Contrôle quantitatif et temporelle des micro-environnement de l'oxygène à l'Islet Plain

Résumé

Le contrôle microfluidique de l’oxygène confère plus que la commodité et la rapidité par rapport aux chambres hypoxiques pour les expériences biologiques. En particulier lorsqu’il est mis en œuvre par diffusion à travers une membrane, l’oxygène microfluidique peut fournir des modulations simultanées en phase liquide et gazeuse au niveau microscopique. Cette technique permet des expériences multiparamétriques dynamiques essentielles à l’étude de la physiopathologie des îlots de Langerhans.

Résumé

Oxygénation simultanée et la surveillance de glucose stimulus-sécrétion de facteurs de couplage dans une seule technique est essentielle pour la modélisation états physiopathologiques de l'îlot hypoxie, en particulier dans les environnements de transplantation. Techniques de la chambre hypoxique standard ne peuvent pas moduler les stimulations en même temps, ni assurer le suivi en temps réel des facteurs de couplage stimulus-sécrétion glucose. Pour répondre à ces difficultés, nous avons appliqué une technique microfluidique multicouche à intégrer à la fois aqueuse et modulations de phase de gaz par une membrane de diffusion. Cela crée un sandwich de stimulation autour des îlots microscaled sein du polydiméthylsiloxane transparent (PDMS) de l'appareil, ce qui permet la surveillance des éléments d'accouplement susmentionnés par microscopie à fluorescence. En outre, l'entrée de gaz est commandé par une paire de microdispensers, en fournissant des modulations quantitatives, les sous-minute d'oxygène entre 0-21%. Cette hypoxie intermittente est utilisée pour étudier un nouveau phénomène de l'Islet préconditionnement. En outre, armés de microscopie multimodale, nous avons pu regarder calcium détaillée et K _ATP dynamique de canal lors de ces événements hypoxiques. Nous envisageons l'hypoxie microfluidique, en particulier cette technique à deux phases simultanément, comme un outil précieux pour l'étude des îlots ainsi que de nombreux ex vivo des tissus.

Introduction

L’hypoxie dynamique est importante en biologie, en particulier pour les greffes d’îlots

L’hypoxie dynamique est un paramètre physiologique et physiopathologique important dans de nombreux tissus biologiques. Le changement d’oxygène, par exemple, est un puissant signal de développement dans l’angiogenèse. De plus, les modèles spatiaux et temporels de l’hypoxie modulent HIF1-alpha et jouent un rôle dans des maladies comme le cancer du pancréas. L’hypoxie est également un facteur de confusion affectant les résultats de la greffe d’îlots. Récemment, des oscillations temporelles de l’hypoxie, ou hypoxie intermittente (IH), ont démontré des avantages dans le « préconditionnement » des îlots¹. Cependant, les effets de l'hypoxie statique et transitoire sur la physiologie des îlots pancréatiques n'ont pas encore été bien compris ou étudiés, principalement en raison du manque d'outils appropriés pour contrôler le microenvironnement des îlots.

Les îlots sont bien vascularisés in vivo

Les îlots pancréatiques sont des agrégats sphéroïdaux de 50 à 400 μm de cellules endocrines, y compris les cellules bêta et les cellules alpha qui sont responsables de l’homéostasie du glucose. Lorsque les îlots sont exposés à du glucose stimulateur dans le sang, l’absorption et la glycolyse entraînent une production d’ATP, ce qui ouvre les canaux potassiques sensibles à l’ATP (K_ATP) et entraîne un afflux de calcium qui déclenche l’exocytose des granules d’insuline. L’oxygène est important pour piloter ce processus fortement métabolique et la sécrétion d’insuline est considérablement influencée par la dynamique du flux sanguin et de l’approvisionnement en oxygène en plus des gradients de glucose. Les îlots de Langerhans exécutent facilement cette réponse glucose-insuline in vivo car ils sont fortement irréguliers dans le pancréas, chacun à moins d’une longueur de cellule d’un vaisseau capillaire. Cependant, le réseau dense de capillaires intra-îlots est éliminé par la collagénase lors de l’isolement des îlots^2,3. Par conséquent, les réserves d’oxygène et de nutriments sont limitées à un périmètre de 100 μm en raison des limites de diffusion.

Les techniques actuelles ont un succès limité dans la recréation du microenvironnement des îlots de Langerhans

La recréation de la dynamique native de l'oxygène et du glucose des îlots, essentielle à la modélisation des conditions physiologiques et physiopathologiques, est difficile à réaliser avec des chambres hypoxiques standard qui nécessitent un débit élaboré et manquent de surveillance continue des fonctions des îlots. De plus, les traitements de transplantation pour le diabète de type I exposent des îlots isolés à une hypoxie dans le système porte^{hépatique 4} qui a une pO₂ beaucoup plus faible (<2 %, 5-15 mmHg) par rapport au pancréas physiologique (5,6 %, 40 mmHg). Après la greffe, les greffons d’îlots mettent deux semaines ou plus à être revascularisés. Il a été démontré que l'exposition hypoxique altère le mécanisme de couplage glucose-insuline des îlots. Parmi les facteurs de couplage stimulus-sécrétion, la signalisation calcique, les potentiels mitochondriaux et la cinétique de l’insuline peuvent être facilement surveillés à l’aide de la microfluidique. Notre précédente technique microfluidique a démontré cette surveillance en temps réel avec une modulation précise du microenvironnement aqueux autour de l’îlot^{unique 5,6}. Cependant, la quantification de l'insuffisance hypoxique des îlots est entravée par l'absence de techniques de stimulation et de surveillance simultanées. Par conséquent, la combinaison du contrôle microfluidique de l’oxygène et de la surveillance des îlots pancréatiques peut améliorer les études d’hypoxie des îlots pancréatiques.

Microfluidics peut recréer et moduler le microenvironnement aqueux et oxygéné

La technique standard pour les études d’hypoxie tissulaire et de culture a été basée sur des chambres hypoxiques. En général, les chambres hypoxiques fournissent des concentrations d’oxygène uniques avec des temps d’équilibre en ~10-30 min, incompatibles avec l’hypoxie dynamique à l’échelle de la minute. Deux études récentes ont utilisé de petites chambres personnalisées pour l’exposition intermittente à l’hypoxie sur des souris entières, avec des résultats contradictoires sur la réponse insulinique induite par le glucose^7,8. Gardez à l’esprit qu’au niveau de l’ensemble de l’animal, l’oxygène respiré n’est pas directement traduit en pO₂ capillaire des îlots, en raison des contrôles dans le système respiratoire. De plus, ces études n’ont pas de niveaux d’oxygène standardisés, ni ne fournissent de mesures en temps réel au niveau tissulaire des îlots.

D’autre part, la microfluidique d’oxygène peut dépasser ces limites en contrôlant l’oxygène via des réseaux de canaux gazeux. De plus, la microfluidique est compatible avec l’imagerie en direct pendant la modulation de l’oxygène, un exploit actuellement impossible avec les chambres hypoxiques standard. Un certain nombre de ces nouvelles approches microfluidiques utilisent la perméabilité aux gaz du polydiméthylsiloxane pour dissoudre les concentrations d’oxygène dans des microcanaux qui font circuler le milieu sur les cellules cibles^{9 à 14}. Ces appareils ont également intégré plusieurs concentrations d’oxygène discrètes, des capteurs d’oxygène basés sur la fluorescence et même la génération chimique d’oxygène sur puce.

La microfluidique basée sur la solvatation liquide a du mal à maintenir des gradients stables et continus car elle dépend du mélange convectif qui est sensible aux conditions d’écoulement. En comparaison, la technique que nous utilisons ici se concentre sur la diminution de la voie de diffusion de l’administration d’oxygène. La solvatation gazeuse et l’écoulement de cisaillement sont éliminés en diffusant directement de l’oxygène à travers une membrane ensemencée de cellules ou de tissus d’îlots. Cela élimine la microfluidique supplémentaire nécessaire pour contrôler la solvatation et empêche les contraintes de cisaillement inutiles sur les îlots, qui peuvent elles-mêmes déclencher la libération d’insuline. Cette plateforme a été utilisée pour démontrer la régulation positive des espèces réactives de l’oxygène (ROS) aux extrêmes hyperoxiques et hypoxiques (2-97 %_O2) dans la culture cellulaire^1,15. En raison de l’apport direct d’oxygène et de l’élimination de l’écoulement de cisaillement, notre plateforme basée sur la diffusion fournit la solution microfluidique optimale pour l’étude de l’hypoxie des îlots de Langerhans.

Stimulation et surveillance multimodales

La microfluidique basée sur la diffusion apporte également des avantages supplémentaires lorsqu’elle est adaptée à l’étude de la microphysiologie des îlots de Langerhans. En utilisant une membrane comme barrière de diffusion, le liquide peut être isolé des modulations de l’oxygène, ce qui permet de contrôler les stimulations aqueuses du glucose indépendamment des stimulations hypoxiques. Cela crée une stimulation simultanée en forme de sandwich qui localise spatialement l’accouchement vers les îlots. De plus, comme le gaz est modulé temporellement via des micro-injecteurs informatisés, nous pouvons moduler numériquement la concentration d’oxygène de 21 à 0 % avec un temps transitoire inférieur à 60 secondes. Les contrôles dynamiques du microenvironnement de l’oxygène et du glucose au microscope permettent un protocole multimodal en temps réel qui ne serait pas possible ou extraordinairement lourd avec des chambres hypoxiques standard. À l’aide de ce dispositif, la signalisation calcique (Fura-AM), les potentiels mitochondriaux (rhodamine 123) et la cinétique de l’insuline (ELISA) ont été surveillés pour fournir une image complète de la réponse dynamique glucose-insuline en cas d’hypoxie.

Protocole

1. Préparation des îlots de souris

1. Disséquer des souris C57BL/6 et isoler les îlots par digestion par collagénase et séparation par gradient de densité de Ficoll. (Reportez-vous aux articles de JOVE référencés en^2,3).
2. Incuber les îlots dans un milieu RPMI-1640 contenant 10 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine et 20 mM d’HEPES dans des boîtes de Pétri (37 °C, 5 % de CO₂). Après l’isolement, cultiver les îlots pendant 24 heures avant d’être utilisé dans des expériences. Utilisez les îlots dans un délai de 1 à 2 jours pour garantir des résultats cohérents.

2. Fabrication de la plate-forme microfluidique

1. Générez les géométries de microstructure sur des photomasques transparents pour chaque couche du dispositif : 1) entrée et sortie, 2) couche microfluidique de glucose avec chambre de périfusion (8 mm de diamètre x 3 mm, 150 μl), 3) membrane de 200 μm avec micropuits (500 μm de diamètre, 100 μm de profondeur) et 4) couches microfluidiques gazeuses.
2. Pour fabriquer les couches d’entrée et de sortie, versez du PDMS dégazé et prémélangé à une hauteur de 1,5 mm dans une boîte de Pétri vierge et durcissez à 80 °C pendant 2 heures. Perforez des orifices d’entrée/sortie de 2 mm de diamètre.
3. Pour fabriquer la couche microfluidique de glucose, faites tourner deux couches de 350 μm de SU8-2150 pour former une seule couche de 700 μm sur une plaquette de silicium de 4 pouces.
   1. Exposez la lumière UV à travers le photomasque approprié pour transférer le motif à microcanaux sur le SU8 après le développement, produisant un master de 700 μm de haut.
   2. Versez le PDMS dégazé et prémélangé sur ce master à une hauteur de 3 mm et durcissez à 80 °C pendant 2 h. Coupez ce PDMS à l’aide d’une lame de rasoir.
   3. Perforez les ports d’entrée/sortie de 2 mm de diamètre ainsi que la chambre de 8 mm de diamètre.
4. Pour fabriquer la membrane de 200 μm avec des micropuits, faites pivoter SU8-2100 à 100 μm. Appliquez la même lithographie UV pour transférer les motifs de micropuits sur ce master de 100 μm de haut.
   1. Essorez le PDMS dégazé et prémélangé sur ce maître à 900 tr/min pendant 30 secondes et durcissez à 80 °C pendant 10 min. Faites tourner une deuxième couche sur la première en utilisant les mêmes conditions, ce qui permet d’obtenir une membrane PDMS de 200 μm contenant des motifs de micropuits.
   2. Perforez des ports d’entrée/sortie de 2 mm de diamètre à travers cette membrane
5. Pour fabriquer la couche microfluidique gazeuse, faites pivoter SU8-2100 à 100 μm. Appliquez la même lithographie UV pour transférer des motifs microfluidiques gazeux sur ce master de 100 μm de haut.
   1. Versez le PDMS dégazé et prémélangé sur ce master à une hauteur de 1,5 mm et durcissez à 80 °C pendant 2 h. Coupez le PDMS à l’aide d’une lame de rasoir.
   2. Perforez des ports d’entrée/sortie de 2 mm de diamètre à travers cette couche
6. Pour coller les multiples couches, préparez-les en les nettoyant avec du scotch, en les exposant à l’arc corona, puis en les alignant à la main dans l’ordre suivant.
   1. Collez la membrane à la couche gazeuse inférieure avec les micropuits vers le haut.
   2. Collez le glucose microfluidique sur la membrane du micropuits.
   3. Collez les couches d’entrée et de sortie sur le dessus, encapsulant l’ensemble de l’ensemble.
   4. Renforcez le collage en ajoutant 1 kg de poids sur le dessus et en cuisant à 100 °C pendant 3 heures.
7. Testez l’étanchéité de l’appareil terminé en chargeant de l’eau dans la couche aqueuse, puis en immergeant l’ensemble de l’appareil sous l’eau. Ensuite, faites circuler l’air à travers la couche de gaz avec une seringue vide.
8. Stérilisez les dispositifs étanches avec de l’éthanol à 70 % à travers la couche aqueuse, puis rincez-les avec un tampon PBS, dans lequel le dispositif est stocké à 4 °C jusqu’à son utilisation.

3. Configuration du microdistributeur

1. Procurez-vous 2 microdistributeurs, des alimentations 5 V et 20 V CC et une carte d’E/S numérique pour construire la configuration de mélange et de distribution d’oxygène.
   1. Connectez les fils de commande des microdistributeurs aux unités d'entraînement incluses.
   2. Connectez les drivers à la carte d’E/S numérique aux ports correspondant aux commandes Labview.
   3. Connectez les alimentations 5 V et 20 V aux contacts correspondants sur les unités d’entraînement.
   4. Connectez les E/S numériques à un ordinateur portable pour exécuter les codes Labview pour le contrôle des gaz (Annexe).
2. Connectez un microdistributeur à de l’azote tandis qu’un autre à de l’air comprimé, tous deux contenant 5 % de CO₂. Réglez les deux gaz à 2 psi. Branchez les sorties des distributeurs dans une jonction en T avant d'entrer dans le dispositif microfluidique.
3. À l’aide d’un appareil testé d’étanchéité, caractérisez la réponse transitoire de la modulation de l’oxygène en faisant fonctionner les microdistributeurs entre 5 et 21 % d’oxygène, tout en mesurant l’oxygène dissous dans l’eau à l’aide d’un capteur d’oxygène à fibre optique (voir la liste des équipements et les résultats représentatifs).

4. Installation à la microscopie

1. Montez l’appareil sur la platine chauffée du microscope inversé.
2. Connectez les gaz 0 % et 21 % O₂ à l’appareil et calibrez avec le capteur d’oxygène.
3. Connectez l’orifice de sortie de la microfluidique de glucose à un collecteur de fractions.
4. Préparez le tampon bicarbonaté Krebs Ringer (KRB) : 129 mM NaCl, 5 mM NaHCO₃, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 1 mM CaCl₂·2H₂O, 1,2 mM MgSO₄·7H₂O, 10 mM HEPES pH 7,35-7,40, 2 mM de glucose basal et 5 % de FBS.
5. Préparez deux solutions tampons contenant respectivement 2 mM et 14 mM de glucose dans des tubes coniques de 50 ml baignés dans un bain-marie à 37 °C.
6. Connectez une pompe péristaltique pour aspirer un tampon à 250 μl/min dans le tube. Faire couler le tube sur une plaque chauffante à 37 °C avant d’entrer dans le dispositif microfluidique.
7. Pour colorer les îlots, ajoutez du Fura-2 AM dans du DMSO et du Rh123 dans de l’éthanol à 100 % à 2 ml de KRB pour atteindre des concentrations finales de colorant de 5 μM et 2,5 μM, respectivement.
8. Prélever les îlots à l’aide d’une pipette de 10 μl et incuber dans des colorants pendant 30 min à 37 °C.
9. Chargez environ 20 îlots dans l’appareil via l’entrée du microcanal de glucose. Dirigez les îlots dans la chambre en amorçant le tampon de la sortie dans l’entrée.
10. Perfuser les îlots dans un tampon pendant 10 min pour éliminer l’excès de colorants.

5. Exécution de la stimulation simultanée de l’oxygène et du glucose

1. Administrer une impulsion de stimulation du glucose avec 5 min de base établie par KRB2, suivie de 15 min de stimulation 14 mM, puis laver pendant 15 min dans KRB2.
2. Enregistrez une longueur d’onde d’excitation de 340/380 nm pour Fura-2 et une émission de 534 pour Rh123.
3. Effectuer des mesures d’une impulsion normale (14 mM normoxique) avant chaque expérience.
4. Pour la modulation de l’oxygène (hypoxie/hypoxie intermittente), n’appliquez un débit tampon que pendant les étapes de stimulation et de lavage et aucun débit dans les autres étapes, afin de minimiser les perturbations convectives.
5. Prélever les effluents de la sortie du glucose à des intervalles de 1 minute pour le dosage de l’insuline ELISA.

Résultats

Au cœur de cette technique d’hypoxie des îlots de Langerhans se trouve la capacité de moduler la stimulation en phase aqueuse et gazeuse dans la même chambre microfluidique avec des transitoires à l’échelle minuscule. La figure 1 est un résultat représentatif des a) doubles stimulations et b) des modulations rapides mesurées dans la chambre des îlots pancréatiques. La modulation aqueuse, mise en évidence par l’introduction de fluorescéine dans la chambre, atteint l’équilibre en trois à quatre minutes de ...

Discussion

Les multiples modalités intégrées dans cette technique d’hypoxie des îlots présentent plusieurs points notés ici pour le dépannage. Tout d’abord, les îlots isolés continuent de se dégrader et de se désintégrer en culture en raison des enzymes digestives des cellules acineuses. Il est donc essentiel de normaliser les expériences jusqu’à 1 à 2 jours après l’isolement des îlots de Langerhans pour obtenir des résultats cohérents. Deuxièmement, l’écoulement aqueux a été arrêté pendant l’hypoxie et l’hypoxie intermittente pour...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif/Matériel
Spinner	Laurell	WS-400
SU8	MicroChem	SU8-2150/SU8-2100
Plaque de cuisson numérique	PMC Dataplate	722A
Lampe de polymérisation UV	OmniCure	S1000
PMDS	Dow Chemical	Sylgard 184
Baguette Corona	ETP	BD-20AC
Chambre à vide	Bel-Art	420220000
Microdistributeurs	The Lee Company	IKTX0322000A
5 V et 20 V DC Power	Radio Shack
NI USB	National Instrument	NI USB-6501
Thermomètre	Omega Engineering, Inc.
Pompe péristaltique	Gilson	Minipulse 2
Capteur d’oxygène	Ocean Optics	NeoFox
Fraction Collector	Gilson	203
Pippette	Fisher Scientific	Finnpipette II 100&mu ;
Microscope à épifluorescence inversée	Leica	DMI 4000B
50 ml Tubes coniques	Fisher Scientific
Fura-2 Sondes	, Life Technologies
Rhodamine 123 Sondes	, Milieux de culture Life
	Sigma-Aldrich	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
Glucose	Sigma-Aldrich
Sérum bovin Albumine	Sigma-Aldrich
Tubes en silicone 30 po	Cole-Parmer		1/16 po x 1/8 po
1,5 ml Tubes Eppendorf Fisher	Scientific
Connecteurs en Y	Cole-Parmer		Connecteurs de seringue 1/16 po et 4 mm
	Cole-Parmer		femelle Connecteur Luer 1/16 po
Connecteurs droits	Cole-Parmer		1/16 po
	Cole-Parmer		1/16 po