Article de méthode

Localisation et quantification relative des nanotubes de carbone dans les cellules avec la cytométrie en flux d’imagerie multispectrale

5.9K vues

⸱

DOI :

10.3791/50566

⸱

12 décembre 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), CNRS/Université Paris Diderot, 2ImagoSeine BioImaging Core Facility, Institut Jacques Monod, CNRS/Université Paris Diderot, 3Laboratoire d'Immunopathologie et Chimie Thérapeutique, CNRS/Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Dans cette étude, l’objectif principal était de surveiller l’absorption cellulaire et l’exocytose éventuelle des nanotubes de carbone (NTC). Dans cette perspective, nous avons proposé ici une méthode unique utilisant la cytométrie en flux d’imagerie multispectrale permettant une quantification et une localisation des NTC dans un nombre statistiquement pertinent de cellules.

Résumé

Les nanomatériaux à base de carbone, comme les nanotubes de carbone (NTC), appartiennent à ce type de nanoparticules qui sont très difficiles à distinguer des structures cellulaires riches en carbone et, de facto, il n’existe toujours pas de méthode quantitative pour évaluer leur distribution au niveau des cellules et des tissus. Ce que nous proposons ici est une méthode innovante permettant la détection et la quantification des NTC dans les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux d’imagerie multispectrale (ImageStream, Amnis). Ce dispositif nouvellement développé intègre à la fois un haut débit de cellules et une imagerie haute résolution, fournissant ainsi des images pour chaque cellule directement en flux et donc une analyse d’image statistiquement pertinente. Chaque image cellulaire est acquise sur des canaux en fond clair (BF), en fond noir (DF) et fluorescents, donnant accès respectivement au niveau et à la distribution de l’absorption de la lumière, de la diffusion de la lumière et de la fluorescence pour chaque cellule. L’analyse consiste alors en une comparaison pixel par pixel de chaque image, des 7 000 à 10 000 cellules acquises pour chaque condition de l’expérience. La localisation et la quantification des NTC sont rendues possibles grâce à certaines propriétés intrinsèques particulières des NTC : forte absorbance et diffusion de la lumière ; en effet, les NTC apparaissent comme des taches sombres fortement absorbées sur BF et des taches lumineuses sur DF avec une colocalisation précise.

Cette méthodologie pourrait avoir un impact considérable sur les études sur les interactions entre les nanomatériaux et les cellules étant donné que ce protocole est applicable à une large gamme de nanomatériaux, dans la mesure où ils sont capables d’absorber (et/ou de diffuser) suffisamment fortement la lumière.

Introduction

Au cours des dernières décennies, la place des nanoparticules a gagné en importance dans un large éventail d’applications. En particulier, les nanotubes de carbone (NTC) sont de plus en plus explorés en tant que nanooutils pour diverses applications diagnostiques et thérapeutiques ; grâce à leurs propriétés électriques, thermiques et spectroscopiques particulières, les NTC peuvent servir de vecteurs pour divers médicaments ou agents de contraste, ou peuvent également être impliqués dans l’ingénierie tissulaire1.

Cependant, les inquiétudes concernant la toxicité potentielle de ces nanomatériaux font encore l’objet de débats, principalement parce que le sort des NTC dans l’organisme reste très controversé. Il y a en effet un manque de méthodes appropriées pour les détecter et les quantifier dans les cellules et les tissus vivants : par exemple, des techniques telles que la spectroscopie Raman, l’imagerie photoacoustique et l’imagerie par photoluminescence dans le proche infrarouge ont été suggérées, mais chaque méthode présente des limites en fonction du type de nanotubes et/ou de leur environnement2-8.

Ici, la méthode proposée pourrait être applicable pour la détection et la quantification des nanoparticules dans les cellules. Cela a été rendu possible grâce à l’utilisation d’ImageStream, un appareil combinant à la fois la cytométrie en flux et l’imagerie à haute résolution. Il combine les avantages de l’acquisition d’un grand nombre de cellules (jusqu’à 5000 événements/sec) - et les avantages de données statistiques et d’images haute résolution de chaque cellule en même temps (résolution spatiale de 0,5 μm). En général, les images sont collectées à l’aide d’une caméra CCD et constituent une représentation bidimensionnelle en niveaux de gris de la cellule. La lumière est quantifiée pour chaque pixel de l’image et identifie à la fois l’intensité et l’emplacement de la fluorescence ou des composants de taille subcellulaire (dans BF par exemple), permettant ainsi une puissante capacité à discriminer les cellules en fonction de leur apparence9,10.

L’objectif était ici de concevoir une méthode de nanométrologie qui permettrait une évaluation quantitative de la distribution et du comportement des NTC dans les cellules. En particulier, cette méthode a été développée pour étudier l’absorption cellulaire, le traitement et l’exocytose des NTC par les cellules. Nous avons d’abord mis en évidence le trafic cellulaire complexe des NTC et d’autre part le transfert de ces nanomatériaux entre les cellules : les NTC internalisés par les cellules s’échappent de leurs cellules hôtes lorsqu’ils sont stressés, se propagent dans l’espace extracellulaire et sont réinternalisés par des cellules naïves, qu’elles soient homotypiques ou hétérotypiques11

.

Des études antérieures ont montré que différents mécanismes d’absorption cellulaire, actifs ou passifs, pouvaient se produire en fonction de la fonctionnalisation des NTC et de l’étatd’agrégation 12. Ici, les NTC à parois multiples ont été fonctionnalisés par cycloaddition et amidation 1,3-dipolaires, puis dérivation avec une sonde fluorescente, fluorescence dans isothiocyanate (FITC). En microscopie électronique à transmission, ils semblent être internalisés par les cellules soit individuellement avec une localisation cytosolique, soit sous forme de faisceaux, principalement dans les compartiments endosomaux et lysosomales11. Sur ImageStream, les NTC groupés apparaissent avec une forte corrélation sous forme de taches sombres sur BF et de points lumineux sur DF, ce qui permet une distinction claire entre les cellules marquées CNT et les cellules témoins. En revanche, la distribution du signal fluorescent émis par le marqueur fluorescent fonctionnalisé avec les NTC n’était pas aussi bien colocalisée : en effet, probablement en raison d’un phénomène d’extinction, les taches fluorescentes vertes ne correspondent pas nécessairement aux taches sur BF et DF. Cela indique, d’une part, qu’une sonde fluorescente n’est pas obligatoire pour la détection des NTC avec l’ImageStream, et d’autre part - a fortiori - qu’elle n’est pas totalement représentative à la fois pour la quantification et la localisation des NTC.

En plus de donner une quantification statistique relative des nanoparticules, cette méthode fournit également des informations concernant la localisation des NTC dans les cellules, c’est-à-dire qu’elle discrimine, par exemple, les NTC à l’intérieur de la cellule par rapport à ceux qui sont liés à la membrane plasmique. La capacité de localiser les NTC sur les images cellulaires surmonte clairement les limites de l’analyse par cytométrie en fluxconventionnelle 13. Le procédé a été développé ici via la création de masques s’adaptant à des régions spécifiques de la cellule et sélectionnant également les points sombres correspondant aux NTC chargés.

D’une manière générale, cette méthode pourrait être appliquée à un large éventail d’expériences impliquant la nécessité d’une visualisation, ou d’une quantification, dans des cellules à condition que les nanoparticules utilisées soient capables d’absorber (et/ou de diffuser) fortement la lumière.

Protocole

1. Préparation des nanotubes de carbone dispersibles dans l’eau (NTC)

  1. Dispersez d’abord les NTC dans de l’eau de culture cellulaire, avant de les soniser pendant 20 min dans un sonicateur d’eau de bain à 20 °C. Si les NTC sont fonctionnalisés à l’aide d’une sonde fluorescente, protégez-les autant que possible de la lumière tout au long de l’expérience.

2. Marquage des cellules avec des NTC

  1. Cultivez des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) (par exemple) sur des plaques de 25 cm² dans un milieu DMEM, contenant 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline streptomycine.
  2. Préparer des solutions de NTC à des concentrations de 0, 10, 20 et 50 μg/ml dans un milieu complet et incuber les cellules à 37 °C pendant 20 heures ou à 4 °C pendant 20 heures (2 ml de suspension de NTC pour une plaque de 25 cm²).

3. Fixation cellulaire

  1. Retirez ensuite le milieu d’incubation, rincez les cellules avec du PBS, trypsinisez et remettez les cellules en suspension dans un milieu DMEM complet. Centrifugeuse pendant 5 min à 1 200 tr/min.
  2. Remplacer le milieu d’abord par du paraformaldéhyde 4 % pendant 1 h à 4 °C, puis par du PBS pour les conserver. Si nécessaire, les cellules peuvent être stockées à ce stade du processus à 4 °C pendant plusieurs jours jusqu’à l’analyse cytométrique.
  3. Chaque échantillon doit contenir environ 10à 6 cellules concentrées dans 50 μl de PBS. Suspendez-les correctement pour éviter les agrégats pendant l’analyse et filtrez-les à travers un colorant à mailles de 50 μm.
    Remarque : Chaque étape doit être effectuée très doucement pour préserver les cellules.

4. Acquisition d’ImageStream

Utilisez le cytomètre de flux d’imagerie multispectrale ImageStream pour acquérir des images de cellules.
Certains points sont à respecter :

  1. Sélectionnez un grossissement adapté (ici, un objectif 40X est utilisé).
  2. Si des fluorochromes sont utilisés :
    - Préparer un échantillon de contrôle sans fluorochrome.
    - Préparer des cellules avec un contrôle positif unicolore pour chaque fluorochrome utilisé dans
    à vos échantillons.
  3. Utilisez le laser 488 nm pour exciter le FITC et le canal 02 pour collecter l’émission de fluorescence (passe-bande 480-560 nm). De plus, utilisez également les canaux 01 et 06 pour le champ clair (BF) et le fond sombre (DF) respectivement.

5. Post-traitement - Logiciel d’analyse IDEAS (Version 4.0)

  1. Parmi tous les événements acquis, l'analyse doit d'abord être limitée à la population de cellules individuelles : utilisez un graphique à points biparamétriques représentant le « rapport d'aspect » (c'est-à-dire largeur/hauteur) par rapport à la « surface de cellule » (paramètres appliqués sur les cellules sur BF) (Figure 1). Les cellules uniques incluses dans la région d’intérêt avec une aire standard et un rapport d’aspect proche de 1 sont ensuite distinguées des événements multicellulaires (grande surface et petit rapport d’aspect) et des débris (zone extrêmement petite).
  2. Pour sélectionner des cellules dans le plan focalisé, utilisez un graphique à points biparamétrique adapté aux cellules marquées par des NTC très contrastés : tracez le « contraste » en fonction du « gradient RMS » (qui mesure la qualité de netteté d'une image) sur l'image BF - il permet d'exclure les cellules non focalisées présentant à la fois un faible gradient efficace et un faible contraste dans leurs images BF (Figure 1).
    1. Déterminez le paramètre qui fournit la meilleure séparation statistique entre les cellules étiquetées et non étiquetées à l’aide de la fonction « Trouver la meilleure caractéristique ». Dans notre étude, la caractéristique moyenne de l’objet pixel est le paramètre le plus approprié (Figure 2).
    2. Tracer un histogramme à l’aide de ce paramètre en fonction de la fréquence normalisée pour comparer la quantité de NTC-absorbés pour les concentrations testées (figure 3).
    3. Tracer le graphique biparamétrique 'objet pixel moyen sur BF' (Notation : Moyenne Pixel_Object (M01,Ch01,Serré)_Ch01) en fonction de 'intensité sur DF'(Intensity_MC_Ch06), afin d'étudier la corrélation entre ces deux paramètres (Figure 4).
  4. La quantification est également évaluée à l’aide de masques :
    1. Comme les NTC apparaissent comme des taches sombres fortement absorbantes sur BF, créez d’abord un masque de seuil qui leur convient précisément en sélectionnant une plage restreinte de pixels de faible intensité comprise entre 0 et 533 dans cette étude (Masque 1, notation : Intensité(M01, BF, 0-533)) (Figure 5). Le choix de l’intensité du seuil se fait sur les cellules marquées par rapport aux cellules de contrôle.
    2. Inversement, créez également un masque ajusté avec les pixels de haute intensité (150-4095 dans ce cas) du DF (Masque 2, notation : Intensité (M06, DF, 150-4095)) (Figure 6).
    3. Tracez un graphique à l’aide de l’aire du masque (1 ou 2 ; (notation : Area_Intensity(M01, BF, 0-533)pour le masque 1) : il fournira une quantification relative de l’internalisation des NTC à différentes concentrations (Figure 7).
    4. Vérifiez le degré de corrélation entre ces deux masques (grâce au tracé biparamétrique 'aire du masque 1' versus 'aire du masque 2') (Figure 7).
  5. Créez d’autres masques pour localiser les NTC dans les cellules :
    1. Un masque adapté à l’intérieur de la cellule : Erode(M01, 7) - correspondant au masque de la cellule entière (M01) (Figure 8), qui est encore érodé de 7 pixels (Figure 9).
    2. Un masque s’adaptant à la membrane uniquement à l’aide de l’équation booléenne : M01 et non Erode(M01,7) - masque de la cellule entière (M01) soustrait de l’intérieur (Erode(M01,7)) (Figure 10).
    3. Pour considérer les pixels sombres sur la membrane (correspondant aux NTC), créez alors le masque : Intensity(M01 et non Erode(M01, 7), BF, 0-533) (Figure 11).
    4. Visualisez les différents masques appliqués sur une collection de cellules pour vérifier leur pertinence (Figure 12) pour les cellules étiquetées et non étiquetées.
    5. Appliquez la zone de fonction sur le masque en sélectionnant les pixels noirs sur la membrane 'Area_Intensity(M01 et non Erode(M01, 7), BF, 0-533)' soi-disant zone noire. Il permettra la quantification des NTC sur la membrane.

      Pour distinguer enfin les NTC qui ont été internalisés de ceux qui ont été adsorbés uniquement sur la membrane, tracez la zone noire sur la membrane en fonction de la zone noire sur l'ensemble de la cellule (c'est-à-dire 'Intensité Area_ (M01 et non Erode(M01, 7), BF, 0-533' par rapport à 'Intensité Area_ (M01, BF, 0-533)').

      note: Le même type de procédure est appliqué avec le signal fluorescent FITC : comparez l’augmentation de l’intensité de la fluorescence FITC par rapport à la diminution du signal de pixel moyen sur le BF, ou la colocalisation entre les taches sombres sur le BF et l’intensité de la fluorescence FITC. Dans notre cas, ce type d’analyse n’est pas pertinent car le signal de fluorescence ne correspond pas correctement aux taches sombres sur BF d’une part et aux champs clairs sur DF d’autre part, montrant que les propriétés intrinsèques des NTC (absorbance et diffusion de la lumière) sont plus appropriées que le signal lié à la sonde de fluorescence.
  6. Une fois que tous les graphiques sont créés dans une seule condition expérimentale, créez un « modèle de rapport statistique », enregistrez le modèle en tant que fichier .ast et regroupez tous les fichiers de données.

Résultats

Un aperçu du principe du dispositif ImageStream est donné dans la Figure 1. Il produit plusieurs images haute résolution de chaque cellule en flux, incluant le champ clair (BF), le champ sombre (DF ou lumière latérale diffusée) et les canaux de fluorescence, comme illustré dans la Figure 2 avec trois cellules différentes marquées par des CNT. Les superpositions de ces canaux sont également présentées, illustrant au premier abord la corrélation.

Étant donné que toute l'analyse post-traitement repose sur l'imagerie cellulaire, la sélection des cellules au foyer est cruciale pour l'étude (Figure 3). En effet, la présence de nanotubes de carbone (CNT) induit des modifications à la fois du contraste et du gradient par rapport aux cellules non marquées : les cellules au foyer, ayant internalisé une quantité importante de CNT, ont tendance à présenter un faible gradient rms (paramètre habituellement utilisé seul pour discriminer les cellules au foyer versus hors foyer), mais également un contraste important, ce qui explique pourquoi un tracé biparamétrique est essentiel. Sur la Figure 3, on observe la discrimination entre les cellules hors foyer (zone jaune) versus les cellules au foyer (zone bleue).

Les CNT internalisés par les cellules sont clairement distinguables, en particulier en microscopie fond clair (BF), où ils apparaissent comme des points sombres fortement absorbants (voir l'effet de différentes concentrations de marquage, Figure 4). De plus, le signal moyen des pixels en BF a été analysé, permettant une quantification relative de l'absorption cellulaire : les graphiques de la Figure 5 montrent une augmentation significative en fonction de la concentration de marquage des CNT (résultats obtenus pour environ 7 000 cellules par condition expérimentale).

Deuxièmement, la quantification des CNT est également possible à l'aide de masques, appliqués soit sur une plage restreinte de pixels sombres du BF, soit sur les pixels de forte intensité du DF (voir exemples sur la Figure 6), correspondant aux taches résultant de la présence des CNT. Ainsi, le tracé de la surface de ces masques permet de mettre en évidence, ainsi que d'observer l'augmentation de l'absorption (illustré sur la Figure 7 avec la surface du masque sur BF, sélectionnant des pixels compris entre 0 et 533).

En outre, la corrélation entre les taches sur les images en champ clair (BF) et en champ sombre (DF) peut être évaluée en traçant l'intensité en DF en fonction du signal moyen des pixels sur BF (comme dans la Figure 8) (analyse indépendante du masque) ou la surface du masque sur BF (Masque 1) en fonction de la surface sur DF (Masque 2).

En ce qui concerne la procédure établie pour la localisation des nanotubes de carbone (CNT) à l'intérieur des cellules, la figure 9A présente les différents masques qui ont été créés. Notez que la robustesse des masques de localisation (basés sur l'érosion du masque cellulaire par défaut) doit être vérifiée visuellement sur un ensemble de cellules marquées et non marquées. Les mêmes masques sont utilisés pour tous les échantillons.

Le tracé de la surface totale des taches noires sur la membrane cellulaire par rapport à celle de l'ensemble de la cellule fournit un score d'internalisation pour les cellules incubées pendant 20 heures à 37 °C, comparé à une incubation de 2 heures à 4 °C (voir Figure 9B) ; cela indique que les nanotubes de carbone (CNTs) se trouvent principalement sur la membrane à 4 °C, tandis qu'à 37 °C, ils sont internalisés dans plus de 90 % des cellules.

Enfin, en ce qui concerne la fluorescence, ce paramètre n'a pas été utilisé comme indicateur pour la quantification des nanotubes de carbone en raison d'une corrélation trop faible entre les points fluorescents et les points en champ clair (et en champ sombre). En effet, la corrélation entre l'intensité de la FITC et la valeur moyenne des pixels en champ clair indique un coefficient de corrélation de Pearson de -0,2. Sur la Figure 10, deux cas sont illustrés, dans lesquels le signal de fluorescence correspond correctement ou non au point noir en champ clair.

Schéma du dispositif optique d'ImageStream : illustration du montage de cytométrie en flux avec excitation laser et détection.
Figure 1. Aperçu du fonctionnement général d'ImageStream. Le système d'imagerie multispectrale acquiert jusqu'à 12 images par cellule selon trois modes différents : champ clair, champ sombre et fluorescence. Le dispositif comprend 5 lasers d'excitation, dont les longueurs d'onde sont 405, 488, 560 et 658 nm. La lumière provenant des cellules circulant dans la cuve est collectée à l’aide d’objectifs différents (dans cette étude, l’objectif 40X a été utilisé) puis dirigée vers un élément de décomposition spectrale constitué d’un ensemble de filtres passe-haut disposés en réseau angulaire. La caméra CCD qui acquiert les images des cellules fonctionne selon une technique appelée intégration synchrone afin d’éviter les traînées d’image. Une profondeur de champ étendue (EDF) est possible.

Imagerie cellulaire, microscopie à fluorescence, marquage FITC, champ clair, champ sombre, échelle de 2 μm, analyse.
Figure 2. Galerie d'images de cellules marquées avec des nanotubes de carbone (50 μg/mL) capturées par ImageStream à travers différents canaux (champ clair (BF), champ sombre (DF), fluorescence (FITC) et leurs superpositions). Les nanotubes de carbone confinés dans les lysosomes intracellulaires apparaissent comme de grandes taches noires sur les images en champ clair. En revanche, ils forment des taches brillantes sur les images en champ sombre et en fluorescence.

Analyse d'images cellulaires ; diagrammes de dispersion du gradient RMS par rapport au contraste ; schéma avec données de morphologie cellulaire.
Figure 3. Sélection des cellules au point. Le diagramme de dispersion bivarié représentant la racine carrée moyenne (rms) du gradient en fonction du contraste sur les images en champ clair permet d'exclure les cellules floues. Ici, la zone jaune représente les cellules floues, tandis que les cellules au point sont représentées en bleu. Les cellules floues se caractérisent par un faible contraste et une faible valeur rms du gradient sur l'image en champ clair. En plus du gradient rms, la caractéristique de contraste est nécessaire pour discriminer les cellules au point après leur marquage avec des nanotubes de carbone (CNTs).

Réponse cellulaire à des concentrations croissantes ; image au microscope ; étude des changements de la morphologie cellulaire.
Figure 4. Absorption dépendante de la dose des nanotubes de carbone visualisée par ImageStream. Le nombre et la surface des taches noires sur les images en champ clair augmentent avec la dose de nanotubes de carbone lors de l'incubation avec les cellules (allant de 0 à 50 µg/ml). Remarquez que les cellules témoins sont dépourvues de taches noires.

Graphique de l'intensité moyenne des pixels à l'équilibre statique ; fréquence normalisée ; réponse dose-dépendante ; analyse des données.
Figure 5. Quantification relative de l'absorption des nanotubes de carbone (CNT) basée sur les images en champ clair. Les histogrammes de la caractéristique moyenne des pixels appliquée au masque « objet », représentant l'ensemble de la cellule, montrent clairement un comportement dépendant de la dose, pouvant être utilisé pour la quantification. La plage R9 englobe les cellules positives aux CNT.

Images en microscopie en champ clair et en champ sombre, analyse de l'intensité du masque, différenciation des structures cellulaires.
Figure 6. Création de masques sélectionnant les taches noires sur les images en champ clair (BF) et les taches brillantes sur les images en champ sombre (DF). Comme les nanotubes de carbone (CNT) apparaissent sous forme de taches sombres fortement absorbantes sur l'image en champ clair (BF), un masque seuil est créé pour sélectionner une plage restreinte de pixels ayant une faible intensité comprise entre 0 et 533 dans cette étude (Masque 1, notation : Intensity(M01, BF, 0-533)). Inversement, un masque correspondant aux pixels de forte intensité (150-4095 dans ce cas) sur l'image en champ sombre (DF) (Masque 2, notation : Intensity(M06, DF, 150-4095)) est utilisé pour sélectionner les taches brillantes sur l'image DF, correspondant aux zones de diffusion élevée.

Graphique de distribution de fréquence de l'intensité surfacique à différentes concentrations ; contrôle à 50 μg/mL.
Figure 7. L'absorption dose-dépendante des nanotubes de carbone est démontrée par la quantification de la surface des taches noires sur les images en champ clair. À l'aide d'un masque seuil (masque 1) appliqué sur le champ clair, la surface des taches noires peut être quantifiée pour chaque cellule, révélant une distribution dépendante de la dose.

Graphique de dispersion montrant l'analyse de l'intensité des pixels et de la surface des objets pour la comparaison de données d'images.
Figure 8. Les méthodes de quantification des nanotubes de carbone (CNT) basées sur les images en champ clair (absorption) et en champ sombre (diffusion) sont corrélées. À gauche, la moyenne des pixels sur l'image en champ clair versus l'intensité sur l'image en champ sombre, montrant une bonne corrélation pour les cellules marquées avec des CNT (50 µg/ml) (coefficient de corrélation de Pearson r = -0,68). À droite, la surface du masque ajusté aux taches sombres en champ clair versus la surface du masque ajusté aux taches brillantes en champ sombre pour les cellules marquées avec des CNT (50 µg/ml). Le coefficient de corrélation de Pearson est r = -0,83. Les valeurs de 7 000 cellules sont représentées.

Schéma d'analyse cellulaire avec effets de la température, graphiques de dispersion, évaluation de la surface membranaire dans différentes conditions.
Figure 9. Localisation des nanotubes de carbone (CNT) dans les cellules à l’aide de masques spécifiques. (A) Des masques sont créés pour correspondre à un emplacement particulier de la cellule, de gauche à droite : toute la cellule, uniquement la membrane, et l’intérieur de la cellule. Un autre masque permet de détecter les taches noires grâce à un seuil d’intensité (Mask 1, notation : Intensity(M01, BF, 0-533)). (B) L’évaluation de la localisation des CNT peut être obtenue en mesurant la surface des taches noires sur différentes régions cellulaires à l’aide des masques de localisation décrits en A. L’incubation avec les CNT (50 µg/ml) a été réalisée à 37 °C et à 4 °C afin d’inhiber la voie d’internalisation. Le graphique représentant la surface noire sur la membrane par rapport à la surface noire sur l’ensemble de la cellule montre une absorption dose-dépendante des CNT sur la membrane à 4 °C, tandis que l’internalisation complète des CNT est efficace à 37 °C.

Microscopie fluorescente, analyse cellulaire, coloration par FITC, superposition des images en champ clair et en fluorescence.
Figure 10. Colocalisation des points noirs induits par les nanotubes de carbone sur l'image en champ clair (BF) et des points fluorescents brillants sur l'image FITC. Les points fluorescents brillants ne sont pas toujours colocalisés avec les points noirs sur l'image en champ clair. Ils correspondent correctement pour les deux premières cellules affichées, mais pas pour les deux dernières cellules.

Discussion

1. Modification et dépannage

Dans cette étude, le premier objectif était d’évaluer la quantité et la localisation des NTC dans les cellules. La microscopie confocale aurait pu être a priori la méthode d’or pour évaluer la distribution intracellulaire des NTC fonctionnalisés avec le marqueur fluorescent FITC8,14. Cependant, le principal inconvénient est la limitation de l’imagerie unicellulaire et, par conséquent, le manque de données statistiquement pertinentes. L’ImageStream permet de travailler au-delà de ces obstacles : en effet, en criblant un grand nombre de cellules (5 000-10 000) en peu de temps (

Par rapport à la cytométrie en flux conventionnelle, l’avantage unique d’ImageStream est de fournir des images multispectrales de chaque cellule et une comparaison pixel par pixel de l’intensité du signal. Ainsi, ImageStream combine la puissance statistique de la cytométrie en flux à haut débit avec les avantages analytiques de l’imagerie confocale pour chaque cellule analysée. Elle est cruciale pour une quantification et une localisation relatives sans marquage des NTC dans les cellules.

2. Étapes cruciales du Protocole

L’étape critique consiste à choisir les paramètres les plus appropriés de chaque étude. Dans notre cas, la meilleure façon était de baser l’analyse sur les propriétés d’absorption et de diffusion des nanotubes : la bonne corrélation entre la localisation des taches sombres sur BF et les points lumineux sur DF soutient que la méthode développée est pertinente et fiable - et n’aurait peut-être pas été possible sans imagerie cellulaire.

3. Limites de la technique

Il convient de souligner que la visualisation des NTC dans les cellules n’a été possible que parce qu’elles ont tendance à s’accumuler dans les vésicules intracellulaires endosomales, puis à apparaître comme de forts points d’absorption et de diffusion. Sur la base de cette méthode, les nanotubes individuels ne devraient pas être détectés alors qu’ils pourraient éventuellement être détectés en fluorescence, ce qui constitue une limitation évidente. Deuxièmement, la quantification n'est pas « absolue » mais relative pour différentes concentrations de marquage et par rapport aux cellules témoins non marquées. Certaines caractéristiques quantitatives (pixel moyen, intensité, etc.) sont des paramètres absolus, tandis que d’autres dépendent du choix des masques (masque de seuil, masques de localisation).

4. Importance par rapport aux méthodes existantes

En ce qui concerne la fluorescence, l’analyse ImageStream met en évidence la faible colocalisation des clusters CNT entre le signal lumineux FITC et les taches sur les autres canaux. Par conséquent, il semble que la fluorescence n’était pas un indicateur fiable pour la quantification et la localisation des NTC. Néanmoins, en surmontant les limites de la cytométrie en flux conventionnelle, qui est principalement basée sur la quantification par fluorescence, le multispectral à haut débit ImageStream ouvre la voie à une quantification statistique sans marquage , tout en permettant la localisation des nanotubes de carbone à l’intérieur des cellules.

5. Applications futures

Cette méthode de nanométrologie statistique à haut débit pourrait être généralisée à tous les nanomatériaux, qui présentent une absorption et une diffusion élevées de la lumière lorsqu’ils interagissent avec les cellules. Par conséquent, il peut avoir des applications importantes pour l’étude de la nano-bio-interface, de la nanotoxicologie et de la nanomédecine.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’ANR P2N (Nanother project 2010-NANO-008-04), par la Région Ile de France (contrat n° E539), et par le CNRS. L’Open Access a été financé par EMD Millipore.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ImageStreamfigure-materials-1 Amnis

Références

  1. Kostarelos, K., Bianco, A., Prato, M. Promises, facts and challenges for carbon nanotubes in imaging and therapeutics. Nat. Nano. 4, 627-633 (2009).
  2. De La Zerda, A., et al. Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice. Nat. Nano. 3, 557-562 (2008).
  3. Zavaleta, C., et al. Noninvasive Raman Spectroscopy in Living Mice for Evaluation of Tumor Targeting with Carbon Nanotubes. Nano Lett. 8, 2800-2805 (2008).
  4. Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nat. Nano. 7, 56-61 (2012).
  5. Welsher, K., et al. A route to brightly fluorescent carbon nanotubes for near-infrared imaging in mice. Nat. Nano. 4, 773-780 (2009).
  6. Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size dependent cellular uptake and expusion of single-wall carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. ACS Nano. 3, 149-158 (2009).
  7. Al-Jamal, K. T., et al. Cellular uptake mechanisms of functionalised multi-walled carbon nanotubes by 3D electron tomography imaging. Nanoscale. 3, 2627-2635 (2011).
  8. Reuel, N. F., Dupont, A., Thouvenin, O., Lamb, D. C., Strano, M. S. Three-Dimensional Tracking of Carbon Nanotubes within Living Cells. ACS Nano. 6, 5420-5428 (2012).
  9. Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., et al. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884(2012).
  10. Qian, F., Montgomery, R. R. Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood. J. Vis. Exp. (62), e3741(2012).
  11. Marangon, I., et al. Intercellular Carbon Nanotube Translocation Assessed by Flow Cytometry Imaging. Nano Lett. 12, 4830-4837 (2012).
  12. Lacerda, L., et al. Translocation mechanisms of chemically functionalised carbon nanotubes across plasma membranes. Biomaterials. 33, 3334-3343 (2012).
  13. Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Methods in Molecular Biology. Balasubramanian, K., Burghard, M. 625, Humana Press. 123-124 (2010).
  14. Zhou, F., et al. New Insights of Transmembranal Mechanism and Subcellular Localization of Noncovalently Modified Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Lett. 10, 1677-1681 (2010).

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Imagerie en champ clairimagerie en champ sombremarquage fluorescentanalyse pixel par pixelquantification de l'absorption cellulairedétection de nanomatériauxcytomètre ImageStreamévaluation de la nanotoxicologie
Localisation et quantification relative des nanotubes de carbone dans les cellules avec la cytométrie en flux d’imagerie multispectrale
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.