Examen de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaires cellules terminales trachéales par microscopie optique

Résumé

Ici, nous présentons une méthode pour l'analyse de microscopie optique des cellules trachéales terminaux en Drosophila Larves. Cette méthode permet d'examen rapide de la branche et de la morphologie de la lumière dans des animaux entiers et serait utile pour l'analyse des mutants individuels ou écrans pour les mutations affectant le développement des cellules terminal.

Résumé

la forme des cellules est essentiel pour la fonction cellulaire. Cependant, malgré l'importance de la morphologie des cellules, on en sait peu sur la façon dont les cellules individuelles génèrent des formes spécifiques. Cellules terminales trachéales drosophile sont devenus un modèle génétique puissant pour identifier et élucider les rôles des gènes nécessaires pour générer des morphologies cellulaires. des cellules de bornes sont un composant d'un réseau tubulaire ramifiée, le système trachéal qui fonctionne pour fournir de l'oxygène aux tissus internes. cellules terminales sont un excellent modèle pour étudier les questions de la forme des cellules car ils possèdent deux architectures cellulaires distincts. Tout d'abord, les cellules terminales ont une morphologie ramifiée complexe, semblable à des neurones complexes, deuxièmement, branches de cellules terminales sont formées comme des tubes minces et contiennent une lumière intracellulaire membranaire. L'analyse quantitative de nombre de succursales de la cellule terminale, l'organisation de la branche et la forme de la branche individuelle, peut être utilisé pour fournir des informations sur le rôle de mech génétique spécifiquenismes dans la fabrication d'une cellule ramifiée. L'analyse de la formation du tube dans ces cellules peuvent révéler des mécanismes conservées de tubulogenèse communs à d'autres réseaux tubulaires, tels que le système vasculaire vertébré. Nous décrivons ici les techniques qui peuvent être utilisés pour fixer rapidement, l'image et analyser à la fois les modèles de branchement et la formation de tubes dans les cellules de terminaux au sein de larves de drosophile. Ces techniques peuvent être utilisées pour analyser les cellules terminales chez les animaux de type sauvage et mutant, ou des mosaïques génétiques. En raison de la grande efficacité de ce protocole, il est également bien adapté pour les écrans de drogue dans le système trachéal Drosophila génétique, basées sur l'ARNi, ou.

Introduction

la forme des cellules est essentiel pour la fonction de cellules individuelles au sein d'un organisme, ainsi que des cellules qui fonctionnent comme une partie d'un tissu ou d'organe. Nous utilisons des cellules terminales trachée chez la drosophile, une composante du système respiratoire des insectes, pour étudier les mécanismes moléculaires qui participent à contrôler deux types conservées de la morphologie cellulaire: L'éclaircie et la formation du tube (lumenogenesis). cellules de terminaux sont situés à l'extrémité d'un réseau de tubes ramifiés qui sert à fournir de l'oxygène aux tissus internes ¹ et ont une morphologie ramifiée complexe qui dépend d'une voie de signalisation FGF qui est contrôlée par les niveaux d'oxygène dans les tissus locaux cibles ^2. branches de la cellule de terminaux sont des tubes minces, avec un gaz remplies de lumière sub-cellulaires fonctionnant par chaque branche. Les architectures cellulaires distincts de cellules terminales, ainsi que la facilité avec laquelle l'analyse génétique peut être réalisée chez la drosophile, font de ces cellules un excellent modèle fou mécanismes d'excroissance cellulaire enquête, la ramification et la formation du tube intracellulaire. cellules terminales sont avérés un modèle utile pour comprendre certaines des voies de signalisation conduisant à la différenciation cellulaire ramifiée, excroissance, et la maturation ^2-4. Grâce à ce système impartial, écrans avant génétiques pour mutants de morphogenèse cellulaires ont été réalisées, ce qui donne un aperçu des mécanismes de contrôle de la forme des cellules ^5,6. Par exemple, ces écrans ont révélé qu'un RabGAP spécifique est nécessaire pour la polarité du cytosquelette et le trafic vésiculaire dans la formation de lumière et de positionnement ^7; que l'adhésion médiée par l'intégrine est nécessaire pour la stabilité de la branche ^8, et que les protéines PAR-polarité épithéliale réguler le trafic membranaire polarisée requis à la fois pour la ramification et formation de lumière ^9. D'autres études dans des cellules de terminaux ont montré que l'accumulation d'actine asymétrique et l'organisation des microtubules est nécessaire à l'élongation cellulaire et lumenogenesis ^{10. Ainsi, la diversité des mécanismes biologiques, conservées par les cellules contribuent à la morphogenèse des cellules en phase terminale.}

Ici, nous décrivons une méthode pour fixer rapidement intact troisième stade larves de drosophile pour l'analyse des cellules ramification de terminal et formation de lumière. Ce protocole peut aussi être réalisée à la fois premier et deuxième animaux de stade. La clé de cette technique est la possibilité de visualiser les cellules terminales qui sont génétiquement marquées par l'expression de la protéine fluorescente directement à travers la cuticule des larves d'animaux intacts. Depuis que cette procédure ne nécessite pas de manipulations post-fixation, tels que la coloration d'anticorps, d'observer les cellules, il est bien adapté à l'analyse à haut débit, y compris le dépistage génétique ou de drogue. Expression de la protéine fluorescente révèle la structure des branches cytoplasme remplis. la formation du tube peut être contrôlée en parallèle en utilisant la microscopie à champ clair d'identifier la lumière remplie de gaz, ce qui contraste avec le fluide environnant-filltissus éd.

Inclus dans ce protocole est la méthode pour générer des mosaïques génétiques basés sur le système marcm ^11, pour produire des cellules mutantes homozygotes terminaux étiquetés avec des protéines fluorescentes dans les animaux autrement non étiquetés. Cela est nécessaire, car les cellules terminales seulement élaborer leurs structures complexes relativement tard dans le développement; mosaïques génétiques permettent de contournement des exigences de gènes dans d'autres tissus plus tôt dans le développement. . Pour générer des clones marcm, de la trachée sont étiquetés en utilisant le pilote spécifique à bout de souffle trachéal (BTL) ¹² décrit ici est le protocole pour le chromosome X chez la drosophile, car d'autres chromosomes, une procédure similaire peut être utilisée, avec des réactifs génétique approprié au chromosome étant examiné. Ici, la trachée sont marquées par l'expression d'une GFP localisée dans le cytoplasme, mais la procédure fonctionne aussi bien avec l'expression d'autres protéines fluorescentes, comme DsRed.

En outre, nous avons inclus une méthode pour quantifier les schémas de branchement et la formation de lumière dans les cellules terminales, basée sur des méthodes développées pour déterminer les caractéristiques de la branche neuronales ^13. Ce genre de données quantitatives peut être critique pour discerner le rôle exact de gènes dans le processus de branchement ou lumenogenesis, ainsi que de permettre des comparaisons directes entre les différents mutants ^9.

Protocole

1. Mosaic Generation

1. Génétique Croix
   w FRT ^19A bain: GAL80 FLP ¹²² / Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (mâles) X * FRT ^19A / Bal (femelles), où * représente le mutant à examiner. Note: Mettre en place traverser au moins un jour avant l'expérience, car cela permet aux animaux de s'accoupler de façon appropriée.
2. Pré-lay: croix de transfert des flacons voler alimentaires avec une petite tache de pâte de levure fraîche placé sur le support. Laisser poser pendant 1 heure à 25 ° C.
3. Lay: animaux de transfert de pré-mise flacon à un nouveau flacon avec une petite tache de pâte de levure fraîche. Laisser poser pendant 6 heures à 25 ° C.
4. adultes de transfert retour à pré-Lay flacon pour le stockage et l'utilisation dans des expériences ultérieures. Choc thermique immédiatement le flacon laïque contenant 0-6 h embryons pendant 45 min à 38 ° C, dans un bain d'eau en circulation. Remarque: La surface de l'aliment devrait être en dessous du niveau de l'eau pour vérifier tousembryons sont correctement choc thermique.
5. Incuber les flacons choc thermique à 25 ° C pendant 4-5 jours jusqu'à la troisième larves commencent à se promener.

2. Écran pour Mosaic Animaux

1. En utilisant des pinces fines ramasser doucement errance larves de troisième stade larvaire sur les côtés du flacon et placez-les dans réfrigéré 100% de glycérol dans une petite plaque en plastique.
2. Examiner les larves à l'aide d'un microscope grossissement dissection haut équipé d'optiques fluorescentes. Identifier les larves avec l'expression de la mosaïque de cellules trachéales marquées par fluorescence. Typiquement, cela peut être fait à 10 grossissement de 20x.

3. Fixation de la chaleur

1. En utilisant des pinces fines choisir soigneusement les animaux de mosaïque sur le plat et le placer dans une goutte de frais 100% de glycérol sur un mm verre blanc lame de microscope 75x25x1. Remarque: plusieurs animaux peuvent être placés dans la liste (figure 1A).
   Les animaux peuvent également être placés dans une goutte de glycérine directement sur une lamelle,mais il faut faire attention lors de la fixation (étape 3.2), que les animaux vont chauffer très rapidement et peuvent devenir trop fixe.
2. Placer la lame de verre sur 70 ° bloc thermique C jusqu'à ce que les animaux s'arrête pas bouger, pas plus de 20 secondes pour une diapositive, et 10 sec pour une lamelle (figure 1B). Les animaux se soustraire au départ, mais arrêter et devenir rigide et allongé une fois mort. Note: exposition trop longue à la chaleur peut endommager les branches terminales et lumières ainsi que de faire le signal GFP faible et diffus. Pour une efficacité optimale, il est recommandé d'avoir le bloc de chaleur dans la même pièce que les microscopes.
3. Utilisation de pinces fines soin d'orienter toutes les larves à la baisse dans une seule direction, de telle sorte que toutes les larves sur la lame sont orientées parallèlement les unes aux autres (figure 1C).
4. Placez délicatement une lamelle micro 18x18mm au-dessus de larves (ou inverser la lamelle sur une lame de verre) et éviter les bulles en forme (figure 1D). Note: lamelle ne peut trouver exactementplat sur les larves, ce n'est pas un problème.
5. Les larves de l'image dans 30 min. Cellules terminales fixes chaleur va se dégrader et le signal de GFP deviendront très diffuse.

4. L'imagerie in vivo de cellules terminales trachéales

1. Placer la lame sur la scène d'un microscope stéréoscopique composé. L'utilisation d'un objectif 5x localiser les deux troncs dorsaux parallèles qui courent d'avant en arrière sur la face dorsale de l'animal (figure 1F). Repérez les deux cellules terminales dorsales, directement entre les deux troncs dorsaux. Cela permet d'identifier le segment approprié pour l'analyse.
2. Une fois orienté, tournez les animaux Image cellules terminales désirées. Pour ce faire, poussez délicatement la lamelle sur le bord avec les forceps perpendiculaires à l'axe longitudinal de la larve, en roulant lentement les larves sous la lamelle (figures 1E et 1G).
3. Sélection des cellules terminales appropriées est essentiel pour des résultats constantset les comparaisons entre les mutants. Cellules terminales au Service de la graisse corporelle (FB) sont faciles à trouver à côté du tronc dorsal, latéral de la ligne médiane. Les cellules de la borne G du groupe latérales (LG) sont faciles à trouver et sont situés juste en dehors de la ligne médiane ventrale (figure 1H). Remarque: en (RT10) les segments les plus antérieures (Tr1) et postérieure la disposition de la cellule de terminal est divergente des autres segments. Nous n'analysons cellules terminales des segments TR2-Tr9. Cellules terminales dorsales ont un schéma de branchement plus stéréotypée que les autres cellules terminales trachéales. Cela peut dépendre de signaux autonomes supplémentaires, non-cellulaires, et cela devrait être considéré au moment de décider de les inclure dans l'analyse.
4. Une fois qu'une cellule terminale d'intérêt a été identifié, capturer une image en utilisant le grossissement souhaité, typiquement 10X ou 20X est meilleur (figure 2A). Note: en raison d'une ramification variables, essayer de capturer des images qui comprennent autant de branches et des conseils de succursales que possible.
5. Sans bouger la scène, éteindre la fluorescence et allumer la lumière transmise pour capturer une image en fond clair de la même cellule et le plan focal (figure 2B). La lumière sera visualisé comme sombre contrastant à l'intérieur de l'espace de cellule de terminal. Si la planification de quantifier les branches et les lumens des cellules terminales, de recueillir des images multiples dans plusieurs plans focaux de chaque cellule de terminal.

5. L'analyse et la quantification des terminal morphologie cellulaire en utilisant ImageJ

1. Ouvrez les images fluorescentes et brightfield utilisant le ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) plug-in NeuronJ ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
2. Utilisation de l'outil «tracés Ajouter", tracer manuellement les branches et la lumière de la cellule terminale entier.
3. Utilisation de l'outil «tracés d'étiquettes", renommer et recolor d'attribuer à chaque ligne dans la trace d'une désignation spécifique.
4. Utilisation de l'outil "Set paramètres", ajuster la largeur de la ligne 6 à 10 pixels (pour 512x512 images issues de la caméra numérique reliée au microscope composé. Pour les caméras de résolution supérieure ou inférieure, la largeur de pixel doit être réduite de façon appropriée), en utilisant tous d'autres paramètres par défaut et cliquez sur "OK". Ensuite, utilisez la fonction "Faire instantané» pour prendre une image. Choisissez «Dessine trace" pour obtenir un instantané de la trace qui peuvent être indiquées côte-à-côte avec l'original.
5. Sélectionnez l'outil «tracés de mesure» et sélectionnez le type de traçage (ie qui se ramifie à mesure fondée sur les désignations spécifiques assignées à l'étape 5.3). Ensuite, sélectionnez "Afficher les mesures de traçage" et "les mesures précédentes claires" puis cliquez sur "Exécuter". Ceci va produire une feuille de calcul qui contient le nom, l'étiquette, la longueur (en pixels) et d'autres données de l'image. Ces données peuvent ensuite être enregistrées dans un tableur Microsoft Excel pour plus de statistiquesanalyse.

Résultats

Les résultats sont présentés dans la figure 2. Un groupe latéral unique (LG) de la cellule terminale montre très étendue ramification subcellulaire (visualisé par la GFP; A) et rempli de gaz subcellulaires lumière traversant chacune des branches (visualisées par microscopie en fond clair, B). Ces images ont été recueillies à partir d'une mosaïque L3 larve, généré en utilisant le système de marcm décrit dans les sections 1 et 2, et de la chaleur fixes et imagés, tels que décrits dans les sections 3 e...

Discussion

La technique de fixation à la chaleur décrit ici est un outil rapide et pratique pour drosophile cellules terminales trachéales larvaires imagerie. Ici, nous utilisons cette technique pour examiner le branchement et le modèle lumen des cellules de type sauvage. Cellules trachéales exprimant la GFP, dirigé par le promoteur spécifique trachéale à bout de souffle, peuvent être facilement visualisées à travers la cuticule des larves après la fixation de la chaleur. Les schémas de branchement spécifiques de...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pince d’étudiant Dumont #5	Outils scientifiques fins	91150-20
Microscope de dissection Leica MZ16 (ou équivalent)	Microscope composé Leica	MZ16
AxioImager M1 (ou équivalent)	Carl Zeiss	équipé d’AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Jeu de filtres 38HE
Génotype			: w FRT19A tub : GAL80 FLP122 ; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A
Crosse			Génotype : y w FRT19A

100 % Glycérol BioExpress M152-4L