L'analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine

Summary

L'analyse par cytométrie de complémentation de fluorescence bimoléculaire fournit une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode peut être appliquée à des sites de liaison aux protéines de cartographie et de criblage de facteurs qui régulent l'interaction protéine-protéine.

Abstract

Parmi les méthodes d'étude des interactions protéine-protéine dans les cellules, complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) est relativement simple et sensible. BiFC est basée sur la production de fluorescence à l'aide de deux fragments non fluorescents d'une protéine fluorescente (Venus, une variante de la protéine fluorescente jaune, est utilisé ici). Venus fragments non fluorescents (VN et VC) sont fusionnés à deux protéines interagissant (dans ce cas, AKAP-Lbc et PDE4D3), ce qui donne fluorescence due à l'interaction VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 et la formation d'une protéine fluorescente fonctionnelle à l'intérieur des cellules.

BiFC fournit des informations sur la localisation subcellulaire des complexes de protéines et de la force des interactions de protéines sur la base de l'intensité de fluorescence. Cependant, l'analyse BiFC utilisant la microscopie à quantifier la force de l'interaction protéine-protéine est longue et quelque peu subjective en raison de l'hétérogénéité dans l'expression des protéines et de l'interaction. Par cytométrie de flux couplageanalyse à la méthodologie BiFC, le signal d'interaction protéine-protéine fluorescente BiFC peut être mesuré avec précision pour une grande quantité de cellules dans un court laps de temps. Ici, nous démontrons une application de cette méthodologie pour cartographier les régions en PDE4D3 qui sont nécessaires à l'interaction avec AKAP-Lbc. Cette méthode à haut débit peut être appliquée aux éléments de criblage qui régulent l'interaction protéine-protéine.

Introduction

650.000 interactions protéine-protéine sont estimés à exister dans le Interactome humaine, jouent des rôles cruciaux dans le maintien des fonctions normales ^1,2 cellulaire. Outre co-immunoprécipitation (co-IP), l'étalon-or pour étudier l'interaction protéine-protéine de lysat cellulaire, plusieurs essais de complémentation de fragments de protéines (PCA) ont été développés pour améliorer la sensibilité dans la détection des interactions protéine-protéine dans les cellules ^3. Les techniques comprennent Förster transfert de résonance de l'énergie (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), et complémentation de fluorescen....

Protocol

1. La transfection cellulaire

1. Cellules de la plaque le jour avant la transfection, le placage moins de cellules pour immunofluorescence.
   1. Pour immunofluorescence: dans un des lamelles de verre manteau plaque à 6 puits (1 par puits) avec 0,02% de gélatine à 37 ° C pendant au moins 4 heures, laver une fois avec le milieu, et pour chaque puits, la plaque 1 x 10 ⁵ HEK 293T cellules dans 2 ml de milieu de croissance complet [media de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) plus 10% de FBS].
   2. Pour des analyses par transfert de cytométrie et de l'Ouest flux: plaque 1,2 x 10 ⁵ cellules HEK 293T / puits dans 2 ml de milieu de cr....

Results

AKAP-Lbc et PDE4D3 constructions (figure 1B) ont été fusionnées au VN et fragments de capital-risque, respectivement. Interaction des AKAP-Lbc et PDE4D3 résultats en fonction YFP fluorescence (figure 1A). Ici, nous utilisons la méthode BiFC pour cartographier les sites AKAP-Lbc contraignantes dans PDE4D3. Région en amont conservé 1 (DUC1), région en amont conservé 2 (DUC 2) et la région catalytique (CAT) sont conservées parmi PDE4 protéines de la famille, donc, pleine longueur (FL), DUC.......

Discussion

BiFC est un procédé simple et sensible pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode ne peut être utilisée pour identifier de nouvelles interactions protéine-protéine, cependant, il est particulièrement utile pour confirmer l'interaction protéine-protéine dans les cellules et d'étudier les propriétés fonctionnelles, telles que la localisation subcellulaire des complexes de protéines, la cartographie des sites d'interaction protéine-protéine, et pour le criblage de petites molécules / peptid.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RÉACTIFS
Dulbecco’ ; s modifié Eagle’ ; s media (DMEM)	Invitrogen	11965-092
Péniciline-Streptomycine (stylo/streptocoque), 100x	Invitrogen	15070-063
Sérum fœtal bovin (FBS)	Invitrogen	16000-044
Anticorps anti-drapeau	Sigma	M2, F1804
Anticorps anti-HA	Covance	16B12, MMS-101R
α ;-tubuline	Sigma	DM1A, T9026
Anticorps anti-GFP	Clontech	632569
Plaques de culture cellulaire, culture tissulaire à 6 puits traitée	Thermo Fisher Scientific	130184
HEK 293T cellules	ATCC	CRL-11268
Maxiprep Kit de purification plasmidique, haute vitesse	Qiagen	12663
Dulbecco’ ; s Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS), stérile 1x	Invitrogen	14190-144
Trypsine-EDTA, 0,05 % (p/v)	Gibco	25300
Tubes en polystyrène à fond rond pour coloration FACS	BD Biosciences	352052
Paraformaldéhyde	Fisher Scientific	l’or
Prolong avec DAPI	Invitrogen	P-36931
Superfrost plus Lames de microscope	Fisher Scientific	12-550-15
Fisherfinest verre de protection premium	Fisher Scientific	12-548-5P
EQUIPMENT
>CO2 Incubateur à enveloppe			d’air NuAIR DH microscope
confocal LSM510 META	Carl Zeiss, Inc
Unité d’électrophorèse et de transfert	Biorad
Cyan ADP Cytomètre en flux	Beckman Coulter