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Isolement, la purification et l'étiquetage des neutrophiles osseuse de souris de moelle pour les études fonctionnelles et expériences de transfert adoptif

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DOI :

10.3791/50586

⸱

10 juillet 2013

 , 
1Fungal Pathogenesis Unit, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole pour l'isolement et la purification des neutrophiles de la moelle osseuse de souris par centrifugation de gradient de densité et de neutrophiles étiquetage utilisant des colorants CellTracker. Cela représente une méthode simple, rapide, reproductible et économique pour obtenir un grand nombre de neutrophiles pour des études fonctionnelles en aval ou des expériences de transfert et de suivi adoptifs.

Résumé

Les neutrophiles sont des cellules effectrices critiques du système immunitaire inné. Ils sont rapidement recrutés dans les sites d'inflammation aiguë et exercent des effets protecteurs ou pathogènes en fonction du milieu inflammatoire. Néanmoins, en dépit du rôle indispensable des neutrophiles dans l'immunité, la compréhension détaillée des facteurs moléculaires qui interviennent effets effectrices et immunopathogène de neutrophiles dans différentes maladies infectieuses et les affections inflammatoires qui manque encore, en partie en raison de leur courte demi-vie, les difficultés de manipulation de ces cellules et du manque de protocoles expérimentaux fiables pour obtenir un nombre suffisant de neutrophiles pour des études fonctionnelles en aval et des expériences de transfert adoptif. Par conséquent, des méthodes simples, rapides, économiques et fiables sont hautement souhaitables pour récolter un nombre suffisant de neutrophiles de souris pour évaluer les fonctions telles que la phagocytose, le meurtre, la production de cytokines, la dégranulation et la traite. À cette fin,Nous présentons une densité protocole centrifugation basée reproductible gradient, qui peut être adapté à n'importe quel laboratoire d'isoler un grand nombre de neutrophiles à partir de la moelle osseuse de souris avec une grande pureté et sa viabilité. En outre, nous présentons un protocole simple qui utilise des colorants CellTracker d'étiqueter les neutrophiles isolés, qui peuvent ensuite être adoptive transférés dans des souris receveuses et suivis dans plusieurs tissus pendant au moins 4 heures post-transfert en utilisant la cytométrie de flux. En utilisant cette approche, le différentiel étiquetage des neutrophiles des souris de type sauvage et le gène déficient avec différents colorants CellTracker peut être employée avec succès pour réaliser des études de repeuplement compétitifs pour évaluer le rôle direct de gènes spécifiques dans le trafic des neutrophiles dans le sang dans les tissus cibles in vivo .

Introduction

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants chez les humains. Ils sont la principale composante cellulaire du système immunitaire inné et agissent comme première ligne de défense contre les micro-organismes envahisseurs. Les patients présentant une neutropénie acquise et immunodéficiences primaires qui affectent nombre de neutrophiles et / ou la fonction développent des infections bactériennes et fongiques invasives potentiellement mortelles, en soulignant l'importance de ces cellules en défense de l'hôte 1. Reconnaissance immunitaire des pathogènes envahissants sur le site de l'infection par leurs parentes de reconnaissance des formes récepteurs résulte en l'induction d'une orchestrée réponse immunitaire innée, ce qui conduit à une sécrétion de chemoattractants qui génèrent un gradient chimiotactique capable de recruter des neutrophiles de la circulation sanguine dans les tissus enflammés 2 . Après neutrophiles entrer dans le site de l'infection, ils deviennent activées, ce qui conduit à des cytokines et chimiokines production, l'absorption des agents pathogènes, et tuant par moi oxydative et non oxydativecanismes 3. Outre leur rôle bien connu dans l'immunité innée, neutrophiles ont également été montré récemment à jouer des rôles importants comme initiateurs de réponses immunitaires adaptatives efficaces 4. D'autre part, en dehors de leur rôle de protection de l'immunité, les neutrophiles peuvent également arbitrer des lésions tissulaires et immunopathologie due à l'accumulation excessive et / ou l'activation des sites d'inflammation, comme le montre une variété de maladies infectieuses et auto-immunes 5-7.

En dépit du rôle indispensable des neutrophiles dans le montage réponses immunitaires innées efficaces et leurs fonctions effectrices pléiotropiques dans plusieurs maladies infectieuses et les affections inflammatoires, les difficultés techniques avec la manipulation de ces cellules et l'absence de protocoles expérimentaux fiables a entravé la recherche avec des neutrophiles au cours des dernières décennies. Par conséquent, l'utilisation de tests reproductibles pour l'isolement des neutrophiles devrait faciliter la recherche sur médiée par les neutrophiles immunologiquesgique fonctions ex vivo et in vivo. A ce jour, plusieurs méthodes ont été décrites pour l'isolement de cellules neutrophiles telles que centrifugation en gradient de densité du sang humain et du sang de souris ou de moelle osseuse 8,9, enrichissement immunomagnétique positif ou négatif des neutrophiles à partir de sang de la souris ou de moelle osseuse 10,11, et la récolte des neutrophiles de la cavité péritonéale de souris après injection intrapéritonéale de thioglycollate ou d'autres agents anti-inflammatoires 12. Bien que les neutrophiles peuvent être facilement isolés en grand nombre à partir de sang humain, cette méthode n'est pas optimale chez la souris en raison du volume limité de sang de souris qui empêche l'isolement des neutrophiles suffisantes pour des études fonctionnelles ou des expériences de transfert adoptif 13. En outre, bien que le rendement de thioglycolate cellules de la cavité péritonéale est supérieure par rapport à celle du sang de la souris, la pureté des neutrophiles dans le lavage péritonéal inflammatoire varie entre60 à 90%, et les neutrophiles isolées présentent un phénotype activé. Ainsi, les cellules recueillies en utilisant cette méthode ne peut être utilisée pour effectuer des études fonctionnelles activé mais pas de neutrophiles non stimulés, comme la cavité péritonéale de souris a peu de neutrophiles à l'état stationnaire 12. Au lieu de cela, la moelle osseuse est un réservoir commode pour récolter un grand nombre de neutrophiles soit non stimulés ou activés 11,14, qui peuvent ensuite être utilisés pour des études fonctionnelles en aval tels que la phagocytose, le meurtre et la dégranulation, ou pour le transfert adoptif dans des souris receveuses.

Ici, nous décrivons un moyen simple et rapide (~ 2 h), ce qui présente un rendement élevé (~ 6-12 × 10 6 neutrophiles / souris non infectées, soit jusqu'à 30-40 × 10 6 neutrophiles / souris infectées) de pur (80 -95%) avec les neutrophiles> 95% la viabilité de la moelle osseuse. Cette méthode utilise Histopaque disponible dans le commerce, qui sont séparés densité cellulaire de gradientmédias de rations composées de Ficoll et diatrizoate de sodium, afin de séparer les neutrophiles de la moelle osseuse de souris. Cette méthode donne beaucoup plus grand nombre de neutrophiles par la souris par rapport au sang ou à cavité péritonéale, il peut être utilisé pour collecter des neutrophiles de souris à la fois à l'état d'équilibre ou après l'infection, et il est plus facile de couche par rapport à la méthode de centrifugation de gradient de densité qui utilise discontinue gradients de Percoll composé de 55% / 65% / 75% Percoll dans PBS 9. En outre, le temps et les ressources nécessaires pour recueillir les neutrophiles purs sont sensiblement diminué par rapport à l'isolement des neutrophiles par tri cellulaire activé par fluorescence. Aussi, parce que cette méthode n'implique pas une étape d'enrichissement immunomagnétique, il est plus rentable, et il évite l'exposition des cellules à la colonne magnétique et des anticorps, diminuant ainsi la probabilité d'activation des neutrophiles.

En plus d'effectuer des études fonctionnelles de neutroph isoléILS ex vivo et le transfert adoptif de cellules dans des souris receveuses, ce protocole décrit également un procédé de marquage des neutrophiles isolés à l'aide de différents colorants CellTracker. Différentiel étiquetage des neutrophiles des souris de diverses origines génétiques peut être adapté à des études de repeuplement compétitifs pour le suivi des neutrophiles transférés dans les tissus des souris receveuses par cytométrie en flux, qui peuvent fournir une approche mécanistique sur le rôle direct de gènes spécifiques dans le trafic des neutrophiles dans le sang en cibles organes enflammés 6.

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Protocole

1. Isolement de souris cellules de moelle osseuse

  1. Euthanasier les souris en utilisant le protocole de soin des animaux de l'institution comité approuvé et vaporiser la surface des animaux avec de l'éthanol à 70%.
  2. Faire une incision de la peau dans le milieu de l'abdomen et enlever la peau de la partie distale de la souris, y compris la peau qui recouvre les extrémités inférieures.
  3. Coupez les muscles des membres inférieurs à l'aide de ciseaux et disloquer soigneusement le cotyle de la hanche, tout en évitant de se casser la tête du fémur.
  4. Supprimer les muscles restants du fémur et le tibia à l'aide d'un scalpel, ciseaux et séparer le fémur du tibia au soin d'exercer l'articulation du genou pour ne pas casser les extrémités de l'os. Placez les os dans une boîte de Pétri contenant de la glace-froid RPMI 1640 1X supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine.
  5. Procédez aux étapes suivantes sous une hotte de culture de tissus. Prendre des précautions supplémentaires pour maintenir techniques stériles strictes pour éviter neutrophil activation.
  6. Rincez chaque os avec de l'éthanol à 70% (dans une boîte de Pétri), suivie de trois lavages ultérieurs glacée PBS stérile (dans les boîtes de Pétri) pour se rincer l'éthanol à partir de la surface des os.
  7. L'intérieur d'une boîte de Pétri stérile propre, couper les épiphyses des os et garder de côté.
  8. Utiliser une aiguille de calibre 25 et une seringue de 12 cc remplie de RPMI complété avec 10% de FBS et 2 mM EDTA, et vider les cellules de moelle osseuse des deux extrémités des arbres d'os sur une vis en haut tube Falcon de 50 ml muni d'un 100 um filtrer. Afin d'éliminer efficacement toutes les cellules, gratter la surface interne de l'os à l'aide de l'aiguille de calibre 25.

NOTE: Le blanchiment des os indique que les cellules ont été suffisamment gratté.

Remarque: Utilisez environ 10 ml de milieu pour vider un fémur / tibia paire. Ajout d'EDTA au milieu est essentiel pour empêcher l'agglutination des cellules.

  1. Couper les épiphyses des osdans les petites 0,5-1 mm 3 pièces avec un scalpel et les écraser à travers le filtre 100 um en utilisant l'extrémité arrière d'une pointe de pipette Biopur ml Eppendorf Combitip Plus 2.5.
  2. Centrifuger à 1400 rpm pendant 7 min à 4 ° C.
  3. Lyse des globules rouges par la remise en suspension du culot cellulaire dans 20 ml de NaCl 0,2% pendant environ 20 secondes puis on ajoute 20 ml de NaCl 1,6%. (Critique: Ne pas dépasser 20-30 sec de lyse hypotonique pour éviter la mort des cellules de la moelle osseuse L'utilisation de hypotonique NaCl pour la lyse est recommandé au tampon de lyse ACK parce que ce dernier a la possibilité d'activer les neutrophiles.).
  4. Centrifuger pendant 7 min à 1400 rpm à 4 ° C à recueillir les cellules.
  5. Laver les cellules avec RPMI 1640 1X supplémenté avec 10% de FBS et 2 mM EDTA et centrifuger comme à l'étape 1.12.
  6. Le rendement des cellules de moelle osseuse à l'aide de cette méthode est d'environ 60 à 80 millions par infectées 8-12 semaines, âgé de souris C57BL / 6.

2. Séparation des neutrophilespar centrifugation en gradient

  1. Compter les cellules de la moelle osseuse et remettre en suspension dans 1 ml de PBS glacé stérile.
  2. Ajouter 3 ml de Histopaque 1119 (densité 1.119 g / ml) dans un tube conique de 15 ml.
  3. Overlay 3 ml de Histopaque 1077 (densité 1,077 g / ml) sur la 3 ml de Histopaque 1119.

NOTE: Histopaque 1119 Histopaque 1077 doivent être chauffés à 18-26 ° C avant utilisation.

Etape critique: Préparer gradients immédiatement avant l'utilisation que la préparation du gradient à l'avance se traduira par diffusion entre les deux couches et la pureté des neutrophiles optimale et la récupération.

Etape critique: Superposition Histopaque 1077 sur 1119 doit être fait lentement afin d'éviter le mélange des deux densités, ce qui empêchera la séparation des cellules pendant la centrifugation.

  1. Superposez la suspension de cellules de la moelle osseuse au-dessus de la Histopaque 1077.

Etape critique: Overlaying la suspension de cellules de la moelle osseuse au cours Histopaque 1077 doit être fait lentement, afin d'éviter de perturber l'interface entre les cellules et Histopaque 1077.

NOTE: La remise en suspension des cellules de moelle osseuse provenant d'une souris non infectées dans 1 ml de PBS donne la pureté de neutrophiles> 90%. Toutefois, la mise en commun de nombreux échantillons de moelle osseuse compromet la pureté des neutrophiles, par exemple, la remise en suspension 300 x 10 6 cellules dans 3 ml de PBS réduit la pureté des neutrophiles à partir de> 90% à environ 80%. Par conséquent, les enquêteurs devraient procéder à des expériences pilotes visant à identifier les comptage / volume conditions cellulaires idéales pour leurs expériences spécifiques

  1. Centrifugeuse pendant 30 min à 2000 rpm à 25 ° C sans frein.

NOTE: La centrifugation de gradient à la température ambiante est crucial et essentiel pour la séparation effective des neutrophiles.

  1. Recueillir les neutrophiles à l'interface de la Histopaque 1119 Histopaque 1077 couches.
  2. Laver les neutrophiles collectés deux fois avec RPMI 1640 1X supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine et centrifuger à 1400 rpm pendant 7 min à 4 ° C.
  3. Comptez le nombre de neutrophiles et de déterminer leur viabilité.

NOTE: Les neutrophiles sont typiquement> 95% viable et pureté> 90%, tel que déterminé par analyse FACS. Le rendement typique des neutrophiles dans la moelle osseuse (soit 2 fémur et du tibia os 2) d'un non infecté 8-12 semaines, âgé de souris C57BL / 6 cellules est ~ 6 à 12 millions. Ce nombre est sensiblement plus grande lorsque les neutrophiles sont récoltées à partir de la moelle osseuse des animaux infectés. Par conséquent, ~ 30-40 millions de neutrophiles / souris ont été récupérés chez des souris infectées par Candida ont été utilisés pour la récolte de 6 cellules.

3. Étiquetage des neutrophiles utilisant des colorants CellTracker

  1. Reprendre les neutrophiles à 5 x 10 6 cellules / ml dans PBS préchauffé à 37 ° C.
  2. Ajouter un colorant CellTracker à une concent finaleration de 5 pm.

NOTE: CellTracker Green (CMFDA (5 Chloromethylfluorescein Diacetate) et CellTracker Orange (CMTMR (5 - (et-6)-4-Chlorométhyl tétraméthylrhodamine Amino benzoyle) a été utilisé dans ce protocole d'étiqueter différemment neutrophiles de type sauvage et le gène déficient souris.

NOTE: Préparer une solution stock de 10 mM de CellTracker vert et CellTracker Orange, aliquote et conserver à -80 ° C jusqu'à ce que le jour de l'expérience.

  1. Incuber neutrophiles avec 5 M de la teinture CellTracker correspondant pendant 10 min à 37 ° C dans un bain d'eau agité dans l'obscurité.
  2. Laver les cellules deux fois avec de la glace-froid RPMI 1640 1X supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine.

NOTE: Un lavage efficace des cellules après l'étape de marquage avec du colorant CellTracker est essentielle pour éviter la contamination croisée colorant avant de mélanger les populations de neutrophiles différemment marquées pour dépréciationsétudes de repeuplement compétitifs tream.

4. Le transfert adoptif de neutrophiles chez la souris et analyse des neutrophiles transférés par cytométrie en flux

  1. Neutrophiles remettre en suspension dans PBS glacé à une concentration de 25 x 10 6 cellules / ml et injecter 200 pi de la suspension dans la veine caudale latérale de sorte que 5 x 10 6 neutrophiles sont transférés par souris. Pour les études concurrentielles de neutrophiles de repeuplement, mélanger neutrophiles de type sauvage et le gène déficient à un ratio de 1:1 et injecter un total de 5 x 10 6 neutrophiles par souris comme ci-dessus.

NOTE: Au moins jusqu'à 10 x 10 6 neutrophiles peuvent être adoptive transférés par souris sans toxicité évidente immédiate chez les animaux.

  1. À différents moments après le transfert adoptif (par exemple 1, 2, 3 ou 4 heures post-transfert), euthanasier les souris et du sang de récolte et / ou de la moelle osseuse et / ou un autre organe cible (s) d'intérêt.
  2. Préparer sisuspensions cellulaires NGLE de ces tissus pour l'analyse quantitative et qualitative des neutrophiles marquées par transfert adoptif utilisant des protocoles publiés 6,15.
  3. Après la coloration vivants / morts viabilité et le blocus Fc, les cellules d'étiquettes avec CD45 (clone 30-F11), Ly6G (clone 1A8) et CD11b (clone M1/70) et porte sur Live CD45 + Ly6G + CD11b + neutrophiles. Neutrophiles dans cette porte comprennent les neutrophiles natifs de la souris receveuse ainsi que les neutrophiles marquées par transfert adoptif, qui sont FITC + (si étiqueté avec CellTracker vert) ou PE + (si étiqueté avec la revue Cell Tracker orange).

NOTE: Les neutrophiles peuvent être suivis dans le sang, la moelle osseuse et les reins des souris infectées par Candida pendant au moins 4 heures post-transfert.

NOTE: Fixation avec 2% de paraformaldéhyde dans du PBS n'affecte pas l'intensité de fluorescence moyenne des neutrophiles marquées par Gr. CellTrackereen ou CellTracker orange pendant au moins 48 h.

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Résultats

Ce protocole est optimisé pour la récolte de cellules de moelle osseuse de souris et la séparation subséquente des neutrophiles à partir de ces cellules par centrifugation de gradient de densité à l'aide de médias disponibles dans le commerce de séparation des cellules Histopaque. Neutrophiles isolés en utilisant cette méthode peut être utilisée pour une variété d'aval études fonctionnelles ex vivo et pour les expériences de transfert adoptif de souris receveuses.

Le rendeme...

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Discussion

Ici, nous présentons un protocole fiable, simple, rapide et économique pour l'isolement d'un grand nombre de neutrophiles dans la moelle osseuse de souris avec une grande pureté et de la viabilité en utilisant une approche de centrifugation de gradient de densité. Lorsque ce protocole est réalisé correctement, ~ 6-12 × 10 6 neutrophiles peuvent être récupérés à partir d'une souris non infectées et jusqu'à ~ 30-40 × 10 6 neutrophiles peuvent être isolés à partir d'une souris aprè...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Division de la recherche intra-muros de l'Institut national des maladies allergiques et infectieuses (NIAID), l'Institut National de la Santé (NIH), USA.

Toutes les souris ont été maintenus à une association américaine pour l'accréditation de l'animalerie accrédité par les soins des animaux de laboratoire à l'Institut national des maladies allergiques et infectieuses (NIAID) et logés conformément aux procédures décrites dans le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire sous les auspices d'un protocole approuvé par le soin des animaux et du Comité de l'utilisation du NIAID.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
  ;s forts
RPMI 1640 1X avec L-glutamine et 25 mM HEPESCellgro10-041-CV²&nbsp ;
Sérum fœtal bovin (chaleur inactivée)GemCell100500  ;
Pénicilline/streptomycine (10 000 unités de pénicilline / 10 000 mg/ml de streptocoque)GIBCO15140  ;
0,5 M EDTAQualité Biologique Inc351-027-101  ;
Chlorure de sodium à 0,2 % et 1,6 %JT Baker3624Solutions de chlorure de sodium préparées à l’aide d’eau distillée et filtrées stériles
Histopaque 1077 Histopaque 10771Sigma10771Histopaque 1077 doit être portée à 18-26 ° ; C avant utilisation
Filtre stérile Histopaque 1119Sigma11191Histopaque 1119 doit être porté à 18-26 ° ; C avant utilisation
Saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ni magnésiumCellgro210-40-CV²  ;
Alcool éthylique (200 proof)The Warner Graham Company64-17-5  ;
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescéin Diacetate)InvitrogenC-7025Réaliser des solutions mères de 10 mM dans du DMSO, aliquote et stocker à -80 ° ; C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(et 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)InvitrogenC-2927Faire des solutions mères de 10 mM dans du DMSO, aliquote et stocker à -80 ° ; C
Anti-souris CD45 (clone 30-F11)eBioscience170451-82  ;
Anti-souris Ly6G (Clone 1A8)BD Pharmingen551461  ;
Anti-souris Ly6G (Clone 1A8)BD Pharmingen560599  ;
Anti-souris CD11b (Clone M1/70)eBioscience47-0112-82  ;
Anti-souris CD16/CD32 (souris BD Fc Block)BD Pharmingen553141Utilisation à une dilution de 1:100
LIVE/DEAD Kit de coloration bleue à cellules mortes fixableSondes moléculairesL-23105Utilisation à une dilution de 1:1000
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma67-68-5  ;
Solution de paraformaldéhyde, 4 % dans PBSUSB Corporation19943  ;
  ;Tableau 1. Réactifs pour l’isolement, l’étiquetage et le suivi des neutrophiles transférés par adoption.
  ;Materials
C57BL/6 sourisTaconic  ;
Tubes à centrifuger de 15 mlCorning430053  ;
Tubes à centrifuger de 50 mlBD Falcon352070  ;
Pipettes sérologiques de 25 mlCelltreat229225B  ;
Pipettes sérologiques de 10 mlCelltreat229210B  ;
Pipettes sérologiques de 5 mlCelltreat229205B  ;
Pipettes Pasteur (3 ml)BD Falcon357575  ;
Seringues de 12 mlKendall monoject512878  ;
25 g x 5/8 po Aiguilles (aiguilles de précision glide)BD305122  ;
Crépines à cellules de 100 mmBD Falcon352360  ;
Boîtes de Pétri bactéricidesBD Falcon351029  ;
Combitips Plus BiopurEppendorf2249608-5  ;
Instruments de dissection de souris (ciseaux, pinces, scalpel)Instruments de recherche biomédicale10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000Instruments stérilisés avant utilisation
  ;Equipment
Hotte de culture tissulaireThe Baker CompanySG403  ;
Centrifugeuse réfrigéréeThermo Fischer Scientific75004521  ;
37 ° ; Bain-marie à secoussesThermo Fischer Scientific3166721  ;
  ;Tableau 2. Liste des matériaux et équipements utilisés dans le cadre de ce protocole.

Références

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Mots-clés

Centrifugation sur gradient de densitmarquage au Cell Trackeranalyse par cytom trie en fluxlyse des globules rougesgradient Histopaquetudes de repopulation comp titiveisolation de la moelle osseuse de souristudes fonctionnelles des neutrophiles

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