Article de méthode

Améliorer le taux de réussite de cristallisation de protéines par hasard Microseed Matrice dépistage

DOI :

10.3791/50548

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31 août 2013

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1School of Biochemistry, University of Bristol, 2Douglas Instruments

Dans cet article

Résumé

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Nous décrivons ici une méthode générale pour le dépistage aléatoire de la matrice de microseed. Cette technique est illustrée à augmenter de manière significative le taux de dépistage des expériences de cristallisation de protéines de succès, de réduire le besoin pour l'optimisation, et de fournir un approvisionnement fiable de cristaux pour la collecte des données et expériences ligand-trempage.

Résumé

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Aléatoire de dépistage de la matrice de microseed (RMM) est une technique de cristallisation de protéines dans lequel des cristaux de semences sont ajoutés aux écrans aléatoires. En augmentant la probabilité que les cristaux se développer dans la zone métastable du diagramme de phases d'une protéine, fils de cristallisation supplémentaires sont souvent obtenus, la qualité des cristaux obtenus peut être augmentée, et une bonne alimentation des cristaux pour les expériences de collecte de données et de trempage est fourni. Nous décrivons ici une méthode générale pour RMM qui peuvent être appliquées soit à goutte assis ou suspendus expériences de diffusion de vapeur à goutte, établis à la main ou à l'aide de la robotique de manipulation des liquides, dans 96 puits ou format de plateau de 24 puits.

Introduction

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De sa demande initiale par Perutz, Kendrew et collègues dans la détermination des structures de l'hémoglobine et la myoglobine, les haut débit pipelines modernes automatisés de la génomique structurale consortiums, macromoléculaire cristallographie aux rayons X nous a offert un aperçu structurel sans précédent dans le monde de la protéine . Cette technique reste le procédé le plus largement applicable expérimental qui permet la visualisation directe de la structure des protéines à atomique, ou à proximité de résolution atomique (c'est à dire dans la gamme de 1-3 Å). Une condition préalable à la diffraction des rayons X pour être appliqué à une protéi....

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Protocole

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Une. Considérations stratégiques

  1. Le choix des semences cristaux utilisés pour des expériences de microseeding variera en fonction de l'objectif de l'expérience. Au début d'un projet, il est utile de trouver plusieurs coups de cristallisation qui peuvent fournir des points de départ de rechange pour l'optimisation de cristal. RMM réduit considérablement la nécessité pour l'optimisation de cristal car les cristaux de bonne qualité sont plus susceptibles de se développer dans la zone métastable du diagramme de phase, c'est à dire dans la région où après la perturbation ou la nucléation le système revient à l'équilibre. Nou....

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Résultats

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(A) Exemple d'une expérience RMM

Pour démontrer l'efficacité du dépistage RMM nous avons appliqué cette méthode à la cristallisation de poule lysozyme d'oeuf blanc (HEWL) et foie de bovin catalase (BLC). Ces deux enzymes sont éminemment cristallisable et sont structurellement bien caractérisés des cibles 15, 16. En tant que tel à la fois de fournir d'excellents sujets d'essai avec qui pour illustrer le taux de réussite de cristallisation accrue réalisable avec RMM. expériences de cri.......

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Discussion

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Dans cet article, nous avons décrit une méthode générale pour RMM protéine dépistage de cristallisation. Nous avons démontré à l'aide de deux protéines de test un d'amélioration significative du taux de succès de la cristallisation en utilisant cette méthode. analyse de diffraction en utilisant le rayonnement synchrotron d'un sous-ensemble de cristaux générés en utilisant les RMM et les méthodes non-RMM a révélé peu de variation dans la qualité de diffraction entre les cristaux cultivés en utilisant soit la .......

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Déclarations de divulgation

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Nous n'avons rien à communiquer.

Remerciements

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Ce travail a été financé en partie par le BBSRC (BB/1006478/1). PRR est le récipiendaire d'une bourse de recherche de l'Université Royal Society.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plateaux de cristallisation à 96 puits MRCMolecular Dimensions LtdMD11-00-100Non compatible UV, pour les écrans établis par robot
Feuilles de scellement ClearViewMolecular Dimensions LtdMD6-01S
d’oeuf de poule lyzozymeSigma-AldrichL6876~95 % de pureté
Catylase de foie bovinSigma-AldrichC9322 Pureté de 95
XylanaseHampton ResearchHR7-104
Thaumatin de Thaumatococcus danielliiSigma-AldrichT7630
Thermolysine de Bacillus thermoproteolyticus rokkoSigma-AldrichP1512
JCSG-plus HT-96 CribleMolecular Dimensions LtdMD1-40Pour les cribles établis par robot
PACT premier HT-96 écranMolecular Dimensions LtdMD1-36Pour les écrans établis par le robot
Morpheus HT-96 écranMolecular Dimensions LtdMD1-47Pour les écrans établis par le robot
Crystal Ph– ; nix système de manipulation de liquidesArt Robbins Instruments602-0001-10
Kit de perles de grainesHampton ResearchHR2-320
Stéréomicroscope binoculaireLeicaM165C
Lames de scalpelSigma-AldrichS2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 &mu ; lpipette StarlabS7100-0125
ErgoOne 2-20 &mu ; l pipetteStarlabS7100-0221
ErgoOne 100-1000 &mu ; l pipetteStarlabS7100-1000
Crible JCSG-plusMolecular Dimensions LtdMD1-37Pour les tamis établis à la main
PACT premier screenMolecular Dimensions LtdMD1-29Pour les tamis établis à la main
Crible MorpheusMolecular Dimensions LtdMD1-46Pour les tamis établis à la main
Pince à épilerSigma-AldrichT5415-1EA
Lamelles CrystalClene 18 mmMolecular Dimensions LtdMD4-17
Pipettes Pasteur en verre de 2 mlSigma-AldrichZ722669
Mélangeur VortexFisher Scientific02-215-360
Plateau de cristallisation XRL 24 puitsMolecular Dimensions LimitedMD3-11Pour les dégrilleurs établis à la main
30 % (p/v) PEG 8000, 0,2 M sulfate d’ammonium, 0,1 M cacodylate de sodium pH 6,5
20 % (p/v) PEG 8000, 0,2 M acétate de magnésium, 0,1 M cacodylate de sodium pH 6,5
20 % (p/v) PEG 6000, 100 mM acide citrique pH 5,0
Blanc %

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , 2nd, (2009).
  2. Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
  3. Babnigg, G., Joachimiak, A.

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Mots-clés

Stock de graines de cristauxCriblage de cristallisationPr paration de cristaux semencesCriblages de cristallisation avec ensemencementR colte de cristauxM thode de diffusion de vapeurTaux de r ussite de la cristallisationQualit de la diffraction

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