Molecular Probes génétiquement codés pour étude g récepteurs couplés à la protéine

Résumé

Nous génétiquement coder l'acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine à divers postes ciblés dans les RCPG et de montrer la polyvalence du groupe azido dans différentes applications. Ceux-ci comprennent une technologie de photoréticulation ciblée pour identifier des résidus dans la poche de liaison au ligand d'un GPCR, et spécifique à un site de modification bioorthogonal GPCR avec un peptide marqueur d'épitope ou une sonde fluorescente.

Résumé

Pour faciliter les études structurales et dynamiques du G récepteur couplé à la protéine (GPCR) des complexes de signalisation, de nouvelles approches sont nécessaires pour introduire des sondes ou des étiquettes informatives en récepteurs exprimés qui ne perturbent pas la fonction du récepteur. Nous avons utilisé la technologie de suppression de codon ambre génétiquement coder l'acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine (AZF) à différents postes ciblés dans GPCR hétérologue exprimées dans les cellules de mammifères. La polyvalence du groupe azido est illustré ici dans différentes applications d'étudier RCPG dans leur environnement cellulaire natif ou sous détergents conditions solubilisées. Tout d'abord, nous démontrons une technologie à base de cellules photo-réticulation ciblée pour identifier les résidus dans la poche de liaison au ligand de GPCR où un ligand à petite molécule marquée au tritium est réticulé à un acide azido aminé génétiquement codé. Nous démontrons alors modification spécifique au site des RCPG par le bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligature réactionstion qui vise le groupe azido en utilisant des dérivés de phosphine. Nous discutons d'une stratégie générale pour l'étiquetage ciblé peptide épitope de protéines membranaires exprimées dans la culture et sa détection en utilisant une approche basée sur ELISA cellule entière. Enfin, nous montrons que AZF-GPCR peuvent être étiquetés de manière sélective avec des sondes fluorescentes. Les méthodes sont discutés général, en ce qu 'ils peuvent en principe être appliquée à n'importe quelle position d'acide aminé dans toute GPCR exprimé pour interroger les complexes de signalisation actives.

Introduction

Heptahélice G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) comprennent une superfamille de protéines de la membrane hautement dynamiques qui assurent la médiation des signaux extracellulaires importantes et variées. Dans le paradigme classique, l'activation du récepteur est couplé à des changements de conformation induites par le ligand. ^{1, 2} Les récents progrès dans la biologie structurale des RCPG ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la signalisation transmembranaire. ^3-5 Cependant, pour comprendre avec plus de précision chimique du mécanisme fonctionnel et dynamique des structures de signalisation des RCPG, une boîte à....

Protocole

Une. Incorporation génétique spécifique de site d'acides aminés non naturels dans les RCPG

1. Maintenir des cellules HEK293T dans du DMEM (4,5 g / L de glucose, de glutamine 2 mM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C dans une atmosphère _de CO2 à 5%.
2. Transfecter les cellules cultivées à 60-80% de confluence dans une plaque de 10 cm en utilisant le réactif Lipofectamine Plus.
   1. 750 ul de DMEM, ajouter 10 ul de réactif Plus, 3,5 ug d'ADNc de GPCR (pMT4. Rho ou pcDNA 3.1. CCR5) contenant le codon d'arrêt ambre dans une position souhaitée, 3,5 ug d'ARNt suppresseur ADNc (pSVB.Yam) et 0,35 pg ARNt synt....

Résultats

Nous avons employé la méthode de mutagenèse d'acide aminé non naturel spécifique de site pour introduire des sondes moléculaires dans un GPCR en utilisant le codon ambre technologie de suppression. Le schéma de la figure 1 présente les étapes marquantes de la méthodologie et les différentes applications de l'intégration de la SAU polyvalent, p-azido-L-phénylalanine (AZF), dans les RCPG. Expression de AZF-GPCR dans des cellules de mammifères permet photoréticulation ciblé à des ligands, .......

Discussion

Nous décrivons ici une méthode robuste pour incorporation spécifique du site d'une sonde réactive, AZF, en RCPG et démontrons trois applications utiles de cet outil pour étudier la structure et la dynamique des RCPG. Notre méthode de site spécifiquement incorporer SAU contourne un problème fondamental d'une stratégie alternative basée sur l'étiquetage chimique ^{32, 33} ou ³⁴ photoréticulants fixer à un seul mutant cystéine accessible. Bien que, chimies qui ciblent des groupes thiol cystei.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plasmide pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmide pcDNA.RS pour azF			(Ye et al., 2009)
Plasmides pMT4.Rho et pcDNA 3.1.CCR5			Contiennent éventuellement le codon stop ambré (TAG) à une position souhaitée
Cellules HEK 293T Cellules			adhérentes
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)	Gibco	10566	;
Saline tamponnée au phosphate	Gibco	14200	;
Sérum Fœtal Bovin	Gemini Bio-products	100-106	;
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine : 18324-012 Plus : 11514-015	;
p-azido-L-phénylalanine	Chem-Impex International	6162	;
;			Tableau 1. Incorporation génétique spécifique au site d’acides aminés non naturels dans les matériaux des RCPG
Maxima ML-3500S Lampe UV-A	Spectronics Corporation		azF est activée par la lumière de 365 nm
Solution de sel tamponné de Hank (HBSS)	Gibco	14065	;
HEPES	Irvine Scientific	9319	;
Albumine sérique bovine	Roche	3117405001	;
		marqué au tritium	d’un collaborateur (Grunbeck et al., 2012)
1 % (p/v) n-dodecyl-&beta ;-D-maltoside	Anatrace	D310LA&	nbsp ;
		1D4-sépharose	1D4 mAb immobilisé sur résine de sépharose 2B activée par le CNBr
% (p/v) de dodécylsulfate de sodium (SDS)	Fisher Scientific	BP166	;
NuPAGE Novex 4 - 12 % SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE réalisé sur appareil NuPAGE
Appareil Trans-Blot SD	Biorad		Appareil pour transfert semi-sec
Membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) Immobilon	Millipore	IPVH00010	;
Lait écrémé		Fisher Scientific NC9934262	;
Tween-20	Aldrich	274348	;
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Fluide de scintillation
Flacons de scintillation	Fisher Scientific	333726	;
LKB Wallac 1209 Rackbeta Compteur à scintillation liquide	Perkin Elmer		Compteur à bêta-scintillation
Anti-rhodopsine 1D4 mAb	Centre national de culture cellulaire	personnalisé	;
IgG anti-souris conjuguées à la peroxydase de raifort (HRP)	KPL, Inc.	474-1806	;
Substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico	Thermo Scientific	34080	;
Hyblot CL AR film	Denville	E3018	;
;			Tableau 2. Matériaux de photoréticulation ciblés
0,25 % Trypsine	Invitrogen	15050065	;
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1	;
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804	;
anticorps anti-CCR5 2D7 BD	Biosciences	555990	;
Poly-D-lysine	Sigma	P6407	;
Plaque à 96 puits	Costar	3601	Fond transparent, haute liaison EIA/RIA
Phosphate salin (calcium, magnésium)	Gibco	14040	;
16 % Paraformaldéhyde	EMS	28908	;
KPL, Inc.	conjugué à HRP	474-1516	;
IgG anti-lapin KPL	, Inc.	474-1516	;
Amplex Red	Invitrogen	A12222²	;
Peroxyde d’hydrogène	DE Healthcare Products	97-93399	;
Lecteur de plaques multi-puits à fluorescence CytoFluor II	Perseptive Biosystems		;
;			Tableau 3. Marquage ciblé des peptides-épitopes et matériaux ELISA de surface cellulaire
Fluorescéine-phosphine			(Huber et al., soumis en 2012)
Nonapeptide (peptide C9)	AnaSpec	62190	Peptide imitant l’épitope 1D4 NH2-TETSQVAPA-COOH
1 % (p/v) n-dodecyl-&beta ;-D-maltoside	Anatrace	D310LA	;
		1D4-sépharose	1D4 mAb immobilisé sur sépharose activée par CNBr Résine 2B
NuPAGE Novex 4 - 12 % SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE réalisé sur appareil NuPAGE
Scanner de fluorescence confocal Typhoon 9400	GE Healthcare	abandonné	Scanner avec laser de longueur d’onde de 488
nm  ;			Tableau 4. Matériaux d’étiquetage Fluorescents

Ligand Résine 1Résine