Trois dimensions d'analyse confocale de marqueurs microglies / macrophages de polarisation dans Experimental Brain Injury

Après une lésion cérébrale aiguë, les microglies s’activent rapidement et subissent des changements morphologiques et phénotypiques spectaculaires^1-3. Cette réponse intrinsèque est associée au recrutement de macrophages hématopoïétiques qui migrent dans le parenchyme cérébral lésé^4,5. Le rôle de la microglie et des macrophages qui ne sont pas antigéniquement distinguables (ci-après appelés M/M) dans les lésions cérébrales est encore débattu. De plus en plus d’études indiquent que, à l’instar de ce qui est décrit pour les macrophages périphériques, les macrophages microgliaux et les macrophages recrutés par le cerveau peuvent prendre des phénotypes différents dont les extrêmes correspondent au phénotype classique pro-inflammatoire toxique (M1) ou anti-inflammatoire protecteur (M2). Les différents états d’activation, dont la sécrétion de facteurs pro- ou anti-inflammatoires, la libération de molécules neurotrophiques et l’activité lysosomale, sont caractérisés par un schéma spécifique de marqueurs phénotypiques, dont l’expression dépend de l’évolution temporelle du milieu environnant. La caractérisation de ces phénotypes M/M dans le cerveau lésé est encore rare. Nous avons utilisé un modèle murin bien établi de pMCAo pour analyser l’expression et l’évolution de M/M après un AVC. Les protocoles basés sur l’immunofluorescence présentés ici visent à mieux comprendre l’apparition de marqueurs phénotypiques M/M spécifiques, leur localisation et leur co-expression cellulaire dans la zone ischémique. Nous avons étudié quelques molécules associées à différents états d’activation ou phénotypes, à savoir CD11b, un marqueur de surface exprimé par les leucocytes et un marqueur largement utilisé de l’activation/recrutement M/M^6-8, CD68 un marqueur des lysosomes^6,7 et Ym1 une protéine sécrétoire exprimée par des macrophages alternativement activés (M2) et associée à la récupération et à la restauration de la fonction^9-10.

Lorsque deux marqueurs sont exprimés par la même cellule, mais dans des compartiments subcellulaires différents, la colocalisation seule peut ne pas être très informative. Dans ce cas, l’analyse de la coexpression peut être effectuée à l’aide d’une vue à plan unique et de rendus tridimensionnels. Nous décrivons ici un protocole permettant d’obtenir une analyse tridimensionnelle approfondie de la coexpression des marqueurs.

1. Immunofluorescence

Le protocole suivant est réalisé sur des cryosections cérébrales coronales obtenues à partir de souris perfusées par voie transcardiale (20 ml de PBS, 0,1 mol/litre, pH 7,4, suivi de 50 ml de paraformaldéhyde réfrigéré à 4 % dans du PBS). Après la perfusion, les cerveaux sont soigneusement retirés et transférés à 30 % de saccharose dans du PBS à 4 °C pendant la nuit pour la cryoprotection. Les cerveaux sont ensuite rapidement congelés par immersion dans de l’isopentane à -45 °C pendant 3 minutes avant d’être scellés dans des flacons et stockés à -70 °C jusqu’à l’utilisation. Les cryosections cérébrales coronales (20 μm) sont coupées en série et soumises au protocole d’immunofluorescence ^{11, 6}.

Amenez tous les réactifs et échantillons à température ambiante avant utilisation. Veuillez noter que les dilutions de travail présentées des anticorps et du sérum résultent d’essais effectués afin d’obtenir les meilleures performances. Lorsque différents anticorps et sérum sont utilisés, le protocole doit être validé.

Notez que parce que les anticorps primaires anti-CD11b et anti-CD68 sont fabriqués chez le rat, pour éviter le signal croisé par l’anti-rat Alexa 546, nous avons utilisé une forte dilution d’anti-CD11b suivie d’une amplification du signal fluorescent avec le kit TSA (Cy5 Tyramide). Nous avons mis en place la dilution de travail optimale pour l’anti-CD11b en exécutant le protocole décrit à l’exception de l’étape 1.17 et en utilisant au moins 7 dilutions différentes d’anti-CD11b comme indiqué dans le tableau 1. En conséquence, 1:30 000 a été choisi étant la seule dilution permettant d’obtenir : 1) un signal visible avec Cy5 à la longueur d’onde d’excitation 646 nm ; 2) pas de signal avec Alexa 546 à la longueur d’onde d’excitation 532 nm. De cette façon, le signal fluorescent Alexa 546 est associé de manière sélective à l’expression de CD68.

Les dilutions optimales pour les anticorps anti-CD11b et anti-CD68 peuvent varier en fonction du type de tissu et doivent être définies avant de commencer le protocole de co-marquage.

1. Lavez les cryosections cérébrales deux fois avec PBS.
2. Incuber des cryosections pendant 5 min dans du PBS contenant 1 %_{de H 2}O₂ (étape nécessaire car l’amplification fluorescente nécessite une incubation avec de la peroxydase de raifort, de la streptavidine-HRP, voir étape 1.12).
3. Laver les cryosections 2 fois avec du PBS.
4. Incuber des cryosections pendant 60 min dans du PBS contenant 10 % de NGS et 0,3 % de Triton.
5. Incuber des cryosections à 4 °C pendant la nuit dans du PBS contenant de l’anticorps primaire anti-CD11b de rat Ab [1:30 000], 10 % de NGS et 0,3 % de Triton.
6. Laver les cryosections 2x (5 min) avec du PBS.
7. Incuber des cryosections pendant 60 min dans du PBS contenant du sérum anti-rat secondaire biotinylé Ab [1:200] et 1 % de NGS.
8. Laver les cryosections 2 fois avec du PBS.
9. Lavage des cryosections avec du TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween : 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05 % Tween 20).
10. Incuber des cryosections pendant 1,5 h dans du TNB (tampon bloquant Tris-HCl-NaCl : 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5 % réactif bloquant du kit approprié (voir tableau des réactifs)).
11. Lavez les cryosections 3 fois avec du TNT.
12. Incuber des cryosections dans du TNB contenant de la streptavidine-HRP [1:100].
13. Laver les cryosections 3x avec du TNT.
14. Incuber des cryosections pendant 8 min dans un diluant d’amplification contenant de la cyanine 5 tyramide [1:300].
15. Laver les cryosections 3 fois avec du PBS.
16. Incuber des cryosections pendant 60 min dans du PBS contenant 10 % de NGS et 0,1 % de Triton.
17. Incuber des cryosections à 4 °C pendant la nuit dans du PBS contenant de l’anticorps primaire anti-CD68 [1:200], 3 % de NGS et 0,3 % de Triton.
18. Laver les cryosections 3 fois avec du PBS.
19. Incuber des cryosections pendant 60 min dans du PBS contenant de l’anticorps secondaire fluorconjugué Ab Alexa 546 anti-rat [1:500] et 1 % de NGS.
20. Laver les cryosections 3 fois avec du PBS.
21. Incuber des cryosections pendant 10 min dans du PBS contenant Hoechst 1 μg/ml.
22. Laver les cryosections 3 fois avec du PBS.
23. Montez les cryosections dans Prolong Gold.

2. Acquisition d’images tridimensionnelles par microscopie confocale

Le microscope utilisé ici était un microscope IX81 équipé d’une unité de balayage confocal FV500 avec 3 raies laser : Ar-Kr (488nm), He-Ne rouge (646nm) et He-Ne vert (532nm) et une diode UV.

1. Sélectionnez les lasers d’excitation en fonction des longueurs d’onde des colorants fluorescents à exciter (He-Ne rouge pour Cy5, CD11b ; He-Ne vert pour Alexa546, CD68 et la diode UV pour Hoechst, noyaux).
2. Sélectionnez la meilleure combinaison de miroirs dichroïques pour la collecte des signaux lumineux.
3. Réglez la résolution de l’image à un minimum de 800 x 600 pixels.
4. Identifiez une zone d’intérêt à l’aide de l’épifluorescence et augmentez progressivement le grossissement jusqu’à l’objectif 40X.
5. Passez à la méthode de microscopie à balayage laser (LSM).
6. Exécutez des balayages répétitifs pour ajuster le photomultiplicateur (PMT) et le gain pour chaque canal. Les lasers peuvent être allumés individuellement pour faciliter la configuration. Gardez le gain aussi bas que possible pour éviter les signaux indésirables non spécifiques.
7. Avec le balayage répétitif en cours, déplacez la commande de mise au point pour définir les extrêmes inférieur et supérieur de l’axe z (longueur totale de l’axe z = 10 μm).
8. Arrêtez l’analyse répétitive.
9. Définissez la taille du pas. Il doit être aussi proche que possible de la taille des pixels (0,225 μm) pour obtenir un rapport de taille standard de 1:1 sur l’axe z.
10. Activez le filtre de Kalman au moins 2 fois.
11. Activez le mode de balayage séquentiel pour éviter les effets de débordement.
12. Allez à mi-chemin le long de l’axe z et lancez un balayage séquentiel xy. Vérifiez la configuration du PMT et du gain (bon rapport signal/bruit). Si la solution n’est pas satisfaisante, répétez l’étape 2.6.
13. Exécutez l’acquisition xyz.
14. Exporter les données sous forme de fichier multitiff. Chaque fichier multitiff contient généralement 3 canaux de couleur (bleu, vert et rouge) et 44 plans focaux.

3. Vue tridimensionnelle des acquisitions confocales et rendu tridimensionnel

Télécharge les fichiers multitiff sur le logiciel Imaris et traite-les comme suit :

1. Logiciel ouvert.
2. Sélectionnez la vue surpasse.
3. Téléchargez le fichier multitiff.
4. Sélectionnez la couleur souhaitée pour chaque canal.
5. Supprimez le bruit de fond en augmentant la valeur minimale sur le panneau de réglage de l’affichage. Ajustez chaque canal individuellement.
6. Allez dans la vue en coupe. Déplacez-vous le long de l’axe z à la recherche d’une co-localisation (pixels jaunes).
7. Cliquez sur une zone jaune pour voir si la colocalisation est présente le long de l’axe z (c’est-à-dire si elle appartient à un objet solide). Les projections de l’axe Z sont visibles dans la partie droite et inférieure de la figure.
8. Prenez un instantané.
9. Retournez à la vue surpassée.
10. Recadrez la 3D pour isoler une cellule ou un groupe de cellules.
11. Sélectionnez un canal sur le panneau de réglage de l’affichage.
12. Sélectionnez le générateur d’algorithmes surpass/surfaces. Étapes de l’algorithme :
    1. Sélectionnez la chaîne.
    2. Définissez le seuil (utilisez la même valeur minimale dans le panneau de réglage de l’affichage).
    3. Définissez le redimensionnement.
    4. Définissez le lissage (meilleur = 0,200).
    5. Définissez l’apparence des couleurs.
    6. Fin de l’algorithme.
13. Répétez l’étape 3.12 pour chaque canal.
14. Désélectionnez les canaux de fluorescence sur le panneau de réglage de l’affichage et sélectionnez les trois surfaces.
15. Déplacez le volume pour trouver la meilleure vue.
16. Prenez un instantané.

Un exemple des résultats obtenus lors de la réalisation de protocoles de marquage et d’acquisitions confocales dans la région ischémique est illustré dans les figures 1A et 1B. Une vue bidimensionnelle des images acquises montre qu’à vingt-quatre heures après l’ischémie (A), le marqueur lysosomal CD68 (vert) est exprimé dans les cellules amiboïdes hypertrophiques CD11b (rouge) présentes dans le noyau ischémique. Dans la zone frontalière (B), les cellules CD11b positives présentent des corps cellulaires ronds et des processus ramifiés positifs à CD68. Les projections de l’axe Z (partie droite et inférieure de A et B) permettent de visualiser si la distribution des marqueurs documentée dans la vue à plan unique est également présente le long de l’axe z. Là où la colocalisation se produit, des pixels jaunes sont générés. CD11b est le récepteur des fragments de C3 et présente une distribution membranaire. CD68 marque les lysosomes et est donc présent principalement dans le cytosol. Les cellules doublement positives CD11b/CD68 ont généralement un faible pourcentage de voxels colocalisés et, dans la plupart des cas, CD11b entoure CD68 (Figure 1A). Ce n’est que lorsque les phagosomes sont liés à la membrane cellulaire pendant le processus phagocytaire que la colocalisation entre CD11b et CD68 est réalisée (Figure 1B).

Dans la figure 2, le traitement d’image qui conduit à la définition de la coexpression des marqueurs est rapporté. En A, la vue tridimensionnelle des images confocales acquises indique la présence de cellules CD68 positives (vertes) et de cellules positives Ym1 (rouges), mais elle ne peut pas être utilisée pour la définition de la colocalisation. En effet, les voxels fluorescents parallèles à la vue de l'observateur peuvent produire un signal colocalisé (jaune), qui peut ne pas être lié à la distance réelle entre les marqueurs (ce ne sont pas des objets solides et il peut y avoir des effets de transparence). Pour définir la colocalisation, il faut préférer une vue à plan unique avec des projections de l’axe z (B). En se déplaçant le long de l’axe Z à la recherche de colocalisation (pixels jaunes), la projection de l’axe Z est obtenue (visible à droite et en bas de la partie B). Les voxels fluorescents peuvent être transformés en objets solides par rendu tridimensionnel (Figure 2C). La rotation du volume permet d'obtenir la meilleure vue (de C'à C''''') pour regarder les objets et attribuer correctement l'expression du marqueur à un corps cellulaire spécifique. Un grossissement élevé et une vue solide des rendus tridimensionnels permettent de définir l'expression des marqueurs dans des grappes de cellules (D-D''). Après un fort grossissement et un rendu 3D, les deux marqueurs (CD68 et Ym1) semblent appartenir à des cellules différentes, bien qu’à proximité.

Un exemple de l’évaluation de la coexpression du marqueur phénotypique M/M dans l’aire ischémique est montré à la figure 3. La coexpression de CD11b (rouge), un marqueur de l’activation/recrutement de M/M, de CD68 (vert) un marqueur associé aux lysosomes ainsi que de Ym1, exprimé par des M/M activés alternatifs, sont étudiées dans l’aire ischémique. Pour fournir des détails sur l’état fonctionnel de M/M, nous avons évalué leur relation avec les neurones (NeuN, en bleu). Les images de la zone échantillonnée (figures 3A-3D) sont évaluées comme des objets tridimensionnels (figures 3A'-3D'). Les cellules positives doubles CD11b/CD68 sont examinées par rendu tridimensionnel (Figures 3A' et 3B'). L’analyse révèle que les neurones (en bleu) sont souvent enveloppés par des cellules CD11b positives à la fois dans le noyau ischémique et dans la zone frontalière 24 heures après l’ischémie. Dans la plupart des cas, les cellules CD11b entourant les neurones sont positives pour CD68 dans les deux zones, ce qui suggère que ces cellules sont engagées dans une phagocytose active. Aucune des cellules doublement positives CD11b/Ym1 (figures 3C et 3C') ne semble engager une interaction phagocytaire avec les neurones, les cellules doublement positives CD11b/Ym1 n'étant jamais en contact avec les cellules positives NeuN.

Table 1. Réglage fin de la dilution de travail pour l’anticorps anti-CD11b du rat.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.