Isolement, la purification et l'étiquetage des neutrophiles osseuse de souris de moelle pour les études fonctionnelles et expériences de transfert adoptif

Résumé

Nous décrivons un protocole pour l'isolement et la purification des neutrophiles de la moelle osseuse de souris par centrifugation de gradient de densité et de neutrophiles étiquetage utilisant des colorants CellTracker. Cela représente une méthode simple, rapide, reproductible et économique pour obtenir un grand nombre de neutrophiles pour des études fonctionnelles en aval ou des expériences de transfert et de suivi adoptifs.

Résumé

Les neutrophiles sont des cellules effectrices critiques du système immunitaire inné. Ils sont rapidement recrutés dans les sites d'inflammation aiguë et exercent des effets protecteurs ou pathogènes en fonction du milieu inflammatoire. Néanmoins, en dépit du rôle indispensable des neutrophiles dans l'immunité, la compréhension détaillée des facteurs moléculaires qui interviennent effets effectrices et immunopathogène de neutrophiles dans différentes maladies infectieuses et les affections inflammatoires qui manque encore, en partie en raison de leur courte demi-vie, les difficultés de manipulation de ces cellules et du manque de protocoles expérimentaux fiables pour obtenir un nombre suffisant de neutrophiles pour des études fonctionnelles en aval et des expériences de transfert adoptif. Par conséquent, des méthodes simples, rapides, économiques et fiables sont hautement souhaitables pour récolter un nombre suffisant de neutrophiles de souris pour évaluer les fonctions telles que la phagocytose, le meurtre, la production de cytokines, la dégranulation et la traite. À cette fin,Nous présentons une densité protocole centrifugation basée reproductible gradient, qui peut être adapté à n'importe quel laboratoire d'isoler un grand nombre de neutrophiles à partir de la moelle osseuse de souris avec une grande pureté et sa viabilité. En outre, nous présentons un protocole simple qui utilise des colorants CellTracker d'étiqueter les neutrophiles isolés, qui peuvent ensuite être adoptive transférés dans des souris receveuses et suivis dans plusieurs tissus pendant au moins 4 heures post-transfert en utilisant la cytométrie de flux. En utilisant cette approche, le différentiel étiquetage des neutrophiles des souris de type sauvage et le gène déficient avec différents colorants CellTracker peut être employée avec succès pour réaliser des études de repeuplement compétitifs pour évaluer le rôle direct de gènes spécifiques dans le trafic des neutrophiles dans le sang dans les tissus cibles in vivo .

Introduction

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants chez les humains. Ils sont la principale composante cellulaire du système immunitaire inné et agissent comme première ligne de défense contre les micro-organismes envahisseurs. Les patients présentant une neutropénie acquise et immunodéficiences primaires qui affectent nombre de neutrophiles et / ou la fonction développent des infections bactériennes et fongiques invasives potentiellement mortelles, en soulignant l'importance de ces cellules en défense de l'hôte ^1. Reconnaissance immunitaire des pathogènes envahissants sur le site de l'infection par leurs parentes de reconnaissance des for....

Protocole

1. Isolement de souris cellules de moelle osseuse

1. Euthanasier les souris en utilisant le protocole de soin des animaux de l'institution comité approuvé et vaporiser la surface des animaux avec de l'éthanol à 70%.
2. Faire une incision de la peau dans le milieu de l'abdomen et enlever la peau de la partie distale de la souris, y compris la peau qui recouvre les extrémités inférieures.
3. Coupez les muscles des membres inférieurs à l'aide de ciseaux et disloquer soigneusement le cotyle de la hanche, tout en évitant de se casser la tête du fémur.
4. Supprimer les muscles restants du fémur et le tibia à l'aide d'un ....

Résultats

Ce protocole est optimisé pour la récolte de cellules de moelle osseuse de souris et la séparation subséquente des neutrophiles à partir de ces cellules par centrifugation de gradient de densité à l'aide de médias disponibles dans le commerce de séparation des cellules Histopaque. Neutrophiles isolés en utilisant cette méthode peut être utilisée pour une variété d'aval études fonctionnelles ex vivo et pour les expériences de transfert adoptif de souris receveuses.

Le rendeme.......

Discussion

Ici, nous présentons un protocole fiable, simple, rapide et économique pour l'isolement d'un grand nombre de neutrophiles dans la moelle osseuse de souris avec une grande pureté et de la viabilité en utilisant une approche de centrifugation de gradient de densité. Lorsque ce protocole est réalisé correctement, ~ 6-12 × 10 ⁶ neutrophiles peuvent être récupérés à partir d'une souris non infectées et jusqu'à ~ 30-40 × 10 ⁶ neutrophiles peuvent être isolés à partir d'une souris aprè.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
;			s forts
RPMI 1640 1X avec L-glutamine et 25 mM HEPES	Cellgro	10-041-CV²&	nbsp ;
Sérum fœtal bovin (chaleur inactivée)	GemCell	100500	;
Pénicilline/streptomycine (10 000 unités de pénicilline / 10 000 mg/ml de streptocoque)	GIBCO	15140	;
0,5 M EDTA	Qualité Biologique Inc	351-027-101	;
Chlorure de sodium à 0,2 % et 1,6 %	JT Baker	3624	Solutions de chlorure de sodium préparées à l’aide d’eau distillée et filtrées stériles
Histopaque 1077 Histopaque 10771	Sigma	10771	Histopaque 1077 doit être portée à 18-26 ° ; C avant utilisation
Filtre stérile Histopaque 1119	Sigma	11191	Histopaque 1119 doit être porté à 18-26 ° ; C avant utilisation
Saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium	Cellgro	210-40-CV	²  ;
Alcool éthylique (200 proof)	The Warner Graham Company	64-17-5	;
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescéin Diacetate)	Invitrogen	C-7025	Réaliser des solutions mères de 10 mM dans du DMSO, aliquote et stocker à -80 ° ; C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(et 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)	Invitrogen	C-2927	Faire des solutions mères de 10 mM dans du DMSO, aliquote et stocker à -80 ° ; C
Anti-souris CD45 (clone 30-F11)	eBioscience	170451-82	;
Anti-souris Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	551461	;
Anti-souris Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	560599	;
Anti-souris CD11b (Clone M1/70)	eBioscience	47-0112-82	;
Anti-souris CD16/CD32 (souris BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Utilisation à une dilution de 1:100
LIVE/DEAD Kit de coloration bleue à cellules mortes fixable	Sondes moléculaires	L-23105	Utilisation à une dilution de 1:1000
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	67-68-5	;
Solution de paraformaldéhyde, 4 % dans PBS	USB Corporation	19943	;
;			Tableau 1. Réactifs pour l’isolement, l’étiquetage et le suivi des neutrophiles transférés par adoption.
;			Materials
C57BL/6 souris	Taconic		;
Tubes à centrifuger de 15 ml	Corning	430053	;
Tubes à centrifuger de 50 ml	BD Falcon	352070	;
Pipettes sérologiques de 25 ml	Celltreat	229225B	;
Pipettes sérologiques de 10 ml	Celltreat	229210B	;
Pipettes sérologiques de 5 ml	Celltreat	229205B	;
Pipettes Pasteur (3 ml)	BD Falcon	357575	;
Seringues de 12 ml	Kendall monoject	512878	;
25 g x 5/8 po Aiguilles (aiguilles de précision glide)	BD	305122	;
Crépines à cellules de 100 mm	BD Falcon	352360	;
Boîtes de Pétri bactéricides	BD Falcon	351029	;
Combitips Plus Biopur	Eppendorf	2249608-5	;
Instruments de dissection de souris (ciseaux, pinces, scalpel)	Instruments de recherche biomédicale	10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000	Instruments stérilisés avant utilisation
;			Equipment
Hotte de culture tissulaire	The Baker Company	SG403	;
Centrifugeuse réfrigérée	Thermo Fischer Scientific	75004521	;
37 ° ; Bain-marie à secousses	Thermo Fischer Scientific	3166721	;
;			Tableau 2. Liste des matériaux et équipements utilisés dans le cadre de ce protocole.