Article de méthode

Isolation Manuel des cellules souches du tissu adipeux de Lipoaspirates humaines

DOI :

10.3791/50585

⸱

26 septembre 2013

 ,  ,  ,  , 
1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

Dans cet article

Résumé

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En 2001, des chercheurs de l'UCLA ont décrit l'isolement d'une population de cellules souches adultes, les cellules appelé ou CSA souches du tissu adipeux, du tissu adipeux. Cet article décrit l'isolement des CSA de lipoaspirates utilisant un protocole de digestion enzymatique manuel à l'aide de la collagénase.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En 2001, des chercheurs de l'Université de Californie, Los Angeles, décrit l'isolement d'une nouvelle population de cellules souches adultes à partir de tissu adipeux que Liposuctioned qu'ils appellent d'abord les cellules de lipoaspirat transformés ou des cellules de l'APL. Depuis lors, ces cellules souches ont été renommés que les cellules souches dérivées de tissu adipeux ou CSA et ont continué pour devenir l'un des plus populaires des populations les cellules souches adultes dans les domaines de la recherche sur les cellules souches et la médecine régénérative. Des milliers d'articles décrivent maintenant l'utilisation des CSA dans une variété de modèles animaux de régénération, y compris la régénération osseuse, réparation des nerfs périphériques et de l'ingénierie cardiovasculaire. Des articles récents ont commencé à décrire la multitude d'utilisations pour CSA dans la clinique. Le protocole indiqué dans cet article décrit la procédure de base pour la main et enzymatique isoler CSA de grandes quantités de lipoaspirates obtenus à partir des procédures cosmétiques. Ce protocole peut être facilement agrandie ou réduite à accommodmangé le volume du lipoaspirat et peut être adapté pour isoler à partir de tissu adipeux ASCs obtenus par plasties abdominales et d'autres procédures similaires.

Introduction

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En 2001, une population présumée de cellules souches multipotentes à partir de tissu adipeux a été décrite dans la revue Tissue Engineering 1. Ces cellules ont été donné le nom de cellules transformés lipoaspirat ou PLA en raison de leur dérivation à partir de tissu de lipoaspirat traités obtenus par la chirurgie esthétique. Le procédé d'isolement décrit dans cet article est basée sur des stratégies existantes enzymatiques pour l'isolement de la fraction stroma vasculaire (SVF) à partir de tissu adipeux 2. Le SVF a été définie comme une transformation minimale population de globules rouges, les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, des pericytes et des pré-adipocytes qui restent encore à adhérer à un substrat de culture de tissus 2, 3. La culture de cette SVF dans le temps est proposé d'éliminer bon nombre de ces populations de cellules contaminantes et entraîner, une population de fibroblastes adhérent. Ces fibroblastes ont été identifiés dans la littérature pour les 40 dernières années comme étant pré-adipocytes. Toutefois, notre groupe de recherche a démontré que ces cellules possédaient mésodermique multipotency et renommés de la population SVF adhérente que les cellules de l'APL. Des études ultérieures par de nombreux autres groupes de recherche ont ajouté à ce potentiel, suggérant à la fois endodermique et potentiels ectodermiques (pour revue, voir 4). Depuis ce temps, de nombreux termes supplémentaires pour ces cellules ont été publiés dans la littérature. Afin de fournir un certain type de consensus, le terme de cellules souches du tissu adipeux ou CSA a été adopté lors de la deuxième conférence annuelle IFATS 2. En tant que tel, l'ASC terme sera utilisé dans cet article.

Le protocole décrit dans cet article est une procédure relativement simple qui nécessite un équipement de laboratoire standard et utilise des réactifs simples, telles que la phospho-solution saline tamponnée, des réactifs de milieux de culture de tissus standard et de la collagénase. Il peut produire un grand nombre de CSA en fonction de la quantité de départ de volume du tissu adipeux et c ultérieurulture temps. Cependant, le traitement d'une telle quantité de tissu adipeux peut présenter certains problèmes physiques qui peuvent être atténués à un degré en utilisant ce protocole. En outre, ce protocole ne nécessite tissus stériles installations de culture et les hottes de biosécurité approuvées, ce qui nécessite l'utilisation d'une installation de culture de tissus approuvé. Cette exigence peut également diminuer l'utilité de la population de l'ASC dans les applications cliniques, sauf s'ils sont isolés dans de bonnes pratiques de fabrication des installations (GMP) approuvés conçus pour l'isolement et l'expansion des matériaux pour une utilisation clinique. Comme alternative, les systèmes automatisés qui peuvent isoler CSA dans un système fermé dans la salle d'opération permettrait d'éviter cette question clé et permettre l'utilisation immédiate des CSA sans qu'il soit nécessaire pour l'expansion in vitro ultérieure. A ce jour, il existe six systèmes automatisés qui sont commercialement disponibles pour l'isolement de cellules à partir de tissu humain. Ces systèmes peuvent permettre d'isoler unnombre important des CSA de grandes quantités de tissu adipeux immédiatement après sa récolte. Ces CSA pourraient alors être réintroduits dans le patient pour une variété de fins de régénération sans que le patient jamais avoir à quitter la salle d'opération. En plus de ce protocole décrivant l'isolement d'emploi des CSA, un protocole pour l'isolement automatique des CSA à l'aide du système Celution est également donnée dans un article associé.

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Protocole

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Le protocole présenté ici décrit l'isolement d'emploi des CSA de lipoaspirates obtenues par des procédures cosmétiques par digestion enzymatique et centrifugation différentielle. Ce protocole a été publiée dans le génie tissulaire de la revue en 2001 1, où les cellules résultantes ont été appelés cellules lipoaspirat transformés ou des cellules de l'APL en raison de leur isolement lipoaspirates. Toutefois, le terme cellule PLA a maintenant été remplacé par le terme de cellules ou CSA pour donner le champ une sorte de conformité en termes de nomenclature souches du tissu adipeux. Les cellules isolées grâce à ce protocole ont été représentés par un grand nombre de posséder un potentiel mésodermique la fois in vitro et in vivo (pour revue voir 4). En outre, les ectodermiques et endodermiques potentiels de l'ASC ont également été explorées 4. La technique d'isolement est simple et directe et nécessite environ une heure à compléter. La cellule résultantes est cultivée dans des conditions de culture de tissu standard. Avec le temps de la culture, la population de l'ASC devient plus homogène, composé de cellules fibroblastiques qui élargissent facilement et présentant une bonne viabilité sur le long terme dans la culture.

Remarque: Les pièces d'équipement qui sont nécessaires suivants sont répertoriés à la fin de cet article. Tous les articles de verrerie, les médias et les réactifs doivent être stérilisés par autoclavage ou par filtration de 0,22 um filtres. Aseptiques techniques de culture de tissus doivent être respectées en tout temps. Pour ce faire, tous les matériaux placés dans l'armoire de biosécurité doivent être stérilisés par pulvérisation d'une solution d'éthanol à 70% et essuyer avec des serviettes en papier propre.

Une. Avant la récolte, préparer la suite de:

  1. 1X stérile phospho-solution saline tamponnée (PBS) pour le lavage des lipoaspirates. Préparer environ 1 L de PBS 1x pour 100 ml de lipoaspirat. Autoclave le PBS et tousow refroidir à température ambiante avant utilisation. En option, l'antibiotique / antifongique peut être ajouté à une concentration finale de: 100 UI / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 2,50 pg / ml d'amphotéricine B, une fois le PBS refroidi.
  2. Stérile de 0,075 à 0,1% collagénase de type IA (à partir de Clostridium histolyticum) pour la digestion enzymatique de la lipoaspirat. La concentration dépend de la qualité et de la source de la collagénase - c.-à-vs brute a été purifiée. Autres types collagénase peuvent être utilisés (par exemple de type de collagénase II ou IV) à des concentrations similaires. Préparer dans du PBS 1x stérile et de filtrage en utilisant un système de filtration de 1 000 ml muni d'un filtre de 0,22 pm (Figure 1A). Toutefois, les bouteilles en verre stérile et munis d'un filtre supérieur de la bouteille peuvent également être utilisés. Préparer et utiliser à température ambiante. solutions de collagénase peuvent être conservées pendant le court terme à 4 ° C jusqu'à utilisation. Ne pas congeler la solution de collagénase comme il peut réduire son activité.
  3. Stérile contrôle moyen (CM) pour la collagénase inactivation et la culture de la population de l'ASC. Pour 500 ml de CM, mélanger ce qui suit: 500 ml de DMEM (4,5 g / L de glucose, L-glutamine), 50 ml de sérum fœtal bovin (inactivé par la chaleur), 5 ml de pénicilline / streptomycine (10 000 UI de pénicilline, 10 000 ug / ml streptomycine). En option, 5 ml d'amphotéricine B (250 pg / ml d'amphotéricine B) peut également être ajouté. La filtration stérile de ce média est nécessaire si les réactifs non-stériles sont utilisés. Placer le CM dans un 37 ° C bain d'eau 30 min avant utilisation pour chauffer le milieu.
  4. Verrerie et vaisselle en plastique stérile pour l'isolation. Autoclave un 1000 ml récipient en verre et laisser refroidir à température ambiante avant utilisation. En outre, avoir le matériel en plastique suivant prêt: pipettes sérologiques aseptique (5 ml, 10 ml et 25 ml), 50 ml des tubes de centrifugation, et des plats de la culture de la culture traitée tissus.

2. Isolement des CSA de Lipoaspirates

La plupart des lipoaspirates sont collectées dans un récipient d'aspiration (voir figure 1B), et peuvent être constituées de trois couches distinctes: 1) une couche supérieure d'huile due à la lyse des adipocytes matures, 2) une couche intermédiaire de tissu adipeux, et 3) un en bas, le liquide contenant une solution saline post ultracentrifugation et de contaminer les types de cellules telles que les globules rouges (hématies). La couche d'huile dessus peut ne pas être présent en quantités importantes. S'il est présent, il doit être aspiré en tant que contamination de l'huile de la culture d'ASC résultant pourrait affecter la viabilité de la culture. Le post ultracentrifugation fond doit être retiré avant le traitement afin de minimiser la contamination des cultures de l'ASC avec les globules rouges. Ceci laissera le milieu, la couche de tissu adipeux, qui sera ensuite lavé et digéré par voie enzymatique pour libérer sa fraction cellulaire, stroma vasculaire (SVF).

  1. Lavage de la lipoaspirat: Ouvrez le conteneur de lipoaspirat dans la culture de tissus hood et décanter soigneusement le lipoaspirat dans un bécher de 1 L en verre stérile. Laisser les couches se séparer de lipoaspirat jusqu'à ce que la couche de tissu adipeux est bien séparé (figure 1B).
    1. Aspirer la couche d'huile (le cas échéant) à l'aide, d'une pipette en verre stérile et la solution saline inférieure post ultracentrifugation en utilisant une pipette sérologique de 10 ml. Cela permettra d'éliminer la grande majorité de la contamination des globules rouges et une solution saline.
    2. Évaluer le volume de la couche de tissu adipeux résultant et ajouter du PBS 1x stérile à un volume égal. Incorporer la aspirer avec la pipette utilisée pour l'aspiration afin de mélanger le lipoaspirat avec le PBS. Laisser les deux couches de s'installer. Comme indiqué plus haut, le PBS 1x peut être complété avec des antibiotiques / antimycosiques.
    3. Aspirer le post ultracentrifugation en utilisant une pipette sérologique de 10 ml.
    4. Poursuivre le lavage de la fraction du tissu adipeux, comme indiqué dans les étapes 2.1.2. et 2.1.3. jusqu'à ce que la couche adipeuse a / couleur d'or jaune. E Aspirere post ultracentrifugation une dernière fois, laissant la fraction du tissu adipeux dans le récipient en verre. Pour assurer une élimination suffisante de la post ultracentrifugation, permettre aux couches de lipoaspirat se déposer pendant 5 min après le dernier lavage et avant l'aspiration finale.
  2. Digestion enzymatique du lipoaspirat: Préparer une solution de collagénase 1A stérile tel que décrit ci-dessus dans une unité de filtre. Préparer un volume égal à celui de la fraction de tissu adipeux et le filtre stérile.
    1. Après filtration de la solution de collagénase, jeter le filtre supérieur, versez délicatement la fraction adipeux lavé dans la solution de collagénase et fermer hermétiquement la bouteille.
    2. Placer le mélange de collagénase / adipeux dans un bain d'eau à 37 ° et de digérer à 37 ° C pendant 30 min. Agitez doucement le mélange collagénase / adipeux chaque 5-10 min et remettez dans le bain d'eau. La couche de tissu adipeux doit prendre une apparence "lisse" (Figure 1B) que les produits de digestion. Temps de digestion supplémentaires (à savoir jusqu'à 2 heures) peuvent être utilisées si la couche de tissu adipeux semble toujours avoir des morceaux solides de la graisse qu'il contient.
  3. Isolation des CSA: Placer le mélange collagénase / adipeux digéré fond de l'armoire de biosécurité. Assurez-vous de stériliser l'unité de filtre avec 70% d'éthanol avant de le remettre dans l'armoire.
    1. Pipette 25 ml de la post ultracentrifugation contenant le SVF dans des tubes de 50 ml à centrifuger stériles.
    2. Ajouter 25 ml de CM à chaque tube. Laisser le CM pour inactiver la collagénase par incubation à température ambiante dans l'armoire pendant 5 min.
    3. Centrifuger pendant 10 min à 1200 x g pour recueillir les SVF comme une pastille.
    4. Dans le cabinet de biosécurité, aspirer le surnageant de chaque tube. Assurer la couche d'huile dessus et des adipocytes flottants sont aspirés avec ce surnageant ( Figure 1B).
    5. Mélanger les granulés SVF dans un tube de centrifugeuse à l'aide de 30 ml CM et répartir également sur ​​deux nouveaux tubes de 50 ml de centrifugeuses. Centrifuger comme à l'étape 2.3.3. et aspirer les surnageants des deux pastilles SVF (non représentées sur la figure).
      FACULTATIF: Si lyse RBC est désiré, la remise en suspension chaque culot SVF dans 10 ml d'un tampon de lyse RBC (160 mM de NH 4 Cl) et incuber à température ambiante pendant 10 min. Centrifuger comme à l'étape 2.3.3. et aspirer le surnageant pour obtenir les pastilles SVF (non représentées sur la figure).
    6. Combiner les deux pastilles SVF dans un nouveau tube de centrifugation en utilisant 5-10 ml CM (figure 1B).
    7. Pour filtrer les particules de tissu plus grandes, pipeter le culot remis en suspension SVF sur un filtre à mailles de 100 um placé sur le dessus d'un nouveau tube de centrifugation de 50 ml et laisser un filtrage par écoulement par gravité.
    8. aliquotes de pipette de la remise en suspension(Et filtrée) pastille de SVF contenant les CSA sur des tissus de culture des boîtes de culture traités. Compléter chaque plat avec un volume approprié de CM.
    9. Culture des cellules de CM pour 3-4 jours à 37 ° C, 5% de CO 2 sans changement de support.

Après cette période de culture initiale, les milieux de culture peut être aspiré et des globules rouges contaminants doucement éliminé par lavage avec 1XPBS stériles. Remplacer par CM et continuer à la culture des CSA au besoin. Le type de boite de culture tissulaire utilisé et la manière dont le culot resuspendu SVF est réparti entre ces plats dépendra du nombre de cellules désirées suivant culture tissulaire classique.

3. Caractérisation de la population de l'ASC: cytométrie en flux et multilignée différenciation

Une fois isolée, la caractérisation de la population ayant une ASC doit être effectuée. Les approches conventionnelles pour cette comprennent cyto d'écoulementmétrie de caractériser le profil des cellules d'antigène CD à la surface cellulaire et dans la différenciation in vitro afin de confirmer leur capacité de différenciation multilignée. Alors que plusieurs lignées peuvent être évalués dans les CSA, ce protocole définit la différenciation des CSA dans les cellules de la adipogénique, ostéogénique et lignées chondrogènes comme un moyen de confirmer le potentiel du mésoderme multilignée 5.

In vitro de lignées multiples différenciation des CSA

  1. La différenciation ostéogénique des CSA: Avant induction, préparer ostéogénique moyen (OM) de la manière suivante: A une bouteille de DMEM 500 ml (4,5 g / ml de glucose) ajouter 25,0 ml de FBS (5,0% concentration finale) et 5,0 ml de pénicilline / streptomycine (10 000 UI / ml et des concentrations finales de 10 000 mg / ml, respectivement). Pour ce faire, ajoutez les agents d'induction ostéogéniques suivants pour obtenir les concentrations finales indiquées: dexaméthasone (0,1 uM final), l'acide L-ascorbique 2-phosphate (50,0 uM finales) Et de β-glycérophosphate (10,0 mM final).
    1. Avant l'induction, de la récolte et de la plaque de culture les CSA dans la boite de culture de tissu souhaitée, de sorte qu'une confluence d'environ 50% est atteint. Pour chaque plat expérimental plaqué, plaque un plat supplémentaire pour un contrôle non induit. nuit de la culture en CM.
      Remarque: 50% de confluence est recommandé, afin de permettre la poursuite de la prolifération qui peuvent se produire au cours de l'induction
    2. Le jour de l'induction, éliminer le milieu et ajoutez la ligne suivante: OM aux ostéogéniques puits expérimentaux souhaités et CM dans les puits de contrôle. Le volume de milieu utilisé dépendra de la taille de la boîte de culture tissulaire. Pour 12 plats ainsi, 1,0 ml de milieu par puits est suffisant. Pour 6 plats ainsi, 2,0 ml de milieu par puits est suffisant. Pour des boîtes de 100 mm, 10,0 ml de milieu par boîte devraient être utilisés.
    3. Culture des cellules pour un minimum de 14 jours avec des changements du milieu approprié chaque 3-4jours. Populations ASC très ostéogéniques peuvent montrer des signes de dépôt minéral extracellulaire dès 7 jours induction.
    4. Différenciation ostéogénique (ie dépôt minéral extracellulaire) peut être confirmé en utilisant une coloration de von Kossa histologique de phosphate de calcium. Cette tache va produire un précipité brun-noir identification de la présence de phosphate de calcium extracellulaire (voir figure 2).
      Pour colorer avec le réactif von Kossa:
      1. Retirer le OM à partir des cellules expérimentales et la CM de cellules témoins
      2. Fixer les cellules pendant 60 minutes dans 4,0% paraformaldéhyde préparé en 1x PBS.
      3. Laver les cellules deux fois avec du PBS 1X.
      4. Incuber les cellules avec 2,0% de nitrate d'argent (préparé dans de l'eau) dans l'obscurité pendant 30 min.
      5. Retirez le nitrate d'argent, laver deux fois avec de l'eau distillée et sécher à l'air les cellules.
      6. Exposer les cellules à une lumière UV pendant 60 min à développer le calcalcium phosphate précipité.
      7. Laver les cellules à plusieurs reprises avec 1XPBS.
      8. Contre-colorer la cellule avec de l'hématoxyline, si désiré.
  1. La différenciation adipogène des CSA: Avant induction, préparer Adipogenic moyenne (AM) de la manière suivante: A une bouteille de DMEM 500 ml (4,5 g / ml de glucose) ajouter 50,0 ml de FBS (10,0% de concentration finale) et 5,0 ml de pénicilline / streptomycine (10 000 UI / ml et 10 000 pg / ml des concentrations finales, respectivement). Pour ce faire, ajoutez les agents d'induction adipogéniques suivantes pour donner les concentrations finales indiquées: dexaméthasone (1,0 uM final), 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX - 0,5 mM final), l'indométacine (0,2 mM final) et l'insuline (10,0 uM finale ).
    1. Avant l'induction, de la récolte et de la plaque de culture dans les ASCs la boîte de culture de tissu souhaitée, de sorte qu'une confluence d'environ 80% est atteint. Pour chaque plat expérimental plaqué, plaque un plusplat al pour un contrôle non induit. . Culture d'une nuit en CM Note: la différenciation des CSA Adipogenic semble être plus efficace à une augmentation de la confluence.
    2. Le jour de l'induction, éliminer le milieu et ajoutez la ligne suivante: AM pour les ostéogéniques puits expérimentaux souhaités et CM dans les puits de contrôle. Le volume de milieu utilisé dépendra de la taille de la boîte de culture tissulaire. Pour 12 plats ainsi, 1.0.ml des médias par puits est suffisant. Pour 6 plats ainsi, 2,0 ml de milieu par puits est suffisant. Pour des boîtes de 100 mm, 10,0 ml de milieu par boîte devraient être utilisés.
    3. Culture des cellules pour un minimum de 14 jours avec des changements du milieu approprié tous les 3-4 jours. Populations ASC très adipogéniques peuvent montrer des signes de formation de vacuole lipidique dès 7 jours induction.
    4. CSA en cours de différenciation adipocytaire développeront plusieurs vacuoles lipidiques qui peuvent être facilement visualisés au microscope optique. En outre, la différenciation adipocytaire peutêtre confirmée en utilisant une tache histologique Oil Red O qui va s'accumuler dans ces vacuoles (voir la figure 2).
      Pour colorer avec de l'huile rouge O:
      1. Retirez le support de cellules expérimentales et de contrôle et les fixer pendant 60 minutes en utilisant un fixateur formelle de calcium à 10%. Pour préparer ce fixateur, combiner la suivante: eau 1,0 g de CaCl2, 25,0 ml 16% de paraformaldéhyde (4,0% final) et 75,0 ml d'eau distillée.
      2. Laver les cellules deux fois avec du PBS 1X.
      3. Laver les cellules brièvement avec 70% d'éthanol.
      4. Incuber les cellules à température ambiante pendant 5 min avec la solution Oil Red O. Pour préparer la solution Oil Red O, dissoudre 2,0 g de Oil Red O poudre dans 50,0 ml de 70% d'éthanol et 50,0 ml d'acétone.
      5. Laver les cellules avec 70% d'éthanol et ensuite avec de l'eau du robinet.
      6. Visualiser les cellules peu après coloration due à la décoloration de la tache avec le temps.
  1. La différenciation chondrocytaire des CSA: la différenciation chondrocytaire est réalisée par une technique de culture à haute densité dénommé «culture de micromasse". Avant la culture, de préparer Chondrogène moyen (CHM) de la manière suivante: A une bouteille de DMEM 500 ml (4,5 g / ml de glucose) ajouter 5,0 ml de FBS (1% concentration finale) et 5,0 ml de pénicilline / streptomycine (10 000 UI / ml et 10 000 pg / ml des concentrations finales, respectivement). Pour ce faire, ajoutez les agents d'induction chondrogènes suivants pour obtenir les concentrations finales indiquées: L-ascorbique-2-phosphate (50,0 pg / ml final), insuline (6,25 pg / ml final), la transferrine (6,25 pg / ml final) et TGFβ1 (10,0 ng / ml).
    1. Récolter les ASC et centrifuger pendant 5 min à 1200 x g pour sédimenter les cellules. Compter les cellules pour déterminer la densité de la suspension de cellules.
    2. Pour préparer les granules de micromasse, préparer deux suspensions de cellules: une suspension expérimental préparé dans ChM à une densité de 1 x 10 7 celluless / ml et une suspension témoin préparé en CM à une densité de 1 x 10 7 cellules / ml.
      1. Placer 10,0 pi "gouttelettes" de la suspension cellulaire dans des puits individuels d'une antenne multi-puits. Laisser adhérer pendant 2-3 heures à 37 ° C.
      2. Superposer délicatement les gouttelettes plaqués avec soit ChM ou CM en faisant attention de ne pas dissocier les cellules.
      3. Culture des cellules pour jusqu'à 14 jours dans ChM ou CM avec des changements dans le milieu tous les 3-4 jours. Les cellules cultivées en CHM condenser sur ce temps pour former un culot micromasse à haute densité, avec peu ou pas de cellules en une monocouche environnante. Les cellules témoins cultivées ne subiront pas cette condensation et beaucoup seront trouvés en monocouche.
      4. Pour confirmer chondrogénèse, fixer les boulettes pendant 15 min à 4.0% de paraformaldéhyde (préparés 1x PBS) à température ambiante. Colorer la présence de protéoglycanes sulfatés en utilisant un bleu histologique tache Alcian.
        Pour colorer en utilisant Bleu Alcian:
        1. Laver le paraformaldehyde-fixe granulés une fois dans 1 x PBS.
        2. Incuber les pastilles dans du HCl 0,1 N (pH 1,0) pendant 5 min pour réduire leur pH.
        3. Retirez le HCl et ajouter 1% de réactif bleu Alcian (préparé dans HCl 0,1 N, pH 1,0). Incuber pendant 30 min à température ambiante.
        4. Retirez le réactif bleu Alcian et laver les pastilles avec HCl 0,1 N (pH 1,0) pour éliminer l'excès de colorant.
        5. Lavages supplémentaires avec de l'eau du robinet peuvent être utilisés pour réduire la coloration de fond.
        6. En variante, les pastilles de micromasse peuvent être récoltées, fixées pendant une nuit dans du formol à 10%, noyés dans de la paraffine et des sections colorées pour le Bleu Alcian.

4. La caractérisation par cytométrie en flux des CSA

Caractérisation du profil d'antigène CD à la surface cellulaire peut être réalisée par l'intermédiaire cytométrie en flux conventionnels.

  1. Préparation du CSA pour la cytométrie en flux: Avantà l'analyse, préparer une cytométrie en flux de la mémoire tampon (FCB) constitué des éléments suivants: 1,0% de BSA, 2,0% de FBS et 0,025% de saponine préparé dans du PBS 1x.
    1. Récolter les ASC et centrifuger les cellules pendant 5 min à 1200 xg pour produire une pastille.
    2. Remettre en suspension les cellules dans 1XPBS stérile et compter les cellules en utilisant un hématimètre. Déterminer la densité cellulaire de la suspension.
    3. Diviser la suspension jusqu'à en aliquotes de 5 x 10 5 cellules totales et centrifuger pour sédimenter.
    4. Retirer le surnageant PBS et fixer les cellules pendant 60 min à -20 ° C avec un excès de glace-éthanol à 70% froid. Si nécessaire, ces cellules peuvent être stockées dans cet éthanol à 70% dans un congélateur à -20 ° C jusqu'à utilisation.
    5. Après la fixation, aspirer délicatement la éthanol et laver délicatement le culot deux fois avec un excès de FCB. Pour laver:
      1. Ajouter un excès de FCB et remettre délicatement le culot.
      2. Centrifuger pendant 5 min à 1200 xg pour recueillir les cellules unesa pastille.
      3. Aspirer délicatement le surnageant FCB.
      4. Répétez.
    6. Retirez la finale surnageant de lavage de FCB de chaque aliquote et remettre en suspension dans 100 ul de FCB. Ajouter l'anticorps primaire conjugué à un fluorochrome désirée en utilisant la dilution suggéré par le fabricant. Incuber les cellules sur de la glace avec l'anticorps pendant 30 minutes.
      Remarque: si des anticorps conjugués à un fluorochrome primaires ne sont pas disponibles, les anticorps primaires non conjugués peuvent être utilisés.
    7. Pour chaque fluorochrome utilisé (par exemple FITC, PE), incuber une partie aliquote de cellules avec 100 ml contenant FCB IgG isotype en tant que témoin négatif.
    8. Incuber une aliquote de 100 ml contenant FCB aucun anticorps comme un contrôle supplémentaire.
    9. Laver chaque aliquote de cellules deux fois avec FCB comme indiqué à l'étape 4.1.5. Après le dernier lavage, remettre en suspension les aliquotes dans 100 ml de FCB et procéder à l'analyse des flux.
      Remarque: si des anticorps primaires non conjugués ont été utilisés: la suite de cette étape de lavage à incuber les échantillons sur de la glace pendant 20 min avec FCB complétée avec l'anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome approprié en utilisant la dilution suggéré par le fabricant. Laver deux fois, comme indiqué à l'étape 4.1.5.
  2. Analyse des flux de CSA: Pour l'analyse des flux, un minimum de 10 000 événements devrait être prise en compte. Contrôles non colorées et isotype devraient être utilisés pour définir portes par diffusion vers l'avant (FSC) et la diffusion latérale (SSC). Pour cela, les pas de contrôle des anticorps (c'est à dire non colorés de l'étape 4.1.8) doivent être utilisées afin d'éliminer les débris et les CSA mortes. Les contrôles IgG isotype de l'étape 4.1.7. devraient être utilisées pour établir des zones de fluorescence positive.

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Résultats

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Le contour du protocole décrit ci-dessus, un procédé enzymatique manuel pour l'isolement d'un SVF à partir d'un grand échantillon de lipoaspirat de volume. Dans ce SVF sont nombreuses populations de cellules, y compris l'ASC. De nombreuses études suggèrent que la culture de cette SVF dans des conditions de culture de tissus standards choisira pour une population de fibroblastes adhérent susceptible d'être composé principalement de type ASC. Conformément à cela, nous avons montré, en utilisant la cyto...

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Discussion

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Le tissu adipeux pour l'isolement des CSA peut prendre de nombreuses formes: à partir de morceaux de tissus solides obtenus par résection ou lipoplasty de petits morceaux obtenus soit par extraction de la seringue ou lipoplastie assistée par aspiration (c'est à dire la liposuccion). Que plus de cellules SVF (et donc CSA) peuvent être obtenus à partir d'échantillons de tissu adipeux résection ou aspiration n'est pas clair que les études contradictoires ont été présentées 16, 17. Il est...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs de ce manuscrit sont co-inventeurs sur un brevet détenu par les Régents de l'Université de Californie et autorisé à Cytori Therapeutics.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier les personnels de recherche supplémentaires qui ont contribué à l'élaboration du protocole décrit et son isolement du CSA, y compris: le Dr H. Peter Lorenz, MD, le Dr Hiroshi Muzuno, MD, le Dr Jerry Huang, MD , le Dr Adam Katz, MD, le Dr William Futrell, MD, le Dr Zhang Rong, DDS, PhD, le Dr Larissa Rodriguez, MD, Dr. Alfonso Zeni, PhD, et le Dr John Fraser, PhD. Les résultats présentés ont été financés, en partie, par des subventions de recherche des Instituts nationaux de la santé, y compris les NIAMS et NIDCR Instituts.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
réactif
DMEM (Dulbecco’ ; s Modification de Eagle’ ; s Medium)Mediatech Cellgro10-013-CVavec 4,5 g/ml de glucose, L-glutamine, pyruvate de sodium
Pénicilline/StreptomycineMediatech Cellgro30-002-CI10 000 UI/ml de pénicilline/10 000 μ ; g/ml streptomycine
Amphotéricine BMediatech Cellgro30-003-CF250 μ ; g/ml amphotéricine B
10X PBS (solution saline tamponnée au phospho)Mediatech Cellgro25-053-CIsans calcium, sans magnésium
Trypsine/EDTAMediatech Cellgro20-031-CV0,25 % trypsine/2,21 mM
EDTA Collagénase de type IA (de Clostridium histolyticum)SigmaC2674préparation brute ; < 125 unités de digestion de collagène/mg solide
FBS (Fetal Bovin Serum) inactivé à la chaleurGemini Bioproducts100106source USDA, inactivées à la chaleur
Pipettes sérologiques de 10 mlGenesee Scientific12-104
Pipettes sérologiques de 25 mlGenesee Scientific12-106
Tubes à centrifuger en polypropylène de 50 mlGenesee Scientific21-106
Boîtes de culture tissulaire de 100 mmGenesee Scientific25-202
Boîtes de culture tissulaire de 150 mmGenesee Scientific25-203
500 ml Unités de filtration StericupMembrane MilliporeSCGPU05REPES, 0,22 μ ;
crépines à cellulesFisherBrand22-363-549100 μ ; m maille de nylon
dexaméthasone - soluble dans l’eauSigmaD-2915
Acide L-ascorbique 2 phosphateSigmaA-8960
β ;-glycérophosphate sel disodique SigmaG-9422également connu sous le nom de glycérophosphate
insuline SigmaI-6634fabriqué à partir de pancréas bovin
indométacineSigmaI-7378
apo-transferrinSigmaT-4382
TGFβ ; 1R& D Systems240-B-002recombinant humain
Rouge d’huile OSigmaO-0625
Bleu alcienSigmaA-5268
Nitrate d’argentSigmaS-0319
Acide chlorhydriqueFisher ScientificA144
ParaformaldéhydeFisher Scientific30525-89-4fourni en stock
[en-tête]
Équipement nécessaire
Classe II A/B Cagoule de biosécuritéThermo Scientifics’assure que la hotte dispose de conduites de vide pour l’aspiration
Centrifugeuse de paillasseHermle LabnetZ383Rotor pivotant pour tubes de 50 ml requis, capable de 1200xg
Bain-marie Fisher Scientific IsotempS52602Qcapacité de 5-10L, capable de 37C
Aides à la pipette automatiséesDrummond Pipette Aid XL4-000-105
CO2Incubateur Thermo ScientificForma 310à chaleur directe ou à l’eau
à pores m à 16 %

Références

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Fraction vasculaire stromaleDigestion la collag naseLavage du lipoaspiratIsolation cellulaireProtocole de centrifugationCulture tissulaireEssais de diff renciationLignages adipog niqueost og nique et chondrog nique

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