occipital, entre les deux plAtes.
  4. Pour chaque face, coupée à la base caudale des plaques occipitaux.
  5. Coupez le long de la suture sagittale avec des ciseaux à ressort.
  6. Avec des pinces, retirer les moitiés de crâne en les étalant les uns des autres.
  7. Avec le scalpel, couper transversalement juste après le bulbe olfactif et juste avant le cervelet puis plonger le cerveau extrait dans le plat de dissection avec ACSF froid.

5. Dissection hippocampique

  1. Une fois que le cerveau est immergé dans le plat de dissection, séparer les deux demi-sphères de l'autre avec un scalpel insérée dans le milieu.
  2. La dissection de l'hippocampe est réalisée avec spatules sous contrôle visuel à travers un microscope opératoire binoculaire (X25, figure 2A). D'un hémisphère, écartez avec précaution les structures pour voir le ventricule latéral. Enlevez le tronc cérébral et le diencéphale. Cela se fait en appliquant le spatules sur le cortex frontal sur un côté et sur le diencéphale sur leautre côté. Prenez soin de ne pas toucher l'hippocampe avec les spatules et de ne pas l'étirer pendant la coupe du tissu.
  3. Sever le cul de sac puis poussez doucement l'hippocampe sur le cortex (rouler), en insérant une spatule dans le ventricule.
  4. Lorsque l'hippocampe est extraite, enlever les tissus de cortex excès et les vaisseaux sanguins restants.

6. Couper des tranches

  1. Avec un plastique bouche grande pipette Pasteur, transférer l'hippocampe dans une cuillère avec ses hausse de surface Alvear (côté convexe).
  2. Retirer l'excès de liquide avec une pipette Pasteur en plastique standard.
  3. Astuce jusqu'à la cuillère verticalement près de toucher le papier filtre du hacheur (figure 2B) et déposer l'hippocampe de la cuillère, en touchant rapidement le papier filtre puis reculer la cuillère.
  4. Orienter l'hippocampe et le découper transversalement à 400 um avec le hachoir (voir figure 2C pour l'orientation de l'hippocampepus par rapport à la lame de rasoir). Agir aussi rapidement que possible.
  5. Retirez le papier filtre avec l'hippocampe en tranches et l'enrouler autour du cylindre métallique de répartir les tranches un peu. Puis, libérez les tranches avec des pulvérisations de ACSF utilisant un standard en plastique pipette Pasteur et à leur rassemblement dans une boîte de Pétri remplie avec ACSF froid.

7. L'incubation des tranches d'interface

  1. Sélectionner tranches avec une pipette Pasteur plastique standard et placer rapidement dans la chambre d'enregistrement. Tranches remettre des traumatismes de dissection directement dans la chambre d'enregistrement, dans l'interface à 28 ° C.
  2. La tranche sera très probablement évier. Abaisser le niveau de liquide d'atteindre le niveau de tranche, puis porter à le faire flotter.
  3. Tourner la tranche dans la position correcte pendant l'abaissement du niveau. Les tranches sont toujours orientés de la même manière afin de faciliter le positionnement des électrodes (2 stimulant et une des électrodes d'enregistrement) dans la région CA1.
  4. Arrêtez-vous lorsquele fluide est en interface. Un "ménisque" du support autour de la tranche est indicatif d'un niveau suffisant de médias. Le filtre net doit être saturé de médias, mais pas complètement immergée.
  5. Gardez la chambre couverte de papiers filtre placé sur le couvercle perforé.
  6. Laisser reposer la tranche pendant au moins 1,5 heures à 28 ° C.

8. Enregistrement des réponses synaptiques

  1. Enregistrement d'électrode: capillaires en verre sont tirés d'obtenir une résistance à la pointe de 2-5 MQ lorsqu'il est rempli avec ACSF. Un petit morceau de papier filtre est placée autour de la pointe de l'électrode et de la cire d'os est appliquée à l'extrémité pour réduire la condensation. Électrodes de stimulation: platine-iridium électrodes de munitions bipolaires avec un diamètre de 12,5 um sont achetés auprès de FHC (USA). Avec des soins appropriés, chaque électrode peut être utilisé au moins 30 fois (figure 1B).
  2. Positionner les électrodes dans le stratum radiatum de la région CA1, toutes les électrodes alignéesvers le haut (figure 3A). Les électrodes sont abaissés de 75 à 150 um sous la surface de la tranche avec micromanipulateurs Narishige. Les deux électrodes de stimulation sont placées pour stimuler deux faisceaux distincts de Schaffer collatéraux. Lorsque les électrodes sont abaissées sur la tranche, papiers filtres sont soigneusement placées tout autour pour fermer la chambre.
  3. La stimulation biphasique (0,08 msec durée d'impulsion par demi-onde) est effectuée à une tension constante avec un stimulateur Grass connecté à des unités d'isolement UES-V. Réponse maximale est effectuée par augmentation de l'intensité de stimulation à partir de 2 V à 12 V. maximale EPSP de champ sont amplifiés 1000 fois avec un amplificateur WPI ISO-80 et filtrés à 10 Hz et 10 kHz. Le signal est ensuite envoyé à un PC via un convertisseur A / D Instrument National. Stimulation, l'acquisition et l'analyse des données sont effectuées en utilisant le programme WinLTP ( www.winltp.com ). EPSP de champ sont enregistrés à 40% de l'amplitude maximale obtenue à une entrée de départmettre courbe. Pour chaque tranche, les pentes fEPSP sont normalisées contre la pente moyenne sur les 30 min précédant LTP induction.
  4. LTP est déclenchée par l'application d'un seul train de stimulation (100 Hz) à la force d'essai sur une voie tandis que la seconde voie sert de témoin.

9. Le nettoyage de l'installation

  1. Rincer tout le circuit avec une solution à 3% de peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2) pendant au moins 10 min, puis égoutter. Le circuit sera soigneusement rincé à l'eau distillée avant de commencer toute expérience. L'utilisation de H 2 O 2 n'est pas absolument nécessaire que d'autres laboratoires utilisent uniquement de l'eau distillée pour le nettoyage, mais nous avons remarqué le dépôt de résidus noirs dans le système de tuyauterie en utilisant uniquement de l'eau.
  2. Remplacer l'eau dans le bain d'eau au-dessous de la chambre d'enregistrement.
  3. Bain stimulant les conseils des électrodes dans l'alcool pendant 5 min.

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Résultats

Cette méthodologie a été utilisée pour analyser les propriétés de potentialisation à long durable à long terme induite dans des coupes d'hippocampe aiguë de souris C57BL/6J adultes (JANVIER SAS, France) 14. Étonnamment, l'amélioration des conditions expérimentales a conduit à une nouvelle façon de regarder LTP. Nous avons montré que augmentation durable de la force synaptique n'exigeait pas la synthèse de nouvelles protéines.

Ici, nous montrons que l'induction de L...

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Discussion

Nous avons développé dans notre laboratoire un protocole résultant de la combinaison des méthodes développées et utilisées par d'autres laboratoires ayant une grande expertise dans la LTP enregistrements 11,17. Ce protocole est adapté à l'hippocampe de souris adulte et peut être utilisé chez les animaux de tout âge et de tout génotype de fond. Il permet également l'analyse de LTP dans des souris transgéniques développement des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer 18,19...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Nous remercions Bernard Foucart pour l'assistance technique. Ce travail a été financé par le Fonds belge de la recherche scientifique (FRS-FNRS) et par le Fonds Reine Elisabeth pour la recherche médicale. Agnès Villers est chercheur au Fonds de la Recherche Scientifique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactif/Matériel
NaClSigma - AldrichS7653
NaHCO3Sigma - AldrichS8875
KClSigma - AldrichP9333
D-glucoseSigma - AldrichG7528
NaH2PO4 Sigma - AldrichS9638
MgSO4 1MSigma - Aldrich63126
CaCl2Sigma - AldrichC4901
CarbogenAir Liquide (Belgique)
CapillairesWPI, Inc. (Royaume-Uni)TW150-4
Électrodes de stimulationFHC (USA)CE2B30
Outils chirurgicauxFST (Allemagne)
Papier filtre 84 g/m2SartoriusFT-3-105-110
MeshLycra15 den
GlueUHUplus endfest300
Instrument
AmplifierWPI, Inc. (UK)ISO-80
Interface chambre d’enregistrementFST (Allemagne)
Pompes péristaltiquesGilson (USA)Minipuls 3
Régulateurde température Université d’Edimbourgwww.etcsystem.com
Tissue ChopperMcllwain
StimulateursGrass (USA)S88X + SIU-V
Analyse du programmeWinLTPwww.winltp.com
MicromanipulateursNarishigeMM-3 et MMO-220A
Microscope chirurgicalLeica Microsystem
Convertisseur A/NNational InstrumentsNIPCI-6229 Série
M

Références

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