Article de méthode

Différences Évaluation de la capacité concurrentielle de sperme dans Drosophila

DOI :

10.3791/50547

⸱

22 août 2013

 ,  , 
1Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Irvine

Dans cet article

Résumé

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Différentiel capacité concurrentielle des spermatozoïdes chez les Drosophila Mâles avec des génotypes distincts peuvent être vérifiées par des expériences double contact. Chacune de ces expériences implique l'un des hommes d'intérêts et un mâle de référence. Marqueurs facilement identifiables dans la descendance permettent d'inférence de la fraction d'individus engendrés par chaque mâle.

Résumé

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La concurrence entre les mâles conspécifiques pour féconder l'ovule est l'un des mécanismes de la sélection sexuelle, à savoir la sélection qui fonctionne sur la maximisation du nombre d'événements d'accouplement réussi plutôt que sur la survie et la viabilité maximisation 1. Compétition spermatique représente la compétition entre les mâles après accouplement avec la même femelle 2, dans lequel leur sperme sont une coïncidence dans le temps et l'espace. Ce phénomène a été rapporté dans plusieurs espèces de plantes et d'animaux 3. Par exemple, sauvage capturé D. melanogaster femelles contiennent généralement des spermatozoïdes 2-3 mâles 4. Les spermatozoïdes sont stockés dans des organes spécialisés ayant une capacité de stockage limitée, ce qui pourrait mener à la concurrence directe du sperme de différents hommes 2,5.

En comparant sperme compétitivité des mâles différents types d'intérêts (mâles expérimentaux) a été réalisée à travers contrôlée expérimentale double accouplementts dans le laboratoire 6,7. En bref, une seule femelle est exposé à deux mâles différents consécutivement, un mâle expérimental et un mâle de référence croisée accouplement. Le même schéma d'accouplement est suivie par d'autres types d'expérimentation, facilitant ainsi la comparaison indirecte de la capacité concurrentielle de leur sperme à travers une référence commune. La fraction d'individus engendrés par les expériences et les mâles référence est identifié en utilisant des marqueurs, qui permet d'estimer la capacité concurrentielle du sperme en utilisant des expressions mathématiques simples 7,8. En outre, la capacité concurrentielle sperme peut être estimée à deux scénarios différents selon que le mâle expérimentale est la deuxième ou la première à s'accoupler (infraction et le dosage de la défense, respectivement) 9, qui est supposé être le reflet de différents attributs de compétences.

Nous décrivons ici une approche qui permet d'interroger le rôle des différents facteurs génétiques qui sous-tendent putativement tIl phénomène de la capacité concurrentielle sperme dans D. melanogaster.

Introduction

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Depuis Geoff Parker a noté la prévalence de la compétition spermatique chez les insectes et ses implications évolutives 2, une vague d'études chez la drosophile et d'autres espèces ont tenté de faire la lumière sur ce phénomène à différents niveaux. Quelques exemples de domaines d'intérêt ont fait l'étude de sa variation dans les populations naturelles 9,10, son architecture génétique et la pertinence des facteurs sous-jacents génétiques 11-14, et son rôle dans la coévolution entre les sexes 15,16 conduite. Dans D. melanogaster femelles, la capacité limitée des organes de sperme stockage spécialisés, une paire de spermathèque et le réceptacle séminal 6,17, contribue à la compétition du sperme de mâles différents. Environ 1.500 spermatozoïdes sont transférés pendant l'accouplement pour la femelle, mais seulement ~ 500 peuvent être logés dans les organes mentionnés 18,19. Dans le laboratoire, contrôlée en double accouplement expériencements impliquant un mâle de référence et un ou plusieurs mâles d'intérêt ont été largement utilisés pour évaluer la capacité concurrentielle sperme 7,8.

Capacité concurrentielle sperme est estimée comme étant la proportion de la progéniture désirée par le mâle expérimental dans des expériences double accouplement sur ​​la descendance totale, c'est à dire à la fois le dispositif expérimental et les mâles de référence. Compétitivité sperme comprend deux composants, chacun d'entre eux évaluée dans un essai séparé. Dans le dosage d'infraction, la capacité du sperme mâle expérimental pour déplacer le sperme du premier mâle, soit le mâle de référence, est évaluée. Inversement, dans le dosage de la défense, la capacité du sperme mâle expérimental pour résister à un déplacement ou à réduire le taux de fécondation des spermatozoïdes de sexe masculin de référence est évalué. Selon le type de dosage, de la défense ou de délit, la capacité concurrentielle de sperme est estimé par les scores P 1 ou P 2, respectivement. P1 et P 2 ne peut prendre des valeurs entre 0 et 1. Les valeurs intermédiaires sont habituellement interprétées comme une preuve indirecte de sperme de mélange, ce qui suggère un scénario physiologique impliquant la compétition spermatique direct. Suivant le même raisonnement, les valeurs extrêmes peuvent être interprétées comme une preuve d'une forte capacité compétitive de sperme de différentiel. Les premières études ont montré que P 2 D. melanogaster est plus de 0,8 augmente à mesure que le temps écoulé entre les deux accouplements allonge 7. Ce même protocole expérimental a été utilisé dans d'autres espèces de drosophiles, P 2 étant la statistique communément utilisée dans les études pour évaluer sperme capacité concurrentielle 20. Pour la plupart des espèces, les 2 valeurs P des souches testées est supérieur à 0,6 21. Néanmoins, plusieurs autres mécanismes non liés à la concurrence directe entre le sperme des mâles différents peuvent donner des scores identiques (voir la discussion).

Dprogéniture istinguishing engendré par la première ou la deuxième mâles est possible grâce à l'utilisation de marqueurs facilement identifiables. Dans les premières études, l'un des hommes a été irradiées à des doses sublétales de, par exemple, les rayons X de telle sorte que pratiquement tous les ovules fécondés par le sperme irradié n'ont pas réussi à éclore 7. Par la suite, mutations altérant la pigmentation des yeux ou de la forme de l'aile ont été les marqueurs les plus couramment utilisés. Des exemples du premier sont les mutations pc (brun) 9, cn (cinabre) et 22 W (blanc) 23, tandis que les mutations CY (Curly) 24 correspond au deuxième type de phénotypes; certaines de ces mutations ont été combinés dans le même individu, par exemple cn pc. Dans une moindre mesure, allozymes 25 et microsatellites avec 26,27 modes de transmission connus ont également été utilisés.

Le dispositif expérimental pour tester les différences danscapacité concurrentielle sperme décrit ici suit essentiellement celle de Clark et al. 9. Résultats tirés de ces expériences donnent des informations uniquement sur la paternité différentielle des types masculins expérimentaux sous la loupe. Les analyses qui font également compte des différences post-fécondation in aptitude 14,28 et techniques de visualisation sperme 24 permettent des différences de 1 P (ou P 2) marque à être interprétées comme des différences dans les compétences de sperme.

La figure 1 présente la justification de l'infraction et les analyses de défense. Pour illustrer la logistique du processus, une expérience d'infraction réalisée en D. melanogaster 14 sera expliquée en détail. Ce test d'infraction particulière a été utilisée pour tester un effet mesurable de la famille chaîne intermédiaire dynein spécifique des spermatozoïdes multigénique (Sdic) sur la capacité concurrentielle sperme. Tous les membress de cette famille multigénique résident en tandem sur le chromosome X. mâles Knockout ont été générés par la suppression de la grappe Sdic. Parce que le segment supprimé comprenait également l'aile courte du gène essentiel (SW) et le but de l'étude était d'évaluer la pertinence de Sdic, les hommes portant la délétion Sdic-sw ont été secourus par une copie transgénique sw (symbolisé par P {sw} , qui a également réalisé un gène rapporteur mini-white) sur le chromosome 2. La couleur des yeux a été utilisée comme un marqueur visible pour l'identification de paternité. Tous les mouches étaient dans un fond blanc mutant à l'exception de ceux de la souche Oregon-R, qui ont été utilisés comme hommes de référence.

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Protocole

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Expériences à petite échelle doivent être effectuées afin de se familiariser avec la procédure.

1. Collecte femelles vierges et les mâles Naïve

La version la plus simple de l'expérience décrite se compose de quatre types de croisements initiaux, qui impliquent la combinaison suivante des adultes: A) W individus 1118 afin de recueillir des femelles vierges, b) Oregon-R individus afin de recueillir les mâles de référence naïfs, c ) P {sw} mâles homozygotes et les femelles vierges à partir d'une ligne de commande qui porte l'organisation de type sauvage de Sdic afin de recueillir les mâles expérimentaux naïfs (type I) et d) P {sw} Les mâles homozygotes et Sdic-sw-suppression porteurs femelles vierges afin de recueillir les mâles expérimentaux naïfs qui portent le déficit Sdic-sw (Type II).

  1. Mettre en place plusieurs flacons contenant 8-10 femelles et 5 mâles chacun. Laisser les femelles pondentœufs et de transférer les adultes à de nouveaux flacons tous les 3-5 jours. Utilisez des bouteilles plutôt que des flacons si nécessaire et utilisez toujours des aliments frais. Le nombre de flacons requis dépendra du nombre de types d'expérimentation, l'étude et le nombre d'individus estimés nécessaires pour détecter des différences (tableau 1). Plus de 10 femmes par flacon pourraient aboutir à la surpopulation cours de la croissance larvaire, ce qui peut entraîner une variation de la fertilité de la descendance. Conserver les flacons à 25 ° C dans une chambre à température contrôlée.
  2. Commencez à collecter des femelles vierges et les hommes naïfs, les jours 11 et 12 ème après la mise en place des croix initiales. Le délai d'attente varie selon la température; inférieure températures résultat dans le temps de développement plus retarder la collection d'individus. Un autre facteur affectant le calendrier de l'éclosion est le type de milieu. Aliments nutritifs, tel que le milieu de semoule de maïs levure 29, assure le bon développement de l'adultele système reproducteur, ce qui facilite l'accouplement. Recueillir désaccouplé vole tous les 4-6 heures. Lors de la collecte, anesthésier les mouches en introduisant CO 2 dans le flacon, appuyez sur les mouches vers le bas, et le sexe les sous loupe binoculaire (Figure 2). Placez les mouches souhaités dans différentes fioles selon le sexe et le phénotype et l'étiquette des flacons de façon appropriée.

Note 1. routine de collecte commence le matin en écartant les adultes qui ont émergé au cours de la nuit précédente. Recueillir femelles vierges et les hommes naïfs une ou deux fois pendant la journée. Typiquement, D. melanogaster mâles deviennent sexuellement matures 8 h après l'éclosion à 25 ° C 30. Si les mouches sont maintenus sous lumière / obscurité cycles h 12:12, deux pics d'éclosion sont attendus: au cours de l'1-2 premières heures après le feu est allumé, et au cours de la 2 h avant que le feu est éteint. Eclosion se produit dans les 24 heures après le s'assombrit chrysalide.

Note 2. Pas plus de 10 femelles should être mis dans le même flacon pour éviter la surpopulation. Cela limite également la perte de femelles dans le cas où ils doivent être jetés parce qu'au moins l'un d'eux n'est pas vierge.

Note 3. Afin de recueillir le nombre approprié de femelles vierges et les hommes naïfs dans un court laps de temps, les mesures suivantes peuvent être adoptées. Mettre en place des flacons de 15-20 w 1118 pour des expériences impliquant deux types de mâles expérimentaux (tableau 1). Saupoudrer la surface des médias et ajouter quelques granules de levure active séchées pour faciliter la ponte. Transfert des parents au moins 4 fois sur plusieurs jours consécutifs. Pour augmenter la surface disponible pour la nymphose dans chaque flacon, insérer du papier multi-plié (7 x 5 cm) au cours de la 4 e ou 5 e jour après que les parents sont transférés dans un autre flacon (Figure 3). Si le nombre d'adultes issus de la croix initiale ne suffit pas, attendre quelques jours de plus et de recueillir des individussal de flacons mis en place à des dates différentes. Prévoyez de réaliser les expériences sur plusieurs jours consécutifs pour égaliser la charge de travail.

2. Expériences Double-accouplement

La figure 4 montre les principales étapes impliquées dans des expériences double accouplement effectuées dans 14.

  1. Le matin du Jour 1, mis en place le premier accouplement. Les mâles Oregon-R sont les premiers à s'accoupler dans l'essai d'infraction.
    1. L'utilisation de l'aspirateur, mettre en place des flacons contenant 4 au 5 octobre, un jour w femelles vierges 1118 aux yeux blancs et 10 mâles naïfs Oregon-R aux yeux rouges chacun. Deux à trois flacons sont mis en place tous les jours pendant 5 jours consécutifs. Le nombre de flacons à mettre en place peut varier en fonction du nombre de personnes disponibles. Laisser les mouches s'accouplent pendant 2 heures.
    2. Jeter Oregon-R mâles et placer chaque femelle dans un nouveau flacon à l'aide d'un aspirateur (figure 5). identification du sexe peut être réalisé par une inspection visuelle de quelquesdifférences morphologiques (Figure 2). Étiqueter chaque flacon de façon appropriée et laisser la femelle dans la fiole pendant 2 jours (ci-après "v1").
  2. Au jour 3, mis en place le deuxième accouplement. Sélection d'hommes et de cross mis en place devrait être effectuée au hasard afin de minimiser tout risque de biais vers l'un des types masculins expérimentaux.
    1. Deux heures avant que le feu est éteint, transférer à nouveau la femelle dans un nouveau flacon avec un aspirateur. Étiqueter le nouveau flacon de façon appropriée (ci-après "v2").
    2. Présentez trois 5-6-jour vieux mâles expérimentaux du même génotype en v2.
    3. Répéter 2.2.1 et 2.2.2 pour chaque femelle.
    4. Le jour 4, deux heures juste avant la lumière est allumée (pas plus de 12 heures après la 2.2.1), jeter les mâles à l'aide de l'aspirateur.
  3. Au jour 6, transférer chaque femelle à nouveau dans un autre nouveau flacon. Etiqueter les nouveaux flacons de manière appropriée (ci-après «v3»).
  4. Le jour 10, jeter le 1118 w femelles.
  5. Examiner les descendances en v2 et v3. La première inspection est effectuée après 13-15 jours après que la femelle est introduit dans v2 (ou v3), par exemple le jour 17 après la première ponte a commencé féminin dans v2. La deuxième inspection est effectuée exactement au bout de 17 jours. Ce délai constitue une limite temporelle supérieure de sécurité qui garantit l'absence de deuxième génération dans le même flacon. Deux inspections prévenir la surpopulation, tout en facilitant le comptage des descendants.
    1. Le jour 17, inspecter v1 et s'assurer qu'il n'y progéniture yeux rouges présents, sinon marquer le flacon en conséquence. Présence de descendants aux yeux blancs indique que la femelle n'était pas vierge au moment de l'accouplement initial alors qu'aucune descendance indique que l'accouplement avec la référence ou les mâles expérimentaux n'ont pas eu lieu.
    2. Le jour 17, effectuer la première inspection de la v2. Anesthetize émergé progéniture en v2 avec le CO 2 et les trier par couleur des yeux et le sexe. numéros de descendance record engendrés par le premier et sechommes ond. Figure 6 montre les phénotypes attendus dans la descendance de chaque système d'accouplement. Dans cette expérience, notamment 14, seule la descendance femelle peut être affecté sans ambiguïté comme engendré par la référence ou les mâles expérimentaux et donc que l'information de filles peut être utilisé pour calculer P 2. Si d'autres marqueurs de la paternité de la progéniture mâle peut être affecté sans ambiguïté, le nombre de descendants des deux sexes peuvent être utilisés dans les calculs en aval. Jeter la descendance, mais garder v2 pour la deuxième inspection.
    3. Au jour 20, procédez comme en 2.5.2 avec la progéniture nouvellement apparues dans v2, puis jetez le flacon.
    4. Au jour 20, inspecter la descendance émergé en v3 pour la première fois et suivez l'étape 2.5.2.
    5. Le jour 23, procédez comme en 2.5.3 avec la progéniture nouvellement apparues dans la version 3.

Note 1: En raison de l'effet gonflant potentiel sur P scores que l'accouplement multiple pourrait avoir (2.2.2 et 2.2.3), l'accouplementpeut être limitée à un laps de temps particulier. Le délai dépendra de la fréquence remating associée avec le génotype des femelles et des mâles utilisés. La probabilité d'accouplement multiple est spécialement réduite pendant la nuit 11.

Note 2: Ne pas ajouter de pellets de levure vivantes, car cela pourrait causer des problèmes dus à la prolifération potentielle de la levure lorsque le nombre de mouches adultes est faible.

3. Analyse des données

  1. Compte de la descendance enregistrés devraient être organisées de manière appropriée pour une inspection visuelle facile et analyse efficace avec un progiciel statistique approprié (par exemple JMP de SAS Institute) ou des outils Web gratuits (par exemple http://vassarstats.net/ ).
  2. Capacité concurrentielle sperme. Ajouter chefs de v2 et v3. Les mouches femelles qui ont donné lieu à aucune ou très peu de descendants (par exemple <10), décédée au cours de la procédure, ou ont seulement réussi à l'inséminationted par l'un des deux hommes sont considérés comme non-informatif et sont exclus de toute analyse statistique aval (2.5.1 et tableau 2). Calculer la note 2 P pour chaque femelle informative.
  3. Vérifier s'il existe des différences statistiquement significatives dans les valeurs P 2 entre les hommes expérimentaux comparés. Cela peut être fait en utilisant paramétrique (HSD de Tukey par exemple) ou des tests non paramétriques (par exemple acier Dwass) en fonction de plusieurs facteurs, notamment l'asymétrie de la distribution des valeurs P 2 et la dépendance entre la variance et la moyenne. La transformation angulaire est couramment appliquée dans des proportions telles que P 2 avant l'utilisation de tests paramétriques 31.
  4. différences de taux de connexion (en option). Pour chaque type masculin expérimental, calculer le nombre de femelles fécondées doublement et ceux qui ne accouplé avec le premier homme (le mâle de référence dans l'essai d'infraction et le mâle expérimental dans le ddosage de efense). L'utilisation d'un test exact bilatéral de Fisher (disponible à http://www.langsrud.com/fisher.htm ), déterminer s'il existe des différences statistiquement significatives entre les deux types de mâles expérimentaux.
  5. Le sex-ratio (en option). Pour chaque mâle expérimental, à utiliser le test du chi-carré pour déterminer si le sex-ratio dans la descendance de chaque femelle s'écarte du rapport 1:1 attendu.

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Résultats

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Le tableau 2 résume quelques traits saillants de deux expériences d'infractions (essais 1 et 2) dans laquelle D. melanogaster mâles expérimentaux avec et sans (Type I et II, respectivement) un cluster Sdic fonctionnel sont comparées 14. Après prise en compte des incidences différentes rencontrées avec certaines répliques, 58-83% des femelles ont été trouvés à être informatif et donc les comptes de la paternité de leur progéniture pourraient être utilisées pour le calcul de P...

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Discussion

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Nous avons décrit le protocole expérimental pour évaluer les différences dans la contribution relative des organismes génétiquement distincte D. melanogaster mâles à la descendance dans des expériences contrôlées en double accouplement 7,8. Cela a été fait dans le cadre d'un facteur génétique hypothèse d'influer sur la capacité concurrentielle sperme et il a été illustré dans le dosage de l'infraction même si une procédure similaire s'applique à l'analyse de la défense (Fi...

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Les auteurs remercient NSF (MCB-1157876) pour le financement. Nous remercions également Alberto Civetta, John Roote, et deux arbitres anonymes pour leurs commentaires.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube en latex ambréVWR62996-4731/4 pouce ID, 1/6 pouce Wall
1 ml pointes de filtre XL graduéesUSA Scientific1126-7810N’importe quelle pointe de pipette de 1 ml peut être utilisée, mais les pointes semi-transparentes et longues sont meilleures comme récepteur de mouches. Si des pointes de filtre sont utilisées, sortez et jetez le filtre à l’aide d’une aiguille après avoir coupé l’extrémité de la pointe Parafilm
SigmaP-7793
Mesh FabricFin et lisse
StéréomicroscopeLeicaS6D
CO2 TankAirgasCD-50Utilisez FlyNap (Carolina Biological Supply Company) comme alternative si le CO2 n’est pas disponible
FlyStuff Clapet de pied, système completGenesee Scientific59-121CPas nécessaire si FlyNap est utilisé
Flacons en plastiqueGenesee Scientific32-109Livré avec des plateaux en carton qui peuvent être réutilisés pour contenir des flacons
Boules de cotonFisher ScientificAS-212
Levure sèche activeRed StarTrouvée en épicerie générale
MarqueursDifférentes couleurs peuvent être utilisées pour marquer différents génotypes
Sharpie

Références

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Mots-clés

Drosophila melanogasterExp rience de double accouplementEssai d attaque d fenseSuivi par marqueurs g n tiquesAnalyse de paternitvaluation de la coloration des yeuxCalcul du score P2Analyse de la puissance statistiqueTransformation angulaire

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