Article de méthode

Mesurer la croissance et Gene Expression Dynamique de tumeur ciblée S. Typhimurium Bacteria

DOI :

10.3791/50540

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6 juillet 2013

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1Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego , 3Biocircuits Institute, University of California, San Diego , 4Molecular Biology Section, Division of Biological Science, University of California, San Diego , 5Broad Institute of Harvard and MIT, 6Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 7Electrical Engineering and Computer Science and David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 8Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le but de ces expériences est de générer des données temps-parcours quantitatives sur la croissance et la dynamique de l'expression des gènes des atténué S. typhimurium Colonies bactériennes croissantes à l'intérieur des tumeurs. Cette vidéo couvre la préparation des cellules tumorales et l'implantation, la préparation de bactéries et d'injection, l'imagerie animal entier luminescence, excision de la tumeur, et le comptage de colonies bactériennes.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le but de ces expériences est de générer des données temps-parcours quantitatives sur la croissance et la dynamique de l'expression des gènes de S. atténué colonies bactériennes typhimurium croissance à l'intérieur des tumeurs.

Nous avons généré des modèles de xénogreffes de tumeurs chez la souris par injection sous-cutanée d'une lignée de cellules de cancer ovarien humain, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).

Nous avons transformé des souches atténuées de S. bactéries typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) avec une luciférase exprimée de façon constitutive (luxCDABE) plasmide pour la visualisation 2. Ces souches colonisent spécifiquement les tumeurs tout en restant essentiellement non virulente pour la souris 1.

Une fois les tumeurs mesurables ont été établis, les bactéries ont été injectés par voie intraveineuse via la veine queue avec dosage variable. La tumeur localisée, l'expression du gène bactérien a été suivie en temps réel au cours de 60 heures en utilisant undans le système d'imagerie in vivo (IVIS). A chaque instant, les tumeurs ont été excisés, homogénéisés, et étalées pour quantifier colonies bactériennes pour la corrélation avec les données d'expression génique.

Ensemble, ces données donne une mesure quantitative de la croissance in vivo et la dynamique de l'expression des gènes des bactéries qui se développent à l'intérieur des tumeurs.

Introduction

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La biologie synthétique a progressé rapidement au cours de la dernière décennie et est maintenant positionné à l'impact des problèmes importants dans l'énergie et la santé. Cependant, l'expansion dans le domaine clinique a été ralentie par des problèmes de sécurité et l'absence d'élaborer des critères de conception pour les circuits génétiques in vivo. Accélération des applications médicales à fort impact, il faudra utiliser des méthodes qui s'interfacent directement avec les infrastructures médicales, les circuits génétiques qui fonctionnent en dehors de l'environnement de laboratoire contrôlé, et les hôtes microbiens sûrs et cliniquement acceptée.

Un certain nombre de souches ont été étudiés pour le traitement du cancer en raison de leur capacité à se développer de manière préférentielle dans les tumeurs. Celles-ci ont inclus C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum et S. typhimurium 3-8. S. typhimurium a suscité un intérêt particulier car ils ont montré la sécurité et la tolérance dans un certain nombre d'essais cliniques humains 9-12. Ces bacteri un été initialement montré pour créer des effets anti-tumoraux par la stimulation du système immunitaire de l'hôte et de l'épuisement des nutriments nécessaires au métabolisme des cellules cancéreuses. La production de marchandises thérapeutique a été ajouté plus tard grâce à des modifications génétiques. Bien que ces études représentent des avancées importantes dans l'utilisation de bactéries pour les thérapies tumorales, la majorité des efforts actuels se sont appuyés sur l'expression de haut niveau qui se traduit généralement par la livraison des doses élevées, les effets hors-cible, et le développement de la résistance de l'hôte 13-16 .

Maintenant, la biologie synthétique peut ajouter la production de marchandises programmable en utilisant des circuits génétiques calcul conçues qui peuvent effectuer la détection et la livraison 17-20 avancés. Ces circuits peuvent être conçus pour agir en tant que systèmes de distribution qui détectent des stimuli spécifiques de la tumeur et l'auto-régulation de la production de marchandises que nécessaire. Cependant, l'étude de la fonction de ces circuits in vivo a été jusqu'ici difficile.

ve_content "> Depuis plasmides sont le cadre commun pour les circuits de synthèse, nous décrivons une méthode pour caractériser la dynamique de l'expression génique à base de plasmides in vivo utilisant un modèle de souris. Ces méthodes utilisent l'imagerie de luminescence time-lapse et la mesure quantitative de biodistribution. Ensemble, ces approches fournissent un cadre pour l'étude des réseaux à base de plasmide in vivo pour des applications cliniques.

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Protocole

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1. Préparation des cellules

  1. des lignées de cellules de passage en utilisant des techniques de culture cellulaire standard. Dans cette expérience, nous avons utilisé-8 OVCAR cellules (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Cultiver des cellules vers une cible confluence de 80 - 100%.
  2. Incuber les cellules avec 5 ml de trypsine pendant 5 min, puis ajoutez 5 ml de milieu RPMI + FBS pour inactiver la trypsine.
  3. Récolte des cellules et compter sur un hématimètre. Remettre en suspension dans phénol DMEM sans rouge à une concentration cible de 5 x 10 7 cellules / ml, soit environ 200 pi par flacon.
  4. Ajouter 15% réduit le facteur de croissance Matrigel (BD Biosciences) et maintenir la suspension de cellules sur la glace jusqu'à l'implantation.

2. Implantation de la tumeur

  1. Anesthésier femelles âgées de 4 semaines NCR / Nu souris en utilisant 3% d'isoflurane et attendre environ 5 min à assurer une anesthésie profonde. Appliquer une pommade pour vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie.
  2. Chargez les cellules (100 pi par la tumeur) dans une seringue de 1 ml et joindre un 27 1/ 2 aiguille de la jauge.
  3. Pour chacun des deux sites d'injection de flanc arrière bilatéraux, soulevez délicatement la peau avec des pinces pour faire une tente et injecter des cellules à la base. Veillez à ne pas pénétrer trop profondément, la production de sang. Utilisez des pinces pour enlever délicatement la seringue sans éclaboussures.
  4. Surveiller la croissance tumorale par jour pendant 10 à 20 jours, jusqu'à un diamètre tumoral de 2 - 4 mm est atteint.

3. Préparation des bactéries

  1. Démarrer une culture de nuit de bactéries dans 3 ml de LB + ampicilline médias à partir d'un -80 ° C stock congélateur ou une plaque réfrigérée. Dans cette expérience, nous avons utilisé S. typhimurium souche ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-).
  2. Dans la matinée, diluer le 1:100 culture en LB filtré et croître à DO600 0.4 - 0.6.
  3. Isoler et laver 3 fois dans un tampon phosphate salin (PBS) et remettre à une finale DO600 de 0,1 (environ 1 x 10 7 cellules / ml).

4. Les bactéries Injection

  1. Anesthésier l'animal d'uneposition D sur le côté avec la queue pointant vers votre main dominante. Appliquer une pommade pour vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie.
  2. Dilater la veine de la queue de l'eau chaude ou une lampe chauffante.
  3. Chargez les bactéries (100 pi par souris) dans une seringue de 1 ml et pliez la pointe un peu moins de 90 degrés.
  4. Aligner la pointe de la seringue avec la veine de la queue, pénétrer à une faible profondeur (il devrait se sentir aucune résistance), et injecter des bactéries. Observez le déplacement de flux sanguin pour une injection réussie.

5. Mouse Imaging

  1. Anesthésier les animaux dans la chambre d'admission puis placer chaque souris sur la plate-forme de formation d'image. Appliquer une pommade pour vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. Maintenir un positionnement précis pour obtenir des résultats quantitatifs entre les points dans le temps.
  2. animaux d'image en utilisant le système d'imagerie du spectre SIIV (Caliper Life Sciences). Si l'imagerie plus de 1 animal, un lieu barrières lumineuses entre eux pour prévenir cross-illumination. Les animaux doivent être visualisés sur le premier côté ventral pour confirmer la localisation de la bactérie.
  3. animaux Image dorsale utilisant SIIV toutes les 2 heures pendant toute la durée de l'expérience (36 heures). Générer un cours à temps pour un retour sur investissement donné.

6. Quantifier Biodistribution bactérienne

  1. Euthanasier les animaux à l'aide de CO 2 et le placer sur le dos sur une couche absorbante.
  2. Tourner l'animal afin d'exposer les deux tumeurs sous-cutanées de flanc arrière. Coupez le tissu de la peau environnante pour séparer et enlever les tumeurs. Tenir la tumeur avec des pincettes, enlever la peau en utilisant un mouvement de ciseaux inversé. Quand la majorité de la peau a été séparé, supprimer complètement la tumeur en utilisant des pinces.
  3. Placez les organes dans des microtubes pré-pesés. Comme la masse de ces tubes peut varier considérablement, il est important de pré-peser sur les résultats quantitatifs.

7. Quantifier Biodistribution bactérienne

  1. Pour chaque point de temps, d'accise et de peser les tumeurs.
  2. Ajouter 500 pi de PBS + 15% de glycérol et d'homogénéiser l'aide d'un tissu-Tearor (BioSpec). Rincer l'homogénéisateur 3 fois avec de l'éthanol entre les échantillons.
  3. Générer des dilutions en série et la plaque pour le comptage de colonies bactériennes. Pour plaque dilutions multiples sur une seule utilisation des plaques pré-sectionnés plaque.

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Résultats

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En utilisant ce protocole, nous sommes en mesure de produire des données sur la croissance in vivo et la dynamique de l'expression des gènes des bactéries ciblant les tumeurs. Le flux de travail global est résumé dans la figure 1.

Dans la première étape, on injecte les bactéries (en vert) et l'image de l'animal à l'aide SIIV pour mesurer l'expression du gène de luminescence (bleu) en tant que journaliste.

Puis, dans la deuxième étape, no...

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Discussion

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En utilisant cette procédure, nous sommes en mesure de générer des cours à temps pour la croissance et la dynamique de l'expression des gènes des bactéries colonisant les tumeurs. Bien que ces mesures sont régulièrement effectuées in vitro en culture batch ou dispositifs microfluidiques, ils sont beaucoup plus difficiles à réaliser in vivo.

Il ya plusieurs modifications qui peuvent être appliquées à ces méthodes. Alors que nous avons utilisé la lignée cellulaire OVCAR-8...

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Nous remercions H. Fleming pour la lecture et l'édition critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse postdoctorale Misrock (TD) et NDSEG bourse d'études supérieures (AP). SNB est un chercheur du HHMI.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue de 1 mlBD Biosciences309602
3/10 cc Seringue à insulineBD Biosciences309301
Aiguille PrecisionGlide BD Biosciences301629
RPMI Medium 1640 (1X), liquide, avec L-glutamineInvitrogen11875-119
AmpicillineSigma AldrichA0166-5G
LB Agar BouillonSigma AldrichL2897
Bouillon Luria-BertaniBD Biosciences244610

Références

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  1. Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
  2. Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
  3. Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
  4. Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
  5. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
  6. Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).
  7. Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
  8. Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
  9. Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
  11. Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
  12. Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
  13. Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
  14. Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
  15. Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).
  16. Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).
  17. Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
  18. Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  19. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  20. Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
  21. Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
  22. Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
  23. Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511(2013).
  24. Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  25. Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  26. Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).

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