L'analyse par cytométrie de complémentation de fluorescence bimoléculaire fournit une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode peut être appliquée à des sites de liaison aux protéines de cartographie et de criblage de facteurs qui régulent l'interaction protéine-protéine.
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Article de méthode
L'analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine
Dans cet article
Résumé
Résumé
Parmi les méthodes d'étude des interactions protéine-protéine dans les cellules, complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) est relativement simple et sensible. BiFC est basée sur la production de fluorescence à l'aide de deux fragments non fluorescents d'une protéine fluorescente (Venus, une variante de la protéine fluorescente jaune, est utilisé ici). Venus fragments non fluorescents (VN et VC) sont fusionnés à deux protéines interagissant (dans ce cas, AKAP-Lbc et PDE4D3), ce qui donne fluorescence due à l'interaction VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 et la formation d'une protéine fluorescente fonctionnelle à l'intérieur des cellules.
BiFC fournit des informations sur la localisation subcellulaire des complexes de protéines et de la force des interactions de protéines sur la base de l'intensité de fluorescence. Cependant, l'analyse BiFC utilisant la microscopie à quantifier la force de l'interaction protéine-protéine est longue et quelque peu subjective en raison de l'hétérogénéité dans l'expression des protéines et de l'interaction. Par cytométrie de flux couplageanalyse à la méthodologie BiFC, le signal d'interaction protéine-protéine fluorescente BiFC peut être mesuré avec précision pour une grande quantité de cellules dans un court laps de temps. Ici, nous démontrons une application de cette méthodologie pour cartographier les régions en PDE4D3 qui sont nécessaires à l'interaction avec AKAP-Lbc. Cette méthode à haut débit peut être appliquée aux éléments de criblage qui régulent l'interaction protéine-protéine.
Introduction
650.000 interactions protéine-protéine sont estimés à exister dans le Interactome humaine, jouent des rôles cruciaux dans le maintien des fonctions normales 1,2 cellulaire. Outre co-immunoprécipitation (co-IP), l'étalon-or pour étudier l'interaction protéine-protéine de lysat cellulaire, plusieurs essais de complémentation de fragments de protéines (PCA) ont été développés pour améliorer la sensibilité dans la détection des interactions protéine-protéine dans les cellules 3. Les techniques comprennent Förster transfert de résonance de l'énergie (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), et complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) 4,5. BiFC est basé sur l'association facilité de deux fragments d'une protéine fluorescente (ici nous utilisons Vénus; une variante YFP) qui sont fusionnées chacune à un partenaire de protéine d'interaction potentielle (dans cet exemple, nous utilisons AKAP-Lbc et PDE4D3). L'interaction des deux protéines d'intérêt dans les cellules en résulte fluorescence fonctionnel, qui peut être visualisée par fmicroscopie luorescence en utilisant soit des cellules vivantes ou fixe 6,7,8. Comparé à d'autres ACI, BiFC est sensible et techniquement moins difficile, avec un potentiel d'étudier la localisation cellulaire dans les cellules vivantes. Un inconvénient majeur de cette technique est cependant que, une fois formé, le complexe protéine fluorescente peut pas être inversée. Par conséquent, il n'est pas une bonne méthode pour étudier l'interaction dynamique de la protéine-protéine. Dans cet article, nous utilisons BiFC pour cartographier les sites d'interaction de PDE4D3 avec AKAP-Lbc en contrôlant l'intensité de fluorescence de Vénus. Par rapport à l'analyse traditionnelle en utilisant la microscopie à fluorescence, qui prend beaucoup de temps et de main-d'œuvre (si elle n'est pas effectuée en utilisant des machines à haut débit automatisé), la cytométrie en flux permet une analyse quantitative simple de milliers de cellules dans une population hétérogène sur une courte période 9, 10. Ici, en effectuant une comparaison côte-à-côte de l'écoulement cytométrie-BiFC et co-IP traditionnel, nous démontrons que les deux mes méthodes fournissent des données comparables, toutefois, analyse des flux BiFC cytométrie prend moins de temps et utilise moins de matériaux qui peuvent être plus utiles lorsque les cellules d'intérêt sont limités.
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Protocole
1. La transfection cellulaire
- Cellules de la plaque le jour avant la transfection, le placage moins de cellules pour immunofluorescence.
- Pour immunofluorescence: dans un des lamelles de verre manteau plaque à 6 puits (1 par puits) avec 0,02% de gélatine à 37 ° C pendant au moins 4 heures, laver une fois avec le milieu, et pour chaque puits, la plaque 1 x 10 5 HEK 293T cellules dans 2 ml de milieu de croissance complet [media de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) plus 10% de FBS].
- Pour des analyses par transfert de cytométrie et de l'Ouest flux: plaque 1,2 x 10 5 cellules HEK 293T / puits dans 2 ml de milieu de croissance complet en plaque de 6 puits (0,3 x 10 5 cellules HEK 293T dans un milieu de croissance complet de 0,5 ml par puits dans une plaque de 24 puits ).
- Préparer l'ADN pour la transfection selon le protocole de fabrication: Effectene (Qiagen) est utilisé pour immunofluorescence. TransIT-LT1 (Mirus) est utilisé pour des analyses par transfert de cytométrie et de l'Ouest débit. Montant de l'ADN utilisé est répertorié ci-dessous.
Transfection en utilisant Effectene (6 puits):Plaque de 24 puits (ng) Plaque de 6 puits (ng) CFP-vecteur 10 50 VN N-AKAP-Lbc 200 1000 VC N-PDE4D3-FL (full-length PDE4D3) 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 100 VC N-PDE4D3-DUC1 (un fragment N-terminal PDE4D3 contenant le domaine DUC1) 100 VC N-PDE4D3-DUC 2 + CAT (un fragment C-terminal PDE4D3 contenant les domaines du Programme DUC 2 et catalytique) 100 - Ajouter la quantité indiquée d'ADN plasmidique + 4 pl activateur à 100 pi de tampon CE, mélanger et incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 5 ul Effectene, mélanger et incuber pendant 10 min àla température ambiante. Ajouter goutte à goutte aux cellules.
- Ajouter la quantité indiquée d'ADN plasmidique à 250 μl/50 ul d'Opti-MEM I milieu sans sérum dans un tube stérile.
- Ajouter transit LT1 réactif au mélange d'ADN dilué et la pipette doucement pour mélanger. (Transit-LT1 réactif: rapport de l'ADN est de 3 pi de transit LT1 réactif par 1 pg d'ADN).
- Incuber pendant 30 min à température ambiante et ajouter goutte à goutte aux cellules.
2. Préparation des cellules pour la cytométrie en flux, Western blot et immunofluorescence
- 24 h après la transfection, vérifiez fluorescence sous microscope à épifluorescence avant la récolte des cellules.
- La préparation des cellules pour l'analyse par cytométrie de flux:
- Laver les cellules avec 0,5 ml / 2 ml de PBS glacé pour les plaques 24-well/6-well.
- Détacher les cellules à l'aide de 50 μl/250 ul 0,05% de trypsine.
- Neutraliser la trypsine avec 200 pl / 1 ml du milieu DMEM.
- Collect 250 pi de cellules (à la fois pour plaque de 24 puits et 6 puits) par centrifugation à 500 g pendant 5 min, utilisent les cellules restantes (1 ml) pour analyse par Western blot.
- Reprendre les cellules dans 250 ul de tampon FACS [PBS + 0,5% (p / v) de BSA + 2 mM EDTA], un magasin sur la glace pour l'analyse par cytométrie de flux. Les cellules peuvent également être fixés en paraformaldéhyde à 1% (en PBS) si l'analyse de cytométrie de flux ne sera pas immédiate.
- La préparation des cellules pour l'analyse Western blot: menée en parallèle avec la préparation de la cellule d'analyse de cytométrie en flux.
- Laver les cellules 1x avec 2 ml de PBS glacé, lyse des cellules par addition de 100 pi de tampon de lyse cellulaire [tampon de 10 mM de phosphate de sodium, pH 6,95, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 5 mM EGTA, 1% de Triton X-100] .
- Recueillir lysat cellulaire par centrifugation pendant 10 min à 21000 g à 4 ° C.
- Quantifier la concentration de la protéine par dosage des protéines de Bradford, charger des quantités égales de protéines par voie de SDS-PAGE et transfert sur nitrocellulose pour immunoblot.
- La préparation des cellules pour immunofluorescence.
- Rincer les cellules 3x avec 2 ml de PBS, réparer les cellules dans 1 ml de 3,7% de paraformaldéhyde (dans PBS) pendant 10 min à température ambiante, puis laver 3x avec 2 ml de PBS pendant 5 min.
- Montez couvrir glissement sur une lame de verre, en utilisant un milieu de montage. Sceller les bords de la lamelle à l'aide de vernis à ongles si nécessaire.
- Stocker les lames à 4 ° C avant l'examen.
3. cytométrie de flux et immunofluorescence
- La cytométrie en flux est réalisée à l'aide d'un Beckman Coulter Cyan ADP, équipé de 488 nm, 405 nm et 642 nm lasers à semi-conducteurs. logiciel Summit est utilisé pour l'acquisition et l'analyse.
- Calibrer cytomètre de flux en utilisant des billes standard.
- Terrain diffusion vers l'avant (FSC) / latéral scatter (SSC) sur une échelle linéaire pour la population de cellules vivantes de déclenchement.
- Terrain FSC / tension largeur d'impulsion pour la population de cellules vivantes non agrégées déclenchement.
- Terrain count/FL6 (PCP fluorescence, 405 nm) sur une échelle logarithmique pour les cellules vivantes CFP-positifs non agrégées déclenchement.
- Terrain count/FL1 (YFP fluorescence, 488 nm) sur une échelle logarithmique pour l'intensité BiFC.
- Exécuter des échantillons YFP-CFP-Double Negative, ajuster FSC, SSC, FL1 et FL6 tube photomultiplicateur (PMT) de tension de fixer le seuil pour chaque signal.
- Exécuter positif unique (à la fois YFP + et + PCP) échantillons pour la rémunération future off-line
- Acquérir au moins 10.000 événements dépendants (+ cellules vivantes PCP non agrégées) pour analyse.
- Immunofluorescence est réalisée en utilisant un Zeiss LSM 510 microscope confocal. Remarque: il est important de garder tous les paramètres (comme le zoom, sténopé, gain du détecteur, amplificateur de décalage, la taille d'image, vitesse de balayage, balayage moyenne, et la puissance du laser) cohérente entre des échantillons de comparaison correcte de toutes les données.
4. Analyse des données (réalisées avec le logiciel Summit)
- Mettre en place le protocole d'analyse similaire à celle de acquisition avec déclenchement approprié:
Porte 1 à FSC / SSC en points pour les cellules vivantes.
Porte 2 au FSC / largeur d'impulsion de la porte 1 pour les cellules vivantes non agrégées.
Porte 3 de la numération / CFP de la porte 3 pour PCP non agrégées + cellules vivantes. - Compenser YFP et le signal YFP PCP en utilisant + et + PCP cellules positives simples.
- Lignes réexamen de coupure pour les cellules CFP / YFP-positif.
- Export YFP intensité moyenne de fluorescence (MFI) de PCP + cellules dans Excel pour les données de traçage.
- Normaliser YFP IMF à des niveaux d'expression de AKAP-Lbc, PDE4D3, et le chargement contrôle α-tubuline, tel que déterminé par Western blot.
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Résultats
AKAP-Lbc et PDE4D3 constructions (figure 1B) ont été fusionnées au VN et fragments de capital-risque, respectivement. Interaction des AKAP-Lbc et PDE4D3 résultats en fonction YFP fluorescence (figure 1A). Ici, nous utilisons la méthode BiFC pour cartographier les sites AKAP-Lbc contraignantes dans PDE4D3. Région en amont conservé 1 (DUC1), région en amont conservé 2 (DUC 2) et la région catalytique (CAT) sont conservées parmi PDE4 protéines de la famille, donc, pleine longueur (FL), DUC...
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Discussion
BiFC est un procédé simple et sensible pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode ne peut être utilisée pour identifier de nouvelles interactions protéine-protéine, cependant, il est particulièrement utile pour confirmer l'interaction protéine-protéine dans les cellules et d'étudier les propriétés fonctionnelles, telles que la localisation subcellulaire des complexes de protéines, la cartographie des sites d'interaction protéine-protéine, et pour le criblage de petites molécules / peptid...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Remerciements
Nous remercions le laboratoire O'Bryan à l'UIC pour l'évaluation expérimentale critique et à la discussion. Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association Grant 11SDG5230003 à GKC et National Center for Advancing Translational Sciences - Centre des sciences de l'UIC clinique et translationnelle Grant UL1TR000050.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| RÉACTIFS | |||
| Dulbecco’ ; s modifié Eagle’ ; s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Péniciline-Streptomycine (stylo/streptocoque), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anticorps anti-drapeau | Sigma | M2, F1804 | |
| Anticorps anti-HA | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α ;-tubuline | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anticorps anti-GFP | Clontech | 632569 | |
| Plaques de culture cellulaire, culture tissulaire à 6 puits traitée | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cellules | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep Kit de purification plasmidique, haute vitesse | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’ ; s Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS), stérile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsine-EDTA, 0,05 % (p/v) | Gibco | 25300 | |
| Tubes en polystyrène à fond rond pour coloration FACS | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldéhyde | Fisher Scientific | l’or | |
| Prolong avec DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Lames de microscope | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest verre de protection premium | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| >CO2 Incubateur à enveloppe | d’air NuAIR DH microscope | ||
| confocal LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Unité d’électrophorèse et de transfert | Biorad | ||
| Cyan ADP Cytomètre en flux | Beckman Coulter |
Références
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- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
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Réimpressions et autorisations
