Ici, nous présentons une méthode pour l'analyse de microscopie optique des cellules trachéales terminaux en Drosophila Larves. Cette méthode permet d'examen rapide de la branche et de la morphologie de la lumière dans des animaux entiers et serait utile pour l'analyse des mutants individuels ou écrans pour les mutations affectant le développement des cellules terminal.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
la forme des cellules est essentiel pour la fonction cellulaire. Cependant, malgré l'importance de la morphologie des cellules, on en sait peu sur la façon dont les cellules individuelles génèrent des formes spécifiques. Cellules terminales trachéales drosophile sont devenus un modèle génétique puissant pour identifier et élucider les rôles des gènes nécessaires pour générer des morphologies cellulaires. des cellules de bornes sont un composant d'un réseau tubulaire ramifiée, le système trachéal qui fonctionne pour fournir de l'oxygène aux tissus internes. cellules terminales sont un excellent modèle pour étudier les questions de la forme des cellules car ils possèdent deux architectures cellulaires distincts. Tout d'abord, les cellules terminales ont une morphologie ramifiée complexe, semblable à des neurones complexes, deuxièmement, branches de cellules terminales sont formées comme des tubes minces et contiennent une lumière intracellulaire membranaire. L'analyse quantitative de nombre de succursales de la cellule terminale, l'organisation de la branche et la forme de la branche individuelle, peut être utilisé pour fournir des informations sur le rôle de mech génétique spécifiquenismes dans la fabrication d'une cellule ramifiée. L'analyse de la formation du tube dans ces cellules peuvent révéler des mécanismes conservées de tubulogenèse communs à d'autres réseaux tubulaires, tels que le système vasculaire vertébré. Nous décrivons ici les techniques qui peuvent être utilisés pour fixer rapidement, l'image et analyser à la fois les modèles de branchement et la formation de tubes dans les cellules de terminaux au sein de larves de drosophile. Ces techniques peuvent être utilisées pour analyser les cellules terminales chez les animaux de type sauvage et mutant, ou des mosaïques génétiques. En raison de la grande efficacité de ce protocole, il est également bien adapté pour les écrans de drogue dans le système trachéal Drosophila génétique, basées sur l'ARNi, ou.
Introduction
la forme des cellules est essentiel pour la fonction de cellules individuelles au sein d'un organisme, ainsi que des cellules qui fonctionnent comme une partie d'un tissu ou d'organe. Nous utilisons des cellules terminales trachée chez la drosophile, une composante du système respiratoire des insectes, pour étudier les mécanismes moléculaires qui participent à contrôler deux types conservées de la morphologie cellulaire: L'éclaircie et la formation du tube (lumenogenesis). cellules de terminaux sont situés à l'extrémité d'un réseau de tubes ramifiés qui sert à fournir de l'oxygène aux tissus internes 1 et ont une morpho....
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Protocole
1. Mosaic Generation
- Génétique Croix
w FRT 19A bain: GAL80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (mâles) X * FRT 19A / Bal (femelles), où * représente le mutant à examiner. Note: Mettre en place traverser au moins un jour avant l'expérience, car cela permet aux animaux de s'accoupler de façon appropriée. - Pré-lay: croix de transfert des flacons voler alimentaires avec une petite tache de pâte de levure fraîche placé sur le support. Laisser poser pendant 1 heure à 25 ° C.
- Lay: animaux de transfert de pré-mise flacon à un ....
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Résultats
Les résultats sont présentés dans la figure 2. Un groupe latéral unique (LG) de la cellule terminale montre très étendue ramification subcellulaire (visualisé par la GFP; A) et rempli de gaz subcellulaires lumière traversant chacune des branches (visualisées par microscopie en fond clair, B). Ces images ont été recueillies à partir d'une mosaïque L3 larve, généré en utilisant le système de marcm décrit dans les sections 1 et 2, et de la chaleur fixes et imagés, tels que décrits dans les sections 3 e.......
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Discussion
La technique de fixation à la chaleur décrit ici est un outil rapide et pratique pour drosophile cellules terminales trachéales larvaires imagerie. Ici, nous utilisons cette technique pour examiner le branchement et le modèle lumen des cellules de type sauvage. Cellules trachéales exprimant la GFP, dirigé par le promoteur spécifique trachéale à bout de souffle, peuvent être facilement visualisées à travers la cuticule des larves après la fixation de la chaleur. Les schémas de branchement spécifiques de.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier compétition.
Remerciements
Nous remercions Gillian Stanfield de commentaires sur le manuscrit. TAJ est soutenu par l'Université de l'Utah Genetics Training Grant T32-GM007464 de NIGMS NIH.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Pince d’étudiant Dumont #5 | Outils scientifiques fins | 91150-20 | |
| Microscope de dissection Leica MZ16 (ou équivalent) | Microscope composé Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 (ou équivalent) | Carl Zeiss | équipé d’AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Jeu de filtres 38HE | |
| Génotype | : w FRT19A tub : GAL80 FLP122 ; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Crosse | Génotype : y w FRT19A |
Références
- Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell.
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Réimpressions et autorisations
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