Localisation et quantification relative des nanotubes de carbone dans les cellules avec la cytométrie en flux d’imagerie multispectrale

Résumé

Dans cette étude, l’objectif principal était de surveiller l’absorption cellulaire et l’exocytose éventuelle des nanotubes de carbone (NTC). Dans cette perspective, nous avons proposé ici une méthode unique utilisant la cytométrie en flux d’imagerie multispectrale permettant une quantification et une localisation des NTC dans un nombre statistiquement pertinent de cellules.

Résumé

Les nanomatériaux à base de carbone, comme les nanotubes de carbone (NTC), appartiennent à ce type de nanoparticules qui sont très difficiles à distinguer des structures cellulaires riches en carbone et, de facto, il n’existe toujours pas de méthode quantitative pour évaluer leur distribution au niveau des cellules et des tissus. Ce que nous proposons ici est une méthode innovante permettant la détection et la quantification des NTC dans les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux d’imagerie multispectrale (ImageStream, Amnis). Ce dispositif nouvellement développé intègre à la fois un haut débit de cellules et une imagerie haute résolution, fournissant ainsi des images pour chaque cellule directement en flux et donc une analyse d’image statistiquement pertinente. Chaque image cellulaire est acquise sur des canaux en fond clair (BF), en fond noir (DF) et fluorescents, donnant accès respectivement au niveau et à la distribution de l’absorption de la lumière, de la diffusion de la lumière et de la fluorescence pour chaque cellule. L’analyse consiste alors en une comparaison pixel par pixel de chaque image, des 7 000 à 10 000 cellules acquises pour chaque condition de l’expérience. La localisation et la quantification des NTC sont rendues possibles grâce à certaines propriétés intrinsèques particulières des NTC : forte absorbance et diffusion de la lumière ; en effet, les NTC apparaissent comme des taches sombres fortement absorbées sur BF et des taches lumineuses sur DF avec une colocalisation précise.

Cette méthodologie pourrait avoir un impact considérable sur les études sur les interactions entre les nanomatériaux et les cellules étant donné que ce protocole est applicable à une large gamme de nanomatériaux, dans la mesure où ils sont capables d’absorber (et/ou de diffuser) suffisamment fortement la lumière.

Introduction

Au cours des dernières décennies, la place des nanoparticules a gagné en importance dans un large éventail d’applications. En particulier, les nanotubes de carbone (NTC) sont de plus en plus explorés en tant que nanooutils pour diverses applications diagnostiques et thérapeutiques ; grâce à leurs propriétés électriques, thermiques et spectroscopiques particulières, les NTC peuvent servir de vecteurs pour divers médicaments ou agents de contraste, ou peuvent également être impliqués dans l’ingénierie tissulaire¹.

Cependant, les inquiétudes concernant la toxicité potentielle de ces nanomatériaux font encore l’objet de débats, principalement parce que le sort des NTC dans l’organisme reste très controversé. Il y a en effet un manque de méthodes appropriées pour les détecter et les quantifier dans les cellules et les tissus vivants : par exemple, des techniques telles que la spectroscopie Raman, l’imagerie photoacoustique et l’imagerie par photoluminescence dans le proche infrarouge ont été suggérées, mais chaque méthode présente des limites en fonction du type de nanotubes et/ou de leur environnement^2-8.

Ici, la méthode proposée pourrait être applicable pour la détection et la quantification des nanoparticules dans les cellules. Cela a été rendu possible grâce à l’utilisation d’ImageStream, un appareil combinant à la fois la cytométrie en flux et l’imagerie à haute résolution. Il combine les avantages de l’acquisition d’un grand nombre de cellules (jusqu’à 5000 événements/sec) - et les avantages de données statistiques et d’images haute résolution de chaque cellule en même temps (résolution spatiale de 0,5 μm). En général, les images sont collectées à l’aide d’une caméra CCD et constituent une représentation bidimensionnelle en niveaux de gris de la cellule. La lumière est quantifiée pour chaque pixel de l’image et identifie à la fois l’intensité et l’emplacement de la fluorescence ou des composants de taille subcellulaire (dans BF par exemple), permettant ainsi une puissante capacité à discriminer les cellules en fonction de leur apparence^9,10.

L’objectif était ici de concevoir une méthode de nanométrologie qui permettrait une évaluation quantitative de la distribution et du comportement des NTC dans les cellules. En particulier, cette méthode a été développée pour étudier l’absorption cellulaire, le traitement et l’exocytose des NTC par les cellules. Nous avons d’abord mis en évidence le trafic cellulaire complexe des NTC et d’autre part le transfert de ces nanomatériaux entre les cellules : les NTC internalisés par les cellules s’échappent de leurs cellules hôtes lorsqu’ils sont stressés, se propagent dans l’espace extracellulaire et sont réinternalisés par des cellules naïves, qu’elles soient homotypiques ou hétérotypiques¹¹

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Des études antérieures ont montré que différents mécanismes d’absorption cellulaire, actifs ou passifs, pouvaient se produire en fonction de la fonctionnalisation des NTC et de l’état^{d’agrégation 12}. Ici, les NTC à parois multiples ont été fonctionnalisés par cycloaddition et amidation 1,3-dipolaires, puis dérivation avec une sonde fluorescente, fluorescence dans isothiocyanate (FITC). En microscopie électronique à transmission, ils semblent être internalisés par les cellules soit individuellement avec une localisation cytosolique, soit sous forme de faisceaux, principalement dans les compartiments endosomaux et lysosomales¹¹. Sur ImageStream, les NTC groupés apparaissent avec une forte corrélation sous forme de taches sombres sur BF et de points lumineux sur DF, ce qui permet une distinction claire entre les cellules marquées CNT et les cellules témoins. En revanche, la distribution du signal fluorescent émis par le marqueur fluorescent fonctionnalisé avec les NTC n’était pas aussi bien colocalisée : en effet, probablement en raison d’un phénomène d’extinction, les taches fluorescentes vertes ne correspondent pas nécessairement aux taches sur BF et DF. Cela indique, d’une part, qu’une sonde fluorescente n’est pas obligatoire pour la détection des NTC avec l’ImageStream, et d’autre part - a fortiori - qu’elle n’est pas totalement représentative à la fois pour la quantification et la localisation des NTC.

En plus de donner une quantification statistique relative des nanoparticules, cette méthode fournit également des informations concernant la localisation des NTC dans les cellules, c’est-à-dire qu’elle discrimine, par exemple, les NTC à l’intérieur de la cellule par rapport à ceux qui sont liés à la membrane plasmique. La capacité de localiser les NTC sur les images cellulaires surmonte clairement les limites de l’analyse par cytométrie en flux^{conventionnelle 13}. Le procédé a été développé ici via la création de masques s’adaptant à des régions spécifiques de la cellule et sélectionnant également les points sombres correspondant aux NTC chargés.

D’une manière générale, cette méthode pourrait être appliquée à un large éventail d’expériences impliquant la nécessité d’une visualisation, ou d’une quantification, dans des cellules à condition que les nanoparticules utilisées soient capables d’absorber (et/ou de diffuser) fortement la lumière.

Protocole

1. Préparation des nanotubes de carbone dispersibles dans l’eau (NTC)

1. Dispersez d’abord les NTC dans de l’eau de culture cellulaire, avant de les soniser pendant 20 min dans un sonicateur d’eau de bain à 20 °C. Si les NTC sont fonctionnalisés à l’aide d’une sonde fluorescente, protégez-les autant que possible de la lumière tout au long de l’expérience.

2. Marquage des cellules avec des NTC

1. Cultivez des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) (par exemple) sur des plaques de 25 cm² dans un milieu DMEM, contenant 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline streptomycine.
2. Préparer des solutions de NTC à des concentrations de 0, 10, 20 et 50 μg/ml dans un milieu complet et incuber les cellules à 37 °C pendant 20 heures ou à 4 °C pendant 20 heures (2 ml de suspension de NTC pour une plaque de 25 cm²).

3. Fixation cellulaire

1. Retirez ensuite le milieu d’incubation, rincez les cellules avec du PBS, trypsinisez et remettez les cellules en suspension dans un milieu DMEM complet. Centrifugeuse pendant 5 min à 1 200 tr/min.
2. Remplacer le milieu d’abord par du paraformaldéhyde 4 % pendant 1 h à 4 °C, puis par du PBS pour les conserver. Si nécessaire, les cellules peuvent être stockées à ce stade du processus à 4 °C pendant plusieurs jours jusqu’à l’analyse cytométrique.
3. Chaque échantillon doit contenir environ 10^{à 6} cellules concentrées dans 50 μl de PBS. Suspendez-les correctement pour éviter les agrégats pendant l’analyse et filtrez-les à travers un colorant à mailles de 50 μm.
   Remarque : Chaque étape doit être effectuée très doucement pour préserver les cellules.

4. Acquisition d’ImageStream

Utilisez le cytomètre de flux d’imagerie multispectrale ImageStream pour acquérir des images de cellules.
Certains points sont à respecter :

1. Sélectionnez un grossissement adapté (ici, un objectif 40X est utilisé).
2. Si des fluorochromes sont utilisés :
   - Préparer un échantillon de contrôle sans fluorochrome.
   - Préparer des cellules avec un contrôle positif unicolore pour chaque fluorochrome utilisé dans
   à vos échantillons.
3. Utilisez le laser 488 nm pour exciter le FITC et le canal 02 pour collecter l’émission de fluorescence (passe-bande 480-560 nm). De plus, utilisez également les canaux 01 et 06 pour le champ clair (BF) et le fond sombre (DF) respectivement.

5. Post-traitement - Logiciel d’analyse IDEAS (Version 4.0)

1. Parmi tous les événements acquis, l'analyse doit d'abord être limitée à la population de cellules individuelles : utilisez un graphique à points biparamétriques représentant le « rapport d'aspect » (c'est-à-dire largeur/hauteur) par rapport à la « surface de cellule » (paramètres appliqués sur les cellules sur BF) (Figure 1). Les cellules uniques incluses dans la région d’intérêt avec une aire standard et un rapport d’aspect proche de 1 sont ensuite distinguées des événements multicellulaires (grande surface et petit rapport d’aspect) et des débris (zone extrêmement petite).
2. Pour sélectionner des cellules dans le plan focalisé, utilisez un graphique à points biparamétrique adapté aux cellules marquées par des NTC très contrastés : tracez le « contraste » en fonction du « gradient RMS » (qui mesure la qualité de netteté d'une image) sur l'image BF - il permet d'exclure les cellules non focalisées présentant à la fois un faible gradient efficace et un faible contraste dans leurs images BF (Figure 1).
3. 1. Déterminez le paramètre qui fournit la meilleure séparation statistique entre les cellules étiquetées et non étiquetées à l’aide de la fonction « Trouver la meilleure caractéristique ». Dans notre étude, la caractéristique moyenne de l’objet pixel est le paramètre le plus approprié (Figure 2).
   2. Tracer un histogramme à l’aide de ce paramètre en fonction de la fréquence normalisée pour comparer la quantité de NTC-absorbés pour les concentrations testées (figure 3).
   3. Tracer le graphique biparamétrique 'objet pixel moyen sur BF' (Notation : Moyenne Pixel_Object (M01,Ch01,Serré)_Ch01) en fonction de 'intensité sur DF'(Intensity_MC_Ch06), afin d'étudier la corrélation entre ces deux paramètres (Figure 4).
4. La quantification est également évaluée à l’aide de masques :
   1. Comme les NTC apparaissent comme des taches sombres fortement absorbantes sur BF, créez d’abord un masque de seuil qui leur convient précisément en sélectionnant une plage restreinte de pixels de faible intensité comprise entre 0 et 533 dans cette étude (Masque 1, notation : Intensité(M01, BF, 0-533)) (Figure 5). Le choix de l’intensité du seuil se fait sur les cellules marquées par rapport aux cellules de contrôle.
   2. Inversement, créez également un masque ajusté avec les pixels de haute intensité (150-4095 dans ce cas) du DF (Masque 2, notation : Intensité (M06, DF, 150-4095)) (Figure 6).
   3. Tracez un graphique à l’aide de l’aire du masque (1 ou 2 ; (notation : Area_Intensity(M01, BF, 0-533)pour le masque 1) : il fournira une quantification relative de l’internalisation des NTC à différentes concentrations (Figure 7).
   4. Vérifiez le degré de corrélation entre ces deux masques (grâce au tracé biparamétrique 'aire du masque 1' versus 'aire du masque 2') (Figure 7).
5. Créez d’autres masques pour localiser les NTC dans les cellules :
   1. Un masque adapté à l’intérieur de la cellule : Erode(M01, 7) - correspondant au masque de la cellule entière (M01) (Figure 8), qui est encore érodé de 7 pixels (Figure 9).
   2. Un masque s’adaptant à la membrane uniquement à l’aide de l’équation booléenne : M01 et non Erode(M01,7) - masque de la cellule entière (M01) soustrait de l’intérieur (Erode(M01,7)) (Figure 10).
   3. Pour considérer les pixels sombres sur la membrane (correspondant aux NTC), créez alors le masque : Intensity(M01 et non Erode(M01, 7), BF, 0-533) (Figure 11).
   4. Visualisez les différents masques appliqués sur une collection de cellules pour vérifier leur pertinence (Figure 12) pour les cellules étiquetées et non étiquetées.
   5. Appliquez la zone de fonction sur le masque en sélectionnant les pixels noirs sur la membrane 'Area_Intensity(M01 et non Erode(M01, 7), BF, 0-533)' soi-disant zone noire. Il permettra la quantification des NTC sur la membrane.
      
      Pour distinguer enfin les NTC qui ont été internalisés de ceux qui ont été adsorbés uniquement sur la membrane, tracez la zone noire sur la membrane en fonction de la zone noire sur l'ensemble de la cellule (c'est-à-dire 'Intensité Area_ (M01 et non Erode(M01, 7), BF, 0-533' par rapport à 'Intensité Area_ (M01, BF, 0-533)').
      
      note: Le même type de procédure est appliqué avec le signal fluorescent FITC : comparez l’augmentation de l’intensité de la fluorescence FITC par rapport à la diminution du signal de pixel moyen sur le BF, ou la colocalisation entre les taches sombres sur le BF et l’intensité de la fluorescence FITC. Dans notre cas, ce type d’analyse n’est pas pertinent car le signal de fluorescence ne correspond pas correctement aux taches sombres sur BF d’une part et aux champs clairs sur DF d’autre part, montrant que les propriétés intrinsèques des NTC (absorbance et diffusion de la lumière) sont plus appropriées que le signal lié à la sonde de fluorescence.
6. Une fois que tous les graphiques sont créés dans une seule condition expérimentale, créez un « modèle de rapport statistique », enregistrez le modèle en tant que fichier .ast et regroupez tous les fichiers de données.

Résultats

La figure 1 donne un aperçu du principe du périphérique ImageStream. Il produit plusieurs images haute résolution de chaque cellule en flux, y compris le fond clair (BF), le fond noir (DF ou lumière diffusée latéralement) et le(s) canal(s) de fluorescence, comme illustré à la figure 2 avec trois cellules différentes marquées avec des NTC. Les superpositions de ces canaux sont également montrées, illustrant à première vue la corrélation.

Étant donné que toute l’analyse post-traitement est basée sur l’imagerie cellulaire, la sélection des cellules focalisées est cruciale pour l’étude (Figure 3). En fait, la présence de NTC induit des changements à la fois sur le contraste et le gradient par rapport aux cellules non marquées : les cellules focalisées, ayant internalisé une quantité importante de NTC, ont tendance à avoir un gradient efficace faible (qui est généralement le seul paramètre utilisé pour la discrimination des cellules focalisées par rapport aux cellules non focalisées) mais aussi un contraste important, d’où l’importance d’un tracé biparamétrique. La figure 3 montre la discrimination entre les cellules non focalisées (zone jaune) et les cellules focalisées (zone bleue).

Les NTC internalisés par les cellules sont clairement distinguables - en particulier sur BF apparaissant comme des taches brunes fortement absorbantes (voir l’effet de la concentration de marquage diverse, Figure 4). De plus, le signal pixel moyen sur BF a été analysé, donnant une quantification relative de l’absorption : les graphiques de la figure 5 montrent son augmentation significative avec la concentration de marquage CNT (résultats pour environ 7 000 cellules par condition expérimentale).

Deuxièmement, la quantification des NTC est également possible grâce à l’utilisation de masques, appliqués soit sur une gamme restreinte de pixels sombres du BF, soit sur le pixel de haute intensité du DF (voir exemples sur la Figure 6), correspondant aux taches résultant de la présence de NTC. Ainsi, le tracé de l’aire de ces masques permet de mettre en évidence ainsi que d’augmenter l’absorption (illustré sur la figure 7 avec l’aire du masque sur BF, en sélectionnant des pixels allant de 0 à 533).

De plus, la corrélation entre les taches sur BF et DF peut être évaluée en traçant l’intensité DF en fonction du signal de pixel moyen BF (comme dans la figure 8) (analyse indépendante du masque) ou de l’aire du masque sur BF (masque 1) en fonction de l’aire sur DF (masque 2).

En ce qui concerne la procédure créée pour la localisation des NTC à l’intérieur des cellules, la figure 9A montre les différents masques qui ont été créés. Notez que la robustesse des masques de localisation (basée sur l’érosion du masque de cellule par défaut) doit être vérifiée visuellement sur une collection de cellules étiquetées et non étiquetées. Les mêmes masques sont utilisés pour tous les échantillons.

Le tracé de la surface totale des points noirs sur la membrane cellulaire par rapport à celle de la cellule entière permet d’obtenir un score d’internalisation pour les cellules qui ont été incubées pendant 20 heures à 37 °C par rapport à 2 heures d’incubation à 4 °C (voir Figure 9B) ; cela indique que les NTC sont principalement situés sur la membrane à 4 °C, alors qu’à 37 °C, les NTC sont internalisés dans plus de 90 % des cellules.

Enfin concernant la fluorescence, ce paramètre n’a pas été utilisé comme indicateur pour la quantification des NTC en raison d’une corrélation trop faible entre les taches fluorescentes et les taches sur BF (et DF). En effet, la corrélation entre l’intensité FITC et le pixel moyen en fond clair indique un coefficient de corrélation de Pearson de -0,2. Sur la figure 10, deux cas sont illustrés, dans lesquels le signal de fluorescence correspond correctement ou non au point noir en fond clair.

Discussion

1. Modification et dépannage

Dans cette étude, le premier objectif était d’évaluer la quantité et la localisation des NTC dans les cellules. La microscopie confocale aurait pu être a priori la méthode d’or pour évaluer la distribution intracellulaire des NTC fonctionnalisés avec le marqueur fluorescent FITC^8,14. Cependant, le principal inconvénient est la limitation de l’imagerie unicellulaire et, par conséquent, le manque de données statistiquement pertinentes. L’ImageStream permet de travailler au-delà de ces obstacles : en effet, en criblant un grand nombre de cellules (5 000-10 000) en peu de temps (

Par rapport à la cytométrie en flux conventionnelle, l’avantage unique d’ImageStream est de fournir des images multispectrales de chaque cellule et une comparaison pixel par pixel de l’intensité du signal. Ainsi, ImageStream combine la puissance statistique de la cytométrie en flux à haut débit avec les avantages analytiques de l’imagerie confocale pour chaque cellule analysée. Elle est cruciale pour une quantification et une localisation relatives sans marquage des NTC dans les cellules.

2. Étapes cruciales du Protocole

L’étape critique consiste à choisir les paramètres les plus appropriés de chaque étude. Dans notre cas, la meilleure façon était de baser l’analyse sur les propriétés d’absorption et de diffusion des nanotubes : la bonne corrélation entre la localisation des taches sombres sur BF et les points lumineux sur DF soutient que la méthode développée est pertinente et fiable - et n’aurait peut-être pas été possible sans imagerie cellulaire.

3. Limites de la technique

Il convient de souligner que la visualisation des NTC dans les cellules n’a été possible que parce qu’elles ont tendance à s’accumuler dans les vésicules intracellulaires endosomales, puis à apparaître comme de forts points d’absorption et de diffusion. Sur la base de cette méthode, les nanotubes individuels ne devraient pas être détectés alors qu’ils pourraient éventuellement être détectés en fluorescence, ce qui constitue une limitation évidente. Deuxièmement, la quantification n'est pas « absolue » mais relative pour différentes concentrations de marquage et par rapport aux cellules témoins non marquées. Certaines caractéristiques quantitatives (pixel moyen, intensité, etc.) sont des paramètres absolus, tandis que d’autres dépendent du choix des masques (masque de seuil, masques de localisation).

4. Importance par rapport aux méthodes existantes

En ce qui concerne la fluorescence, l’analyse ImageStream met en évidence la faible colocalisation des clusters CNT entre le signal lumineux FITC et les taches sur les autres canaux. Par conséquent, il semble que la fluorescence n’était pas un indicateur fiable pour la quantification et la localisation des NTC. Néanmoins, en surmontant les limites de la cytométrie en flux conventionnelle, qui est principalement basée sur la quantification par fluorescence, le multispectral à haut débit ImageStream ouvre la voie à une quantification statistique sans marquage , tout en permettant la localisation des nanotubes de carbone à l’intérieur des cellules.

5. Applications futures

Cette méthode de nanométrologie statistique à haut débit pourrait être généralisée à tous les nanomatériaux, qui présentent une absorption et une diffusion élevées de la lumière lorsqu’ils interagissent avec les cellules. Par conséquent, il peut avoir des applications importantes pour l’étude de la nano-bio-interface, de la nanotoxicologie et de la nanomédecine.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ImageStream