Les échantillons de test pour optimiser STORM Super-Résolution Microscopie

Summary

Nous décrivons la préparation de trois échantillons d'essai et comment elles peuvent être utilisées pour optimiser et évaluer la performance des microscopes de tempête. L'utilisation de ces exemples, nous montrons comment acquérir les données brutes et les traiter ensuite pour acquérir des images de super-résolution dans les cellules d'environ 30-50 nm de résolution.

Abstract

STORM est une technique de microscopie de super-résolution récemment développé avec jusqu'à 10 fois meilleure résolution que les techniques de microscopie de fluorescence standard. Cependant, comme l'image est acquise d'une manière très différente de la normale, en mettant en place une molécule par molécule de l'image, il ya des défis importants pour les utilisateurs en essayant d'optimiser leur acquisition de l'image. Afin de faciliter ce processus et de gagner plus de perspicacité dans la façon dont fonctionne TEMPÊTE nous présentons la préparation de trois échantillons d'essai et la méthode de l'acquisition et de traitement STORM images de super-résolution avec des résolutions typiques de 30-50 nm. En combinant les échantillons d'essai avec l'utilisation du logiciel libre disponible de traitement de tempête de pluie, il est possible d'obtenir une grande quantité d'informations sur la qualité et la résolution d'image. En utilisant ces paramètres, il est alors possible d'optimiser le procédé d'imagerie à partir de l'optique, de préparation, choix de colorant, des conditions de tampon et les paramètres d'acquisition de l'image de l'échantillon. Nous unmontrent des exemples LSO de certains problèmes courants qui entraînent une mauvaise qualité d'image, tels que la dérive latérale, où l'échantillon se déplace au cours de l'acquisition et de la densité d'image des problèmes résultant du phénomène de «mauvaise localisation» liés.

Introduction

Récemment, un éventail de techniques de microscopie optique ont été développés, généralement dénommée super-résolution microscopie ou nanoscopie, permettant ainsi de contourner la limite de diffraction et de générer des images avec des résolutions de 100 nm ou plus ^1,2. Depuis l'annonce de la microscopie de super-résolution comme étant la méthode Nature Methods de l'année en 2008, il ya eu beaucoup de développement de microscopes à base de localisation. Par exemple, il existe des applications multi-couleurs ^{3-6, 7-12} implémentations 3D et les applications de cellules vivantes, même ^5,13-17. En outre, comme ces systèmes sont commercialisés et sont en train de faire leur chemin hors des laboratoires d'optique dans les mains des biologistes cellulaires, il est susceptible d'être une nouvelle augmentation de leur utilisation et application aux questions biomédicales.

Une branche de cette famille sont les méthodes basées sur la localisation, qui travaillent en mettant en place une molécule par molécule d'image. Jen Pour ce faire, la majorité des molécules fluorescentes dans l'échantillon doit être coupée de telle sorte que seulement quelques molécules séparées spatialement, sont actives à un moment donné. Ces molécules sont ensuite passés rapidement sur et en dehors et de nombreuses images sont prises de sorte qu'une partie importante de la population est imagé à refléter la structure sous-jacente avec une précision de sous-diffraction. Un certain nombre d'approches ont été publiées notamment GSDIM ^18, PALM ^19, fPALM ^20, STORM ²¹ et RESOLFT ^22. Algorithmes qui mesurent la position d'une détection de molécule unique peuvent ensuite être utilisés pour localiser la position réelle de la molécule avec une précision meilleure que 20 nm en utilisant raccord gaussien ^23, par exemple rapidSTORM ^24,25 QuickPALM ^{26, 12} et palm3d orage ^27. Quand l'imagerie cellulaire ou d'autres échantillons biologiques, qui ont une forte densité de molécule, il est donc nécessaire de prendre des milliers de cadres dece clignotement, séparés spatialement, le signal pour l'image, une proportion importante des molécules marquées.

Microscopie stochastique de reconstruction optique (STORM) et la dSTORM très liés et méthodes GSDIM sont des méthodes de super-résolution basée à la localisation, qui se sont révélées à travailler avec des colorants organiques disponibles dans le commerce ^21. Il a été démontré depuis d'être applicable à un certain nombre de différents colorants ^{de 28 à 30,} ce qui rend la méthode particulièrement intéressante en raison de la spécificité et de la commodité d'autres approches d'immunomarquage bien établis pour effectuer la microscopie de fluorescence. Par conséquent, il ya un accès facile à une gamme de conjugués anticorps-colorant et colorant biomolécules, qui ont le potentiel d'être utilisé dans de super-résolution imagerie basée sur la localisation. Alors que les principes généraux du STORM et des approches similaires sont relativement simples, et à première vue, la préparation du matériel et de l'échantillon semblent relativement straightforward, il ya un certain nombre d'étapes dans le processus qui sont essentiels à la réalisation de haute qualité, des images libres de artefact super-résolution.

Comme avec toutes les techniques de microscopie le processus peut être considéré en trois étapes principales: d'abord, la préparation d'échantillons, d'autre part, l'acquisition des images et, troisièmement, le traitement d'image et / ou l'analyse et l'interprétation d'image. Le pouvoir de résolution supplémentaire et méthode de générer des images de super-résolution en utilisant une approche basée sur la localisation-introduit de nouveaux problèmes et considérations ^31-33. En commençant par la préparation des échantillons, lors de l'exécution immunomarquage, en particulier immunofluorescence indirecte, où une combinaison d'anticorps primaire et secondaire est utilisée, il convient de noter que le colorant fluorescent peut être jusqu'à 20 nm à une distance à partir de la molécule d'intérêt. Dans le cas des microtubules, ceci conduit à des diamètres de 35 à 50 nm par rapport à un diamètre de microtubules prévue de 25 nm ^28,30. En outre, la densité de l'étiquetage devrait meet les critères de Nyquist afin de générer une image de haute qualité ^14. Par exemple, pour une résolution d'image prévue de 20 nm le long d'une structure filamenteuse il devrait y avoir une molécule de colorant, au moins tous les ²⁷ à 10 nm. Alors que de nombreux colorants ont été publiées à travailler pour les approches à base de localisation-la performance globale du colorant est un mélange d'au moins quatre critères importants, à savoir les photons détectés par événement de commutation (la luminosité de chaque clignement - lumineux est mieux), l'équilibre sur cycle hors service (le taux de contraste de colorants dans le hors contre sur l'état - plus large est généralement mieux), la fraction de survie (un taux de blanchiment bas est mieux) et le nombre de cycles de commutation (le nombre de clignotements par fluorophore - plus est mieux pour une grande résolution, bien que 1 clignotement par fluorophore peut être un avantage pour des fins de comptage molécules). La situation est encore compliquée par le fait que ces propriétés pour n'importe quel colorant donné peuvent varier dans différentes conditions de tampon etavec le laser de puissance ^28,29. En outre, ainsi que ces considérations STORM uniques, la qualité de l'image peut être améliorée en optimisant la préparation des échantillons de la même façon que les techniques de microscopie par fluorescence plus classiques, par exemple en réduisant au minimum l'autofluorescence par modification des conditions de fixation et l'utilisation de réactifs d'extinction. De plus, en minimisant fluorophores non liés spécifiquement est important, ce qui peut être fait en ajustant les concentrations d'étiquettes, des temps d'incubation et blocage et de lavage étapes.

La deuxième étape de l'acquisition d'image est également critique. Les paramètres optimaux sur le microscope dépendront de la teinture, des conditions de tampon, la densité de marquage, et le type d'échantillon, par exemple, le verre, les monocouches sur des cellules ou des échantillons de tissus. Les principales considérations sont caméra le temps d'exposition, numéro de trame, angle d'éclairage (FRBR, Hilo, Epi) et la puissance du laser. L'objectif est de collecter autant de clignotements séparés spatialement lumineux le plus rapidement possible. Si le fond is très élevées ou clignote ne sont pas très lumineux, en d'autres termes le rapport signal-sur-bruit est faible, l'algorithme de reconstruction ne sera pas en mesure de localiser les positions avec précision. Ainsi que la maximisation de la précision de localisation, c'est à dire la précision de la position de chaque molécule peut être mesurée, de la qualité de l'image dépend également d'un grand nombre de localisations. Si un nombre insuffisant de molécules d'intérêt sont imagé, soit en raison de la faible efficacité de l'étiquetage, photoblanchiment excessive ou un numéro d'image insuffisante, alors l'image résultante de super-résolution sera ponctuée et discontinu comme critères de Nyquist n'auront pas été remplies ^14,27 .

Et enfin, la troisième étape, le traitement d'image, est particulièrement important par rapport aux techniques de microscopie à fluorescence standard. Il existe une gamme de librement et disponibles dans le commerce des algorithmes, ce qui est à la fois un avantage, en termes de choix, et un inconvénient, en ce qu'il peut être difficile de savoir which est le plus approprié à utiliser. Si par exemple les données brutes a bien espacées clignote spatialement distincts alors un algorithme d'ajustement seule molécule peut être très précise et efficace, par exemple par les algorithmes d'ajustement rares disponibles sous une pluie torrentielle ^27, rapidSTORM ^{24,25, 12} et palm3d logiciel QuickPALM ²⁶ . Si les données brutes contient beaucoup de chevauchement des signaux alors algorithmes qui peuvent être plus appropriés inclure DAOSTORM ^{34, 35} et 3B deconSTORM ^36. En outre, ces algorithmes contiennent des seuils pour différents critères tels que nombre de signaux, ou de photons par clignotement, ainsi que diverses autres options d'affichage d'image, comme la visualisation des fonctions gaussiennes lissées ou histogrammes avec des grilles de pixels, où la taille de pixel de super-résolution peut être sélectionné par l'utilisateur. Toutes ces options modifier l'apparence de l'image finale et ont des implications pour l'interprétation des images et l'analyse.

Par conséquent, nous présentons trois échantillons d'essai qui fournira le nouvel utilisateur avec un point de départ pour des expériences à base de colorants à base de localisation-super-résolution, qui, pour des raisons de clarté, nous appellerons comme tempête, et les utilisateurs plus expérimentés de la possibilité de optimiser leurs expériences. Premièrement, il est possible de revêtir la surface de verre avec une couche fluorescente de dextrane-conjugué colorant. Cela fournit un moyen rapide et simple à mettre en place que le microscope, colorant et tampon travaillent pour générer clignotant signal fluorescent. La méthode peut être étendue en comparant mesures moyennes de précision de la localisation et le numéro générés par la tempête de pluie pour optimiser les conditions de tampon, les paramètres d'acquisition d'image et de tester différents colorants. Deuxièmement, nous présentons un protocole simple pour la préparation de filaments d'actine sur le verre qui peut être facilement marqué à l'aide conjugués phalloidin-dye. Ceux-ci fournissent des structures idéales pour effectuer des mesures de la résolution ²⁷ et généralement la moitié du maximum pleine largeur (FWHM)d'un filament est donnée comme une estimation empirique de la résolution ^37. Il convient de noter que la résolution varie entre les échantillons et entre les images dans le même échantillon parce que la résolution en super-résolution microscopie basée localisation-est une fonction de la luminosité de fluorophore, le bruit de fond et la densité de localisation ²⁷ et ceux-ci ne sont pas nécessairement constante tout au long de l'échantillon. Les filaments d'actine sont utilisés pour démontrer artefacts potentiels tels que mislocalizations et de la dérive et la façon dont ils peuvent être identifiés avec des fonctionnalités du logiciel au sein orage. En outre, nous décrivons l'utilisation de marqueurs fluorescents repères à la fois la mesure et la dérive correcte. Et troisièmement, la coloration des cellules avec le facteur de croissance épidermique (EGF), des conjugués de colorant-est décrite. FEM fournit un indicateur utile de la super-résolution performance de l'image, car une proportion du récepteur à la surface de la cellule subit une endocytose via des vésicules, qui sont des structures de taille sous-diffraction d'environ 50-150 nm de diamètre ^27,38,39.

Protocol

Note: Dans ce protocole, des conseils et des suggestions se trouvent suivant certaines étapes. La notation "* 1" indique que la note 1 est pertinente pour cette étape particulière, et ainsi de suite.

Une. Fluorescent Dextran revêtement de verre

1. Ajouter 200 ul de poly-L-lysine solution à 0,01% à chaque puits d'une lamelle 8-chambre et incuber pendant 10 min. Retirer avec une pipette pour s'assurer qu'aucun liquide restant.
2. Reconstituer dextran-Alexa 647 ^{* 1} selon les instructions du fabricant pour créer une solution stock de 2 mg / ml. De cela, diluer 0,25 ul dans 25 ul d'eau désionisée pour créer une solution à 20 pg / ml.
3. Pour créer un revêtement de haute densité de dextrane-Alexa 647 solution diluée 20 ul de la solution à 20 pg / ml dans un total de 200 ul d'eau désionisée. Pour une solution de densité moyenne diluer 2 pi à 200 pi d'eau désionisée (1:10.000 dilution de la solution mère d'origine). Pour un faiblesolution de densité diluer 0,2 pi à 200 pi d'eau désionisée (1:100.000 dilution de la solution mère d'origine).
4. Ajouter 200 ul de dextran-Alexa 647 solutions diluées à chaque puits et incuber pendant 10 min. Des temps d'incubation plus longues peuvent être utilisées, qui peuvent conduire à un enrobage de dextrane plus dense. Enlever et laver avec H ₂ O trois fois ^{* 2}

Note 1: D'autres conjugués dextrane-colorants peuvent être utilisés. Dextran non conjugué peut également être conjugué à des colorants si les combinaisons souhaitées ne sont pas disponibles dans le commerce.

Remarque 2: Les mêmes chambres de dextrane peuvent être réimagés sur une période de plusieurs semaines, bien que l'uniformité de la fluorescence peut diminuer. Stockage à 4 ° C en l'absence de tout tampon est recommandée.

2. Filaments d'actine fluorescente sur verre

1. Ajouter 200 ul de poly-L-lysine solution à 0,01% à chaque puits de la chambre et laisser incuber pendant 10 min ^{* 3.} Redéplacer avec une pipette pour faire en sorte qu'aucun liquide n'est restants.
2. Ajouter 90 pi de tampon d'actine général (reconstitué selon les instructions du fabricant) pour chaque chambre. Ajouter 10 ul de 10 uM préformés solution de filaments d'actine et 1 pl phalloidin-Alexa 647 (0,2 unités, lorsqu'il est dissous dans 1,5 ml de méthanol selon les instructions du fabricant) et la pipette doucement de haut en bas pour mélanger. Incuber pendant 30 min ^{* 4.}

Note 3: L'augmentation du volume de la solution de filament dans les résultats de la chambre à moins de filaments de liaison à la poly-L-lysine recouvert de verre.

Note 4: Les temps d'incubation allant jusqu'à 48 heures à 4 ° C ont été testés avec de bons résultats. Qualité d'image des filaments d'actine se détériore une fois une chambre a été exposé à un tampon de commutation de sorte qu'il n'est pas recommandé d'utiliser le même échantillon de plus d'une journée.

3. Microsphères fluorescentes perles que Fiducial Marqueurs

1. Diluer 1 ul de billes TetraSpeck dans 200 ul de PBS et mélanger.
2. Ajouter les perles dilué dans une chambre d'imagerie et d'attendre 15 min ^{* 5.} Eliminer la solution et laver 3 fois avec du PBS avant l'imagerie.

Note 5 - le temps d'incubation et la dilution peut être ajustée pour obtenir des densités différentes de perles. Ce protocole conduit typiquement à entre 3-10 perles par 20,5 um x 20,5 um champ de vision.

4. Facteur de croissance épidermique cellulaire coloration

1. Culture des cellules HeLa dans des chambres d'imagerie à environ 80% de confluence dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et une solution de pénicilline-streptomycine 1%.
2. Retirez le milieu de culture et laver avec du PBS. Ensuite, ajouter 500 ul de solution à 4% de formaldehyde (solution de formaldehyde à 4 ml de 10%, 1 ml de PBS 10X, 5 ml d'eau) pendant 10 min. Retirez le formaldéhyde et laver 3 fois avec PBS. Ne pas laisser les cellules restent dry et toujours utiliser PBS tamponnée solutions pour éviter le stress hypotonique.

ATTENTION - formaldéhyde est extrêmement toxique. Veiller à ce que des gants, des lunettes de protection et des blouses de laboratoire sont usés. Consultez les lignes directrices locales pour l'élimination de formaldéhyde.

3. Reconstituer EGF-Alexa 647 selon les instructions du fabricant pour créer une solution stock de 50 pg / ml. Ajouter 2 ul de cette solution mère à 200 pl de solution de BSA à 0,1% (dans du PBS). Retirez le PBS à partir des cellules, ajouter la solution de l'EGF et incuber pendant 30 min.
4. Retirer la solution et laver 3 fois avec du PBS avant d'ajouter une solution de blocage de BSA à 0,1% (dans du PBS) pendant 15 min. Supprimer ce et laver encore 3 fois avec du PBS avant l'imagerie.

5. Mise en mémoire tampon de préparation

1. Faire une solution stock d'enzyme (A) avec 10 pi de la catalase (20 pg / ml), 20 pi de 1 M Tris chlorhydrate (2 carboxyelthyl) phosphine (4 mM), 2,5 ml de glycérine (50%), 125 plde 1 M de KCl (25 mM), 100 pl de 1 M à pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg de glucose oxydase (1 mg / ml) et compléter à 5 ml de volume avec diH20. Cela suffit pour faire 100 x 50 aliquotes, qui peuvent être stockées à -20 ° C et utilisés pour jusqu'à 1 an.
2. ) Faites un stock solution de glucose (B) avec 4 g de glucose (100 mg / ml), 4 ml de glycérine (10%) et 36 ml diH20. Cela suffit pour faire 100 x 400 ul aliquotes, qui peuvent être stockés à - 20 ° C et utilisés pour jusqu'à 1 an.
3. Faites un agent solution stock de réduction (C) avec 113,6 mg de MEA-HCl (1M) et 1 ml de diH ₂ 0. Utilisez frais ou faire 10 x 100 aliquotes, qui peuvent être stockés à -20 ° C et utilisés pour jusqu'à 1 mois (ne pas recongeler aliquotes).
4. Juste avant l'imagerie, mélanger l'enzyme (A), le glucose (B) et l'agent réducteur (C) des solutions d'ensemble dans le rapport de 50 ul, 400 ul, 100 ul et compléter à 1 ml avec du PBS ^{* 6.} Ce tampon va maintenant piéger l'oxygène et un environnement réducteur (MEA-100 mMHCl) ^{* 7.} Le pH final doit être de l'ordre de 6,0 à 8,5 (ajustement n'est normalement pas nécessaire) ^{* 8.}

Note 6 - cette mémoire tampon est approprié pour une utilisation avec des colorants à base de carbocyanine tels que Cy5 et Alexa 647.

Note 7 - les concentrations enzymatiques finales sont de 50 pg / ml (5 unités / ml) de la glucose-oxydase et 1 pg / ml (40 à 60 unités / ml) de la catalase. L'activité enzymatique (unités) est donnée par les fournisseurs et peut varier. Les calculs pour la catalase supposent que 1 pg / ml de concentration finale après l'étape 5.4 contiendra 50 unités d'enzyme. Diverses compositions tampons, y compris des composants similaires d'élimination de l'oxygène peuvent être trouvés ^21,30,40. Pour un résumé des combinaisons de tampons et colorants voir les références ^28,29. Glycérine et PTCE sont nécessaires pour le stockage à long terme à -20 ° C.

Note 8 - si les filaments d'actine imagerie ajouter MgCl2 ₂ mM et 0,2 mM d'ATP pour aider à stabiliser til filaments.

6. Microscope d'acquisition de données STORM (en utilisant Alexa 647 colorant)

1. Allumez le microscope STORM / PALM, de préférence au moins 3 heures avant l'imagerie pour permettre un équilibre thermique à atteindre. Imaging avant cela a un risque accru de dérive.
2. Insérer la chambre d'imagerie dans le porte-échantillon de la platine du microscope. Assurez-vous que l'échantillon est bien dans le support et est à plat.
3. Retirez le PBS de la chambre d'imagerie et remplir vers le haut avec le tampon de commutation. Placez délicatement une lamelle sur le dessus de la chambre, en s'assurant qu'il n'y ait pas de bulles à tous et que la chambre entière est couverte. Haut avec tampon PBS ou plus si les bulles sont vus autrement tampon performance peut diminuer.

ATTENTION - afin de minimiser les risques de dérive latérale et axiale de l'échantillon par rapport à la lentille d'objectif, il est recommandé que l'échantillon et le tampon sont laissés s'équilibrerà la température ambiante pendant au moins 15 min avant l'imagerie.

4. Localiser une structure fluorescente d'intérêt à imager. Sélectionnez l'angle souhaité d'illumination, dans ce cas, un FRBR ou angle fortement inclinée est recommandé que ce qui améliore le rapport signal-sur-bruit en minimisant hors-focus de lumière, ce qui est particulièrement bénéfique pour les échantillons de cellules. Prenez une image de diffraction limitée référence de la structure avant de l'imagerie de STORM.
5. Augmenter le laser d'excitation (avec une longueur d'onde d'excitation appropriée de l'ordre de 640 nm) à une puissance élevée, correspondant à environ 2 kW / cm ^2, tandis que l'imagerie avec des paramètres de la caméra de 10 l'exposition ms et un temps de cycle de l'ordre de 50 Hz (images par seconde) . Une fois que les fluorophores ont fait la transition dans un modèle de clignotement clairsemée (probablement dans les 10 secondes pour la plupart des échantillons) de recueillir 10 000 cadres ^{* 9.}

Note 9 - 10000 trames est adapté pour les échantillons décrits icimais il peut être nécessaire d'augmenter le nombre de trames de 50 000 ou plus pour les autres échantillons.

7. Reconstruire super-résolution des images à partir de données brutes (à l'aide de pluie)

1. Ouvrez le fichier rainSTORM.m de l'intérieur MATLAB et exécuter (figure 1A).
2. Dans la fenêtre de tempête de pluie (figure 1B), sélectionnez le fichier image à analyser à l'aide du bouton Parcourir. Ce devrait être un fichier tif. (ImageJ peut être utilisée pour convertir d'autres types de fichiers dans un format tif). Modifier la largeur de pixels pour correspondre aux données brutes du système de microscope utilisé pour acquérir les données ^{* 10.} Laissez les autres valeurs par défaut.

Note 10 - Un appareil typique EMCCD a une taille de pixel de 16 pm de manière relative à un système avec une lentille d'objectif 100X la taille de pixel sur l'image sera de 160 nm. Sur les systèmes commerciaux de la taille de pixel est généralement affiché dans le logiciel. Les tailles des pixels varient entre 100 nm et 160 nm pour la plupart des microscopes de localisation.

3. Appuyez sur le bouton «Traiter les images" et attendre une image préliminaire apparaît. La durée du traitement sera fonction de la taille du fichier, la spécification de l'ordinateur et le nombre de clignotements candidats dans les données brutes ^{11 *.}

Note 11 - 10000 séquences d'images d'actine et les données du FEM ont pris 23 sec et 25 sec pour traiter respectivement l'aide d'un PC avec un processeur Intel Xeon E5420. En utilisant le même ordinateur sans une boîte à outils de traitement parallèle dans MATLAB, ou avec un ordinateur sans le traitement de base multiples, les temps étaient respectivement 66 sec et 81 sec.

4. Pour générer un super-résolution d'image de presse mise à jour sur le bouton «Ouvrir avis» et une deuxième fenêtre apparaîtra (figure 1C). Appuyez sur le bouton «Ajuster le contraste" pour changer l'affichage de l'image comme vous le souhaitez (figure 1D). Dans certains cas, où l'image est très sombre la valeur maximale doit être diminuée.
5. Utilisez le revViewer fenêtre (figure 1C) pour générer des paramètres de qualité d'image utiles et affiner l'image de super-résolution plus loin. Définir les trois premiers paramètres de contrôle de qualité à des valeurs de 4,000, 0,1 et 0,8 à 2,0 respectivement ^{* 12.} Mettre à jour les comptes par la valeur de photons, qui devrait être soit basé sur une mesure d'étalonnage de photons ou en utilisant les valeurs de la courbe d'étalonnage de photons courbe spécifiées par le fabricant de l'appareil pour un réglage particulier de gain EM. Cela est essentiel pour obtenir une précision accrue et des mesures de résolution ^{* 13.}

Note 12 - Chiffres de signaux rejette clignote sur la base de critères de luminosité. Plus la valeur est la plus brillante clin doit être de devenir accepté comme une localisation dans l'image finale. Cela peut être nécessaire de modifier en fonction de la sortie de photons du colorant et du temps d'exposition et de la sensibilité de la caméra. Tolérance rejette clignote s'il ya erreur quadratique significative entre le signal et l'équipée de Gauss-dire dpics ouble. PSF Sigma Range rejette clignote si la largeur équipée de la PSF se trouve hors de cette plage, c'est à dire une gamme plus étroite peut être utilisé pour rejeter les signaux hors-focus et de grandes taches agrégées de fluorescence constante. L'utilisation d'un plus large éventail peut entraîner des problèmes de mauvaise localisation apparaissant dans l'image finale. En pratique, il est recommandé d'effectuer un contrôle de la qualité initiale en utilisant le paramètre de coupure de la précision de la localisation.

Note 13 - pour en savoir plus sur les paramètres de résolution, voir les références ^23,27. En bref en connaissant le nombre de photons produits par chaque clignote, il est possible de calculer la précision de la localisation de chaque localisation et par conséquent dériver moyenne globale des estimations de précision pour l'ensemble de l'image. L'utilisation d'un Andor Ixon DU-897E avec un réglage de gain de 200 par les comtes valeur de Photon est 9.04.

6. Modifier le seuil de précision de localisation (figure 1C) de compromis entre l'optimisation précis de localisation moyennesions contre nombre de localisation dans l'image finale. Des valeurs de 30 à 50 nm sont recommandées en fonction de la qualité des données et de l'échantillon. Les deux histogrammes et les fichiers info.txt peuvent être utilisés pour informer de cette décision (figures 1F et 1G).
7. Le facteur d'échelle de reconstruction (figure 1C) par défaut est de 5, ce qui va générer de super-résolution des pixels de 32 nm en supposant que la largeur en pixels dans les images originales est de 160 nm. Si les images brutes ont une taille de pixel de 100 nm ce qui produira des images de super-résolution avec des pixels de 20 nm. Augmenter le facteur d'échelle pour produire des pixels plus petits super-résolution de l'image finale ^{* 14.}

Note 14 - Définition de la microscopie de la localisation dépend du lissage requis pour la visualisation (ie. la taille de pixel d'une reconstruction de l'histogramme simple,), ainsi que la précision de la localisation. En pratique, la taille de pixel reconstruction doit généralement être inférieure à la localisationprécision (voir la métrique moyenne Precision Estimation dans les infos fichier texte - les étapes 6.11 et 6.12). Dans ce cas, la perte de résolution due à la reconstruction taille de pixel sera faible ^23,27. Par exemple, les estimations moyennes de précision de la ligne et la direction de la colonne de la figure 4E sont 16,1 nm et 16,2 nm. Une taille de pixel de 16 nm a été utilisée pour visualiser ces données (facteur d'échelle de reconstruction de 10 avec une largeur de pixel initial de 160 nm).

8. Modification de la plage de trame de limite (figure 1C) pour restreindre la reconstruction de sous-ensembles de données brutes, par exemple [2001-inf] exclurait les initiales 2000 trames de données brutes.
9. Appuyez sur le bouton "Exécuter un avis '(figure 1C) pour générer une image de super-résolution mis à jour (figure 1E).
10. Appuyez sur le bouton "Voir les histogrammes» (figure 1C), afin d'afficher les mesures de qualité d'image (figure 1F) ^{* 15.}

Note 15 - Le graphique en haut à droite représente le nombre de localisations acceptés contre numéro de trame de la caméra et l'histogramme Thompson Localisation Précisions en bas à droite (figure 1F) peut être utilisé pour informer l'option précision de localisation de l'examen de coupure. Par exemple, en utilisant un seuil de coupure de 50 nm exclurait toutes les localisations avec précision pire d'être inclus dans l'image finale de super-résolution.

11. Appuyez sur le bouton 'Enregistrer l'image »dans la critique (figure 1C) afin de sauver toutes ces données ^{* 16.}

Note 16 - Entre 3 et 5 fichiers peuvent être sauvegardés en fonction des options choisies (image somme, STORMdataImage, STORMprocessed, info & hists), voir la figure 1G. L'image traitée STORM est affichée avec des cartes de contraste et de couleur modifiés. Le STORMdataImage est une image en niveaux de gris, dans lequel le niveau de gris de chaque pixel est égale à l'engourdissementer des localisations qui ont été identifiés en son sein.

12. Après avoir examiné les données (par exemple Info.txt fichier et histogrammes) retour à l'étape 7.6 et répéter les étapes suivantes avec différents paramètres de l'évaluateur si vous le souhaitez. En appuyant sur 'Enregistrer l'image »à l'étape 7.11 écrase les données précédemment enregistrées.

8. Boîte de suivi et de correction de dérive (à l'aide de pluie)

1. Suivre les étapes 7.1 à 7.9 pour générer une image de la manière habituelle.
2. Appuyez sur le bouton «Boîte de suivi» dans la critique (figure 1C) et cliquer et faire glisser une boîte sur le repère de calage ou de la structure d'intérêt sur ​​l'image revue.
3. Attendez jusqu'à ce qu'une nouvelle image apparaît, qui permet d'afficher les «positions Coffret» (voir les figures 6B, 6C et 6F pour des exemples). Enregistrer l'image si vous le souhaitez.
4. Si l'objet d'intérêt est un marqueur de repère alors la dérive correction peut être effectuée en cliquant sur le bouton «Set Anchor» suivie du 'Sousbouton Drift des voies. Enfin cliquez de nouveau sur "Exécuter avis" pour générer une nouvelle image de la tempête, qui aura maintenant toutes les localisations corrigés selon les positions des marqueurs repères. Les positions de perles sont supprimés de l'image finale en revue.
5. Si il ya d'autres marqueurs de référence dans l'image finale de dérive corrigée, ceux-ci peuvent être supprimés en appuyant sur «Boîte de suivi», «Supprimer Boxed", puis autant de fois «Run Auteur" comme vous le souhaitez.

Results

Dextran

Un revêtement réussi de dextrane devrait produire une monocouche fluorescent. À la forte concentration ce devrait apparaître relativement uniforme. Aux concentrations plus faibles, il apparaîtra plus clairsemée (Figure 2A). Beaucoup de microscopes STORM / PALM ont la capacité de changer l'angle d'éclairage de épifluorescence de la FRBR. Lorsque vous utilisez une vue complète de la caméra de cadre, par exemple à 512 x 512 pixels sur un appareil photo classique EMCCD, un éclairage homogène doit être observé. S'il ya des rayures ou des régions hors-focus, cela peut indiquer que l'échantillon doit être réinséré dans le porte-échantillon avec de l'huile fraîche sur l'objectif. Alternativement, il peut indiquer un problème avec le microscope.

Lors de l'acquisition des données brutes de super-résolution du laser d'imagerie doit être augmentée en puissance à environ 2 kW / cm ^2. Il y aura une bouffée initiale de la fluorescence suivie d'clignoter que les fluorophores sont entraînés enaux Etats sombres temporaires. A haute dextran densités clignote sont susceptibles de se chevaucher, en particulier vers le début de l'acquisition de l'image (vidéo 1). À moyen et à faible densité de ces clignote devraient être rares, c'est à dire l'espace séparé, et la mise au point sans fond clair (voir cadres 2000, 5000 et 8000, figure 2A, Vidéos 2 et 3). Au cours de cette phase d'acquisition d'images, à un éclairage laser constant, le nombre de clignotements diminue avec le temps (à comparer avec la trame trame 2000 8000 dans l'échantillon de densité élevée, Figure 2A). La principale différence entre les différentes images de super-résolution des différentes concentrations de dextran (haute, moyenne et basse) est la diminution du nombre de localisations (Figures 2A et 2B). En d'autres termes, la concentration des molécules fluorescentes, le nombre de clignotements dans les données brutes et le nombre de localisations présentent une relation proportionnelle. Cette relation,cependant, n'est pas un linéaire simple à très grande molécule densités le logiciel est incapable de localiser avec succès des molécules (comparer les lignes rouges et bleues, la figure 2C). La raison à cela est que, à la concentration élevée, il n'est pas possible pour le logiciel de traitement pour adapter les positions en utilisant l'algorithme d'ajustement de Gauss, où le témoin ne sont pas rares. En le voyant diminuer par la phase d'acquisition en raison de photoblanchiment le logiciel peut s'adapter de plus en plus le voyant qu'ils deviennent rares (Figures 2A et 2C). En outre, les molécules de colorant individuels peuvent clignoter, et donc être localisée plus d'une fois ^28,41,42.

Un problème commun lors de l'imagerie quelconque de ces échantillons, mais surtout le dextran une haute densité, peut être la présence de brume lumineuse mais non ciblé fluorescente qui semble être la diffusion rapide lors de la tempête l'image phase d'acquisition. Ceci se distingue des fluorophores de contraste élevé surla surface du verre, qui peut être vu à clignoter (Figure 3A, la vidéo 5). Ces molécules fluorescentes individuelles peuvent être évitées ou supprimées en augmentant le nombre d'étapes de lavage avec du PBS avant d'ajouter le tampon de commutation ou par addition d'un tampon de commutation douce à la chambre (Figure 3B, Vidéo 6). Traitement et la comparaison des données de chacun des résultats de séquence d'images à des images très différentes de super-résolution qui ont une diminution à la fois du nombre de localisations et la précision avec laquelle ils peuvent être équipés du logiciel à localiser le témoin (figures 3C, 3D, 3E et 3F).

Les filaments d'actine

Les filaments d'actine préformés peuvent être vus collé à la surface du verre par une imagerie à diffraction limitée (Figure 4A-4C). Si le nombre de filaments apparaît très faible, puis un temps d'incubation plus long peut être utilisé ou une diminution du volume de l'actinesolution de filament contribue également. Sélection simples filaments relativement lumineux (figure 4D) plutôt que les zones les résultats enchevêtrées dans des images de meilleure qualité. Au cours de la phase d'acquisition, lumineux clignote en mise au point doivent être vus le long de la longueur du filament (Video 7). Clignotement dépouillée devrait être considéré lors de la phase d'acquisition et ensuite dans les données traitées, il devrait être un filament continu mince (figure 4E) et les localisations par trame si un déclin progressif (figure 4F), contrairement à la figure 3E.

Si clignotement est non rares, ou si le logiciel ne pas être en mesure de localiser les molécules, un artefact plus subtile, appelée mauvaise localisation ^32, peut entraîner. Cela se produit lorsque les moyennes de logiciels la position de deux molécules qui se chevauchent et la localisation est la position à mi-chemin entre les deux. Une indication qu'il n'y a pas eu un nombre important de chevauchement bliNKS, et par conséquent mislocalizations, c'est que les estimations de précision moyennes devraient être les mêmes dans les lignes et de colonnes directions, soit horizontalement et verticalement; où il ya mislocalizations celles-ci auraient eu lieu le long de la longueur du filament, produit un plus grand que clin normale ( c'est à dire, réparties sur plus de pixels), ce qui par conséquent ont été localisées avec moins de précision dans l'une des directions. Ceci est plus facilement visible lorsqu'il existe un seul filament d'actine dans la zone de formation d'image et il est allongé à l'horizontale ou à la verticale. Dans ce cas, le microscope STORM, atteint une précision moyenne de 16 nm dans les deux sens. Il en résulte une limitation de la précision, une mesure de la résolution d'image effective d'environ 34 nm. Ces mesures sont fournies par orage ^27, cependant, que nous avons une structure filamenteuse de diamètre uniforme, 7 nm avec le très petit phalloidin-Alexa 647 étiquette que nous pouvons prendre une mesure de FWHM pour estimer la résolution de l'image. Par draaile une ligne droite à travers le filament de l'image de super-résolution dans ImageJ (figure 4G), en utilisant la fonctionnalité de profil de terrain (figure 4H) et en effectuant ensuite un ajustement gaussien (figure 4E) la FWHM est calculé comme 43,2 nm. Lorsque vous tentez cette mesure, nous recommandons que la taille des pixels doit correspondre ou être légèrement inférieure à l'estimation de la précision moyenne pour l'image (voir le fichier info.txt figure 1G). Dans ce cas, 16 nm pixels ont été utilisés pour reconstruire une image.

Deux problèmes connexes peuvent se produire avec STORM, où les fluorophores clignotants deviennent non-rares, c'est à dire des molécules individuelles dans environ 250 nm clignotent en même temps et par conséquent, les signaux se chevauchent. Le premier est que, en fonction de l'algorithme et les critères de contrôle de qualité qu'il utilise, le voyant ne peuvent pas être localisés au niveau de l'ensemble. Il en résulte des images d'une résolution avec peu ou pas de localisations. Le deuxième problème demislocalizations se produit lorsque les deux clignotements eu lieu suffisamment proche de l'autre pour apparaître comme un simple clin d'oeil. Dans ce cas, la position dans l'image finale représente une moyenne des deux. Pour plus de détails sur ce sujet, voir référence ^32. Dans les deux cas, cela peut se produire avec des échantillons de très haute densité, la puissance du laser insuffisante ou avec des problèmes de commutation de tampons. Ce problème est apparent où un certain nombre de filaments d'actine sont ramification et / ou le passage de l'autre (figures 5A-D, Video 9). En traitant des sous-ensembles de cadres, et en comparant les 5000 premières et dernières images, nous pouvons voir une image résultante différente. Dans l'image de super-résolution en utilisant les 5000 premiers cadres (figure 5C), nous pouvons voir qu'il ya beaucoup de localisations dans le milieu de l'image, mais en utilisant les 5000 dernières images, très peu d'entre eux sont apparents et on se retrouve avec seulement les filaments, quoique quelque peu discontinue dû au faible nombre de localisations dans le image (figure 5D). Si une densité trop élevée de clignotant est soupçonné comparaison des images avec la localisation par des données d'image peut fortement penser que ce problème se produit, au cours de la première série d'images, il est un nombre moyen de localisations par trame de plus de 10 par rapport à la dernière série de cadres où il est d'environ 4 (figure 5E). Afin de minimiser la probabilité de mislocalizations qui se produisent, il est idéal d'avoir aussi peu de localisations par trame que possible, bien que s'il existe un grand nombre de molécules à être imagées, c'est à dire pour un échantillon de haute densité, ce qui exige qu'un grand nombre d'acquisition cadres soient prises menant à un autre problème en microscopie STORM qui est la dérive.

Latéral Drift - des filaments d'actine et Fiducial Marqueurs

La dérive se produit lorsque l'échantillon se déplace par rapport à la lentille d'objectif à travers la phase d'acquisition de données. Cela est difficile ou impossible de voir During de la phase d'acquisition d'image, en particulier si elle est latéral et non axial, ou si ces données étant spécifiquement mesuré, comme cela est typiquement inférieure à 50 nm sur une période de plusieurs minutes pour les systèmes de microscope relativement stables. Cependant, dans les images reconstruites des structures connues, telles que les filaments d'actine avec structure bien définie, elle peut être détectée dans les images de super-résolution. Le premier signe que la dérive latérale peut avoir eu lieu, c'est que la structure est plus grande que prévu (figure 6A, Vidéo 8), par exemple avec une relativement grande FWHM par rapport aux données de limite de précision de la tempête de pluie, dans ce cas de 90 nm contre 67 nm. Cependant, un meilleur moyen pour détecter la dérive est en comparant les localisations en tant que fonction du temps, c'est à dire de voir si les localisations dans les trames ultérieures sont déplacés par rapport à ceux dans les premières trames. Ceci est clairement visible dans le cas des filaments d'actine, qui sont très petits et de structure uniforme, lorsques'affiche avec un code de couleur en utilisant la fonctionnalité de suivi de la boîte sous une pluie torrentielle (figures 6B et 6C).

La dérive est un problème bien connu et il ya un certain nombre de stratégies qui peuvent être utilisés pour minimiser ¹⁹ ou corriger post-acquisition en utilisant soit marqueurs fiduciaires ^21,43 ou corrélations croisées ^44. Afin de mesurer la dérive et correct pour elle, des perles fluorescentes de 100 nm de diamètre peuvent être utilisés comme marqueurs de référence (figure 6D). Parce qu'ils sont petits et lumineux leur position peut être mesurer avec précision en utilisant des algorithmes d'ajustement de Gauss, comme orage. Dans un exemple où il n'y a dérive relativement sévère d'environ 100 nm au cours de 3 min 10 sec, au cours de la phase d'acquisition (figure 6E), la fonction de suivi même boîte peut être utilisée pour le code de couleur et de confirmer que la dérive s'est produite (figure 6F ). Comme tous les quatre perles dans cet exemple montrent dérive quasi-identiques, il est possible pour sélectionner l'un d'entre eux, dans ce cas bourrelet 2, à utiliser comme référence et soustraire la dérive des autres perles (figure 6G). En ajoutant des marqueurs de référence à un échantillon biologique d'intérêt, il est alors possible de mesurer et de corriger toute dérive lorsque la structure sous-jacente est inconnue ou bien plus variable que celle d'un filament d'actine ou une bille fluorescente.

Facteur de croissance épidermique

Enfin, les cellules HeLa-EGF colorées peuvent être utilisées pour donner un exemple réaliste de la résolution de l'image dans les cellules (Figure 7A, vidéo 10). Ces cellules sont relativement simple de l'image telles qu'elles doivent avoir la majorité de l'EGF-fluorescence dans la mise au point-de-plan sur la surface de la cellule à proximité de la lamelle. La région inférieure lumineux dans le centre correspond à la position du noyau. illumination de la FRBR peut améliorer la qualité de l'image en éliminant fluorescence hors-focus provenant de parties de la cellule membrane pas à proximité de la vitre (environ 150 de pénétration nm dans les cellules). avez dans les régions d'intérêt dans l'image de diffraction limitée sont généralement indistinct (figures 7B et 7C), mais dans les images de super-résolution, il devrait être un mélange de clusters et occasionnels isolés pixels individuels (figures 7D-7F). Ceux-ci représentent soit des récepteurs de l'EGF isolés à la surface cellulaire ou possible d'une petite quantité de liaison non spécifique. Les groupes seront d'environ 100 nm de diamètre et sont susceptibles de correspondre à des fosses et des vésicules formant, la voie par laquelle EGF est principalement régulée à la baisse et endocytose. Les estimations de précision moyennes typiques sont de l'ordre de 20 nm pour ce type d'échantillon avec une limite de précision de l'ordre de 45 nm. Il est à noter que cette mesure de limite de précision de la résolution effective ne prend pas en compte la taille de l'étiquette, ou toute dérive, qui peut être mesurée avec marqueurs fiduciaires, mais est encore noticeable par "queues de comète" sur les grappes ou en utilisant la fonctionnalité de suivi de la boîte comme indiqué sur la figure 6 et décrit dans la section du protocole 8.

Composant	Concentration finale
Catalase	1 pg / ml (50 unités)
Glucose	40 mg / ml
La glucose oxydase	50 pg / ml
Glycérine	12.50%
KCl	1,25 mM
MEA-HCl	100 mM
PTCE	200 uM
Tris	1 mM

Tableau 3. Tampon de commutation

Paramètres d'acquisition typiques	Valeur
La taille du pixel (nm)
Temps d'exposition (ms)	10
Gain	200
Taille d'image (pixels)	128 x 128
Temps de cycle (fps)	52,5
Numéro de vue	10000
640 nm la densité de puissance laser (kW / cm 2)	2

160

Tableau 4. Paramètres d'acquisition

Figure 1. TEMPÊTE reconstruction d'images en utilisant pluie. (A) orage d'ouverture à partir de MATLAB. (B) interface utilisateur graphique de tempête de pluie (GUI). (C) orage avis GUI. (D) Régler la fenêtre de contraste. (E) image STORM après examen et l'ajustement de contraste. (F) Sahistogrammes de mesures de qualité de l'image. (G) des fichiers générés après avoir appuyé sur le bouton enregistrer l'image dans examinateur GUI. Cliquez ici pour agrandir la figure .

(DL) images Figure 2. (A) limitée par la diffraction montrent des concentrations différentes de dextran avant imagerie STORM. Super-résolution (SR) l'image reconstitutions ont une taille de pixel de 25 nm. 10 000 images ont été recueillies avec une taille de pixel de 128 x 128 châssis et cadres individuels sont présentés à partir de cette séquence (2000, 5000, 8000). Acquis avec un temps de 10 ms exposition à 52,5 images par seconde. Les images ont une taille de pixel de 160 nm. Pour la clarté de l'affichage d'un pixel saturation amélioration du contraste de 0,1% a été appliqué en utilisant ImageJ. La précision moyenneestimations sont de 28 nm (haut), 24 nm (moyenne) et 16 nm (bas) pour les différentes images de dextran. Les densités de localisation sont 724 um par ² (élevé), 526 um par ² (moyen) et 13 um par ² (faible). (B) Graphique montrant une moyenne de trois séquences de trames 10 000 de chaque concentration de dextrane. Les barres d'erreur indiquent l'écart type. (C) Graphique traçant le nombre de localisations acceptés par image en utilisant un matériel moyenne de 100 châssis. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3. Mauvais qualité des données Dextran. (A) Diffraction de cadre limité d'une séquence 15.000 cadre STORM. Notez la brume fluorescent diffuse à travers l'image. Ceci est causé par fluoropho res diffusant à travers le milieu. 128 x 128 pixels taille de l'image, un temps de 10 ms exposition et acquises à 52,5 images par seconde. (B) Le même que (A) après que le tampon a été changé. Notez le contraste améliorée fluorophores non liés ont été emportés. (C) une image de reconstruction de super-résolution correspondant à des données collectées dans (A). Taille d'image identique mais avec des pixels de 25 nm. L'estimation de la précision moyenne est de 35 nm. (D) une image de reconstruction de super-résolution correspondant à des données collectées dans (B). Taille d'image identique mais avec des pixels de 25 nm. L'estimation de la précision moyenne est de 30 nm. (E) Graphique traçant le nombre de localisations acceptés par trame, en utilisant un matériel moyenne de 100 châssis. La ligne rouge correspond à la séquence de STORM (A & C) où il ya un bruit de fond élevé. La ligne bleue montre les données correspondant à (B & D), où le fond est faible. (F) Le graphique montre le nombre de localisation accepté pour les images correspondant à élevé (C) et (D) des données de base faible.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" target = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 4. Données actine typique. (AC) images de diffraction limitée de filaments d'actine avant l'addition de tampon et l'imagerie par STORM commutation. Des longueurs variables de filaments peuvent être vus. Filaments très lumineuses sont souvent plusieurs filaments enchevêtrés ensemble. La taille du pixel est de 160 nm. (D) Une image limité par la diffraction d'un seul filament d'actine. (E) image TEMPÊTE (0,1% l'augmentation du contraste appliqué dans ImageJ). Partir d'une séquence de 10.000 cadre avec une taille de pixel de 128 x 128 cadre, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. La taille du pixel est de 16 nm. L'estimation de la précision moyenne est de 16 nm. (F) Graphique traçant le nombre de localisation acceptés par image, en utilisant un matériel moyenne de 100 châssis. (G) Un zoom dans la région du filament d'actine de (E) avant d'opposer amélioration avec un profil de ligne jaune tracée en travers. (H) Une vue de profil de terrain de la ligne jaune tracée à travers le filament d'actine. Généré en ImageJ. (I) Un ajustement gaussien du profil de terrain à l'aide de l'outil d'ajustement de courbe dans ImageJ. L'écart-type, d, a été multiplié par 2,35 pour obtenir une mesure à mi-hauteur de 43,2 nm. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 5. Mislocalized filaments d'actine. (A) actine de filament de diffraction limitée. 160 nm pixels. (B) l'image de tempête de filaments d'actine montré dans (A). Partir d'une séquence de 20.000 cadre avec un pixel Fram 128 x 128taille de e, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. La taille STORM pixel est de 16 nm. Tous les 20 000 cadres ont été traitées. L'estimation de la précision moyenne est de 17 nm. (C) Comme (B) mais avec seulement les 5000 premières trames de la séquence de trames traitées 20000. L'estimation de la précision moyenne est de 18 nm. (D) Comme (B) mais avec seulement les 5000 dernières images de la séquence de 20.000 cadre transformés. L'estimation de la précision moyenne est de 17 nm. (E) Graphique des localisations par des données de trame de plein 128 x 128 pixels vue de cadre.

Figure 6. Déplacement latéral. (A) image STORM d'un filament d'actine reconstruit à partir d'une séquence de 10.000 cadre avec une taille de 64 x 64 pixels cadre, une ms temps 10 d'exposition et pris à 64,6 images par seconde. La taille STORM pixel est de 32 nm. L'estimation de la précision moyenne est32 nm. (B) Une image de STORM affiché en utilisant la fonction «Suivi Box" sous une pluie torrentielle. Localisations sont affichés avec une couleur correspondant au numéro de châssis du moment où elles ont été acquises, par exemple, les localisations de début de la séquence d'acquisition sont en bleu; localisations de la fin de la séquence d'acquisition sont rouges. Les couleurs déplacées indiquent que la dérive s'est produite. (C) Un zoom dans la région de (A) s'affiche en utilisant la fonction Boîte de suivi sous une pluie torrentielle. Les couleurs indiquent déplacées dérive s'est produite. (D) Une image limitée par la diffraction de quatre billes fluorescentes 100 nm, qui peut être utilisé en tant que marqueurs de référence. La taille du pixel de 160 nm. Numéros 1-4 spectacle recadrée et agrandie perles individuellement. (E) Chaque bille fluorescente correspondant à (D) reconstruit en tempête de pluie à partir d'une séquence de 10.000 cadre avec une taille de pixel de 128 x 128 cadre, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. La taille STORM pixel est de 5 nm. L'estimation de la précision moyenne est de 7 nm. (F) correspondant aux perles de (D) et (E),affiché en utilisant la fonction «Suivi Box '. Les couleurs indiquent déplacées dérive s'est produite. (G) Utilisation perle numéro 2 comme référence, billes 1, 3 et 4 sont affichés après la fonction «Soustraire Drift» est utilisé sous une pluie torrentielle. Comparaison avec (E) montre que la dérive latérale a été corrigée. La taille STORM pixel est de 5 nm. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 7. Les données EGF typique. (A) contenant l'image de diffraction limitée de la première partie d'une cellule HeLa concentré à la surface des cellules basales. Cases jaunes indiquent zoom dans les régions d'intérêt indiqués dans (B) et (C). (B) En zoomant diffraction image limitée de la région à proximité du bord de la cellule (zone B). (C) En zoomant limité par la diffraction l'image de la région dans le cadre du noyau (zone C). (D) image STORM correspondant à (A). Partir d'une séquence de 10.000 cadre avec une taille de pixel de 128 x 128 cadre, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. La taille STORM pixel est de 25 nm. L'estimation de la précision moyenne est de 21 nm. (E) image STORM correspondant à la case E (D). (F) image STORM correspondant à la case F (D). (G) des localisations par des données d'image à partir de (D). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Vidéos 1-4. Vidéos correspondent à la figure 2A avec des concentrations variables de dextran: 1 = haute, 2 = moyen, 3 = faible, 4 = pas du tout). 10 000 séquences d'images avec 128 x 128 pixels tailles d'images acquises avec un temps de 10 ms exposition à 52,5 images par seconde. Cliquez ici pour voir la vidéo 1 ,load/50579/50579video2.mov "target =" _blank "> vidéo 2, vidéo 3 , vidéo 4

Vidéos 5-6. Vidéos correspondent à la figure 3 A et B. Vidéo 5 est pré-lavage et Vidéo 6 est post-lavage après fluorophores non liés ont été supprimés. 15 000 séquences d'images en utilisant une taille de pixel de 128 x 128 cadre, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. Cliquez ici pour voir la vidéo 5 , 6 vidéo .

Vidéo 7. Vidéo montrant la séquence du cadre cru qui a été traitée pour générer l'image de STORM figure 4E. 10000 cadre sequence avec une taille de pixel de 128 x 128 cadre, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. Cliquez ici pour voir la vidéo 7 .

Vidéo 8. Vidéo montrant la séquence du cadre cru qui a été traitée pour générer l'image de tempête dans la figure 5B. 20000 séquence d'images avec une taille de pixel de 128 x 128 cadre, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. Cliquez ici pour voir la vidéo 8 .

Video 9. Vidéo montrant la séquence du cadre cru qui a été traitée pour générer l'image de tempête dans la figure 6A. 10000 séquence de trames d'une taille de 64 x 64 pixels de trame, un temps de 10 msec de l'exposition et pris à 64,6 images par seconde. Click ici pour voir la vidéo 9.

Vidéo 10. Vidéo montrant la séquence du cadre cru qui a été traitée pour générer l'image de tempête dans la figure 7D. 10000 séquence d'images avec une taille de pixel de 128 x 128 cadre, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. Cliquez ici pour voir la vidéo 10 .

Discussion

Nous montrons avec quelques échantillons de test simples et l'orage traitement librement accessible logiciel, il est possible d'optimiser STORM super-resolution imaging. Ces outils et méthodes fourniront des points de départ utiles pour les nouveaux utilisateurs et les moyens pour les utilisateurs expérimentés à accroître la confiance dans leurs microscopes et de leur usage pour étudier les structures biologiques et cellulaires avec des détails sans précédent. En utilisant une combinaison d'échantillons avec des structures connues ou bien comprises et un algorithme qui peut produire un certain nombre de paramètres de qualité d'image utiles, telles que les estimations de précision moyenne, le nombre de localisation et des histogrammes montrant qu'il est possible d'améliorer la qualité de l'image et d'avoir une plus grande confiance dans le processus d'imagerie STORM. Il n'y a pas une approche unique à l'acquisition des données, car il ya un certain nombre de configurations différentes de microscope commerciales et l'auto-construction qui peut être utilisé. En outre, il ya beaucoup de préparation de l'échantillon et de l'image acquisition étapes qui peuvent influEnce l'image finale ayant des outils logiciels et des échantillons de test est donc essentielle à la compréhension et l'optimisation STORM qualité d'image.

En outre, ces protocoles peuvent fournir des moyens utiles et moins ambiguës de dépannage des problèmes qui peuvent survenir. Par exemple l'échantillon de dextrane est un moyen très utile pour identifier s'il existe un défaut d'alignement de faisceau laser ou un éclairage irrégulier de l'échantillon. Si l'on craint que le tampon de commutation ne peut être travaille un test visuel très simple pour voir si il ya une «clignotant» aidera. Les filaments d'actine sont un moyen utile de mesurer la résolution en utilisant des comparaisons FWHM tout en soulignant la dérive et une mauvaise localisation des objets. Toutefois, il convient de noter que les méthodes de super-résolution basée à la localisation peuvent être densité fluorophore sensible, nonobstant les autres facteurs, tels que le temps d'exposition, de cadences, des puissances laser et la façon dont l'image est traitée, il est impossible d'assigner une résolution à unenotamment microscope et de supposer que toutes les images auront cette résolution. Ce qui est possible, cependant, est de mesurer les différents aspects de la résolution, tels que des précisions moyen de localisation, numéro de localisation et de la dérive ^27. Même si marqueurs de référence ne peuvent pas être intégrés dans toutes les expériences qu'ils peuvent, au moins, être utilisés pour caractériser un système de microscope, de son environnement et de mieux comprendre les considérations opérationnelles telles que combien de temps est nécessaire pour atteindre l'équilibre thermique après le démarrage. En plus de la correction de la dérive latérale, marqueurs fiduciaires peuvent être utilisés pour caractériser et corriger la dérive axiale, bien que cela nécessite l'utilisation d'une lentille astigmatique et un mécanisme de rétroaction pour corriger la position de l'échantillon, tandis que les images sont en cours d'acquisition ^43. Systèmes de super-résolution commerciaux comprennent généralement une sorte de contrôle de la stabilité ou de se concentrer Mécanisme de verrouillage, qui peut être une solution plus pratique pour corriger la dérive de mise au point.

Il are alternatives à revêtir de façon non spécifique de la vitre avec le dextrane, par exemple en utilisant des colorants ou d'autres molécules directement conjugués, tels que des anticorps secondaires. Une limitation de ces approches est que le nombre de molécules liées à la vitre n'est pas connue. Structures filamenteuses alternatifs qui ont été utilisés comprennent microtubules ²⁸ et l'ADN ^21. Cependant, la combinaison de très petite taille et de réactifs disponibles dans le commerce avantageuses font l'actine une alternative intéressante, en particulier lorsque la distance de séparation de filaments ramifiés ou divergents peut aussi être une mesure utile de la performance du système ^27.

Il ya de la place pour le développement ultérieur des échantillons, malgré les progrès récents dans ce domaine ^28,29,46,47. En particulier, l'imagerie multi-couleur présente un certain nombre de défis dans les 3 principaux aspects de l'imagerie, de l'étiquetage de l'échantillon, l'acquisition de l'image (hardware) et des logiciels (traitement et l'alignement d'image). Il ya un étéun certain nombre de publications traitant de ces aspects ^4-6 et il est donc clair que les échantillons et les méthodes d'essai appropriées sont essentielles pour générer et interpréter de façon fiable ces types d'images. En effet, récemment, il a été montré que dSTORM pourrait être utilisé pour prendre deux images couleur, de et à résoudre, la nature hautement symétrique du complexe du pore nucléaire et les auteurs ont suggéré que ce serait un moyen idéal pour évaluer la performance des corrections d'aberration chromatique ^45. Une autre approche intéressante est l'utilisation de l'ADN origami pour créer un nanoruler, ce qui crée la possibilité de fluorophores de positionnement à des distances sous-diffraction spécifiques intervalle ^46. Cela fournit un moyen de déterminer la résolution et de faire des mesures de distance. Cependant, le but ultime est d'appliquer ces techniques de super-résolution pour échantillons non idéalisées, comme les cellules, qui sont des structures tridimensionnelles complexes. Dans ce cas, une combinaison d'une compréhension plus approfondie de til technique combinée avec des outils logiciels qui aident l'utilisateur dans l'acquisition de données, les traiter de manière appropriée, et fournir des paramètres d'image est susceptible d'être la réponse ultime ^28,29,47,48.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labtek Imaging verre de chambre	Fisher	CBR-166-390E	Préparation d’échantillons
Microscope inversé	Olympus	IX71	* Voir ci-dessous pour les alternatives
Objectif 100 X TIRF Olympus		UAPON 100XOTIRF	* Voir ci-dessous pour les alternatives
Caméra EMCCD	Andor	iXon 897	* Voir ci-dessous pour les alternatives
Laser	640 nmToptica	iBEAM-SMART-640-S	*150 mW - pour l’imagerie Alexa 647 ou Cy5 colorants
LabVIEW	National Instruments		*Logiciel d’acquisition (contrôle du matériel)
PC	Dell		Windows XP (64 bits), processeur Intel Xeon E5420, 16 Go de RAM *Contrôle de l’instrument et traitement d’image
ImageJ			Analyse et traitement d’images http://rsbweb.nih.gov/ij
logiciel Laser	Analytics Group (Cambridge)<		a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources » target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources
MATLAB	Running rainSTORM		http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/
*Exemple de microscopes			Voir aussi référence 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope
*Microscopes commerciaux à super-résolution STORM/PALM Leica	SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives aux microscopes
Table 1. Matériaux & Equipement
[en-tête]
PBS (10X)	Fisher	VX70013065	1 ; 2 ; 3 ; 4
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707	1.1 ; 2.1
Dextran-Alexa fluor 647	Invitrogen	D-22914	1.2
Tampon d’actine général	Cytoskeleton Inc	BSA01	2.2
Filaments d’actine préformés	Cytoskeleton Inc	AKF99	2.2
Phallodin-Alexa fluor 647	Invitrogen	A22287	2.2
Microsphères TetraSpeck (0,1 micron)	Invitrogen	T-7279	3.1
Cellules HeLa	ATCC	CCL-2	4.1
DMEM	Fisher	VX31966021	4.1
FBS	Fisher	VX10500064	4.1
Pen/Step	Invitrogen	15070063	4.1
Plats en plastique	Invitrogen	734-0006	4.1
EGF - Alexa fluor 647	Invitrogen	E35351	4.3
BSA	Sigma	A7906	4.3, 4.4
Formaldéhyde - solution à 10 % grade EM Polysciences		04018-1	4.2
Catalase	Sigma	C100	5.1
Glucose oxydase	Sigma	G2133	5.1
KCl	Sigma	P9541	5.1
TCEP	Sigma	C4706	5.1
Tris	Sigma	93352	5.1
Glucose	Sigma	C7528	5.2
MEA-HCl	Sigma	M6500	5.3
Glycérine	Sigma	G2289	5.1 ; 5.2
Tableau 2. Réactifs