Contrôle quantitatif et temporelle des micro-environnement de l'oxygène à l'Islet Plain

Summary

Le contrôle microfluidique de l’oxygène confère plus que la commodité et la rapidité par rapport aux chambres hypoxiques pour les expériences biologiques. En particulier lorsqu’il est mis en œuvre par diffusion à travers une membrane, l’oxygène microfluidique peut fournir des modulations simultanées en phase liquide et gazeuse au niveau microscopique. Cette technique permet des expériences multiparamétriques dynamiques essentielles à l’étude de la physiopathologie des îlots de Langerhans.

Abstract

Oxygénation simultanée et la surveillance de glucose stimulus-sécrétion de facteurs de couplage dans une seule technique est essentielle pour la modélisation états physiopathologiques de l'îlot hypoxie, en particulier dans les environnements de transplantation. Techniques de la chambre hypoxique standard ne peuvent pas moduler les stimulations en même temps, ni assurer le suivi en temps réel des facteurs de couplage stimulus-sécrétion glucose. Pour répondre à ces difficultés, nous avons appliqué une technique microfluidique multicouche à intégrer à la fois aqueuse et modulations de phase de gaz par une membrane de diffusion. Cela crée un sandwich de stimulation autour des îlots microscaled sein du polydiméthylsiloxane transparent (PDMS) de l'appareil, ce qui permet la surveillance des éléments d'accouplement susmentionnés par microscopie à fluorescence. En outre, l'entrée de gaz est commandé par une paire de microdispensers, en fournissant des modulations quantitatives, les sous-minute d'oxygène entre 0-21%. Cette hypoxie intermittente est utilisée pour étudier un nouveau phénomène de l'Islet préconditionnement. En outre, armés de microscopie multimodale, nous avons pu regarder calcium détaillée et K _ATP dynamique de canal lors de ces événements hypoxiques. Nous envisageons l'hypoxie microfluidique, en particulier cette technique à deux phases simultanément, comme un outil précieux pour l'étude des îlots ainsi que de nombreux ex vivo des tissus.

Introduction

L’hypoxie dynamique est importante en biologie, en particulier pour les greffes d’îlots

L’hypoxie dynamique est un paramètre physiologique et physiopathologique important dans de nombreux tissus biologiques. Le changement d’oxygène, par exemple, est un puissant signal de développement dans l’angiogenèse. De plus, les modèles spatiaux et temporels de l’hypoxie modulent HIF1-alpha et jouent un rôle dans des maladies comme le cancer du pancréas. L’hypoxie est également un facteur de confusion affectant les résultats de la greffe d’îlots. Récemment, des oscillations temporelles de l’hypoxie, ou hypoxie intermittente (IH), ont démontré des avantage....

Protocol

1. Préparation des îlots de souris

1. Disséquer des souris C57BL/6 et isoler les îlots par digestion par collagénase et séparation par gradient de densité de Ficoll. (Reportez-vous aux articles de JOVE référencés en^2,3).
2. Incuber les îlots dans un milieu RPMI-1640 contenant 10 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine et 20 mM d’HEPES dans des boîtes de Pétri (37 °C, 5 % de CO₂). Après l’isolement, cultiver les îlots pendant 24 heures avant d’être utilisé dans des expériences. Utilisez les îlots dans un délai de 1 à 2 jours pour garantir des résultats cohérents.

2. Fabrication de la plate-forme ....

Results

Au cœur de cette technique d’hypoxie des îlots de Langerhans se trouve la capacité de moduler la stimulation en phase aqueuse et gazeuse dans la même chambre microfluidique avec des transitoires à l’échelle minuscule. La figure 1 est un résultat représentatif des a) doubles stimulations et b) des modulations rapides mesurées dans la chambre des îlots pancréatiques. La modulation aqueuse, mise en évidence par l’introduction de fluorescéine dans la chambre, atteint l’équilibre en trois à quatre minutes de .......

Discussion

Les multiples modalités intégrées dans cette technique d’hypoxie des îlots présentent plusieurs points notés ici pour le dépannage. Tout d’abord, les îlots isolés continuent de se dégrader et de se désintégrer en culture en raison des enzymes digestives des cellules acineuses. Il est donc essentiel de normaliser les expériences jusqu’à 1 à 2 jours après l’isolement des îlots de Langerhans pour obtenir des résultats cohérents. Deuxièmement, l’écoulement aqueux a été arrêté pendant l’hypoxie et l’hypoxie intermittente pour.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactif/Matériel
Spinner	Laurell	WS-400
SU8	MicroChem	SU8-2150/SU8-2100
Plaque de cuisson numérique	PMC Dataplate	722A
Lampe de polymérisation UV	OmniCure	S1000
PMDS	Dow Chemical	Sylgard 184
Baguette Corona	ETP	BD-20AC
Chambre à vide	Bel-Art	420220000
Microdistributeurs	The Lee Company	IKTX0322000A
5 V et 20 V DC Power	Radio Shack
NI USB	National Instrument	NI USB-6501
Thermomètre	Omega Engineering, Inc.
Pompe péristaltique	Gilson	Minipulse 2
Capteur d’oxygène	Ocean Optics	NeoFox
Fraction Collector	Gilson	203
Pippette	Fisher Scientific	Finnpipette II 100&mu ;
Microscope à épifluorescence inversée	Leica	DMI 4000B
50 ml Tubes coniques	Fisher Scientific
Fura-2 Sondes	, Life Technologies
Rhodamine 123 Sondes	, Milieux de culture Life
	Sigma-Aldrich	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
Glucose	Sigma-Aldrich
Sérum bovin Albumine	Sigma-Aldrich
Tubes en silicone 30 po	Cole-Parmer		1/16 po x 1/8 po
1,5 ml Tubes Eppendorf Fisher	Scientific
Connecteurs en Y	Cole-Parmer		Connecteurs de seringue 1/16 po et 4 mm
	Cole-Parmer		femelle Connecteur Luer 1/16 po
Connecteurs droits	Cole-Parmer		1/16 po
	Cole-Parmer		1/16 po