Article de méthode

Un multi-électrode système de patch-clamp assistée par ordinateur

DOI :

10.3791/50630

⸱

18 octobre 2013

 , 
1Laboratory of Neural Microcircuitry - Brain Mind Institute, Ecole Polytechnique Federale de Lausanne

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multi-électrodes patch-clamp enregistrements constituent une tâche complexe. Ici, nous montrons comment, par l'automatisation de nombreuses étapes expérimentales, il est possible d'accélérer le processus conduisant à une amélioration qualitative de la performance et le nombre d'enregistrements.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La technique de patch-clamp est aujourd'hui la méthode la plus bien établi pour enregistrer l'activité électrique des neurones individuels ou leurs compartiments sous-cellulaires. Néanmoins, la réalisation d'enregistrements stables, même à partir de cellules individuelles, reste une procédure fastidieuse d'une complexité considérable. Automatisation de nombreuses étapes en collaboration avec l'affichage de l'information efficace peut grandement aider les expérimentateurs à effectuer un plus grand nombre d'enregistrements avec une plus grande fiabilité et en moins de temps. Afin de réaliser des enregistrements à grande échelle, nous avons conclu l'approche la plus efficace est de ne pas automatiser entièrement le processus, mais de simplifier les étapes expérimentales et de réduire les risques d'erreur humaine tout en intégrant efficacement l'expérience de l'expérimentateur et visuel. Avec ces objectifs à l'esprit, nous avons développé un système assisté par ordinateur qui centralise tous les contrôles nécessaires pour une expérience de patch-clamp multi-électrode dans une seule interface, un commercManette sans fil ially disponible, tout en affichant expérience en matière d'information et d'orientation des indices sur l'écran de l'ordinateur. Nous décrivons ici les différentes composantes du système qui nous a permis de réduire le temps nécessaire pour atteindre la configuration d'enregistrement et d'accroître sensiblement les chances de succès d'enregistrement grand nombre de neurones simultanément.

Introduction

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La capacité d'enregistrer et de stimuler plusieurs sites avec une précision micrométrique est extrêmement utile pour atteindre expérimentalement une meilleure compréhension des systèmes neuronaux. De nombreuses techniques ont été développées à cette fin, mais aucun de permettre la résolution des submillivolt obtenue par la technique du patch-clamp, essentielle pour l'étude de l'activité de sous-seuil et des potentiels post-synaptiques individuels. Ici, nous couvrir le développement d'un système de patch-clamp assistée par ordinateur de douze électrode destinée à la stimulation et l'enregistrement d'un grand nombre de cellules individuelles avec une précision suffisante pour l'étude de la connectivité neuronale simultanément. Bien que de nombreuses autres applications peuvent être conçus pour un tel système, il se prête particulièrement bien à l'étude de la connectivité synaptique étant donné que le nombre de connexions possibles à l'intérieur d'un groupe de neurones croît proportionnellement au carré du nombre de neurones en question. Par conséquent, alors qu'un système à trois électrodes permet de tester l'occurrence d'un maximum de six raccordements et d'enregistrement le plus souvent un seul, l'enregistrement douze neurones permet de tester l'apparition d'un maximum de 132 connexions et en observant fréquemment sur ​​une douzaine (Figure 1). L'observation de dizaines de connexions permet simultanément d'analyser l'organisation de petits réseaux et impliquer des propriétés statistiques de la structure du réseau qui ne peut être sondé sinon 1. En outre, la stimulation précise de nombreuses cellules permet également la quantification de recrutement de cellules post-synaptiques 2.

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Protocole

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Une. Préparation de l'équipement

  1. manipulateurs de commande à partir d'un ordinateur
    1. Connectez chaque boîte de contrôleur de micromanipulateur à un ordinateur via les ports série (RS-232).
    2. Mettre en œuvre les commandes pour le positionnement, l'interrogation et le réglage des paramètres doivent être envoyés via le port série. Problèmes de vitesse et de compatibilité matérielle donnée C / C + + est recommandé que le langage de programmation.
    3. Normaliser le système des manipulateurs de référence de sorte que le zéro est la position la plus proche possible à l'égard des moteurs et mouvement positif est dirigé loin des moteurs.
    4. Placez le microscope à sa position centrale 2 mm au-dessus du spécimen plan focal (coordonnées [0, 0, 2000]).
    5. Magasin, pour chaque manipulateur, les coordonnées locales qui permettent à l'embout d'une pipette à observer dans le centre du champ de vision du microscope. C'est le point de référence initial pour chaque électrode.
  2. Visuapositions des électrodes. Lize Il est très utile d'être en mesure de suivre la position de chaque électrode au cours d'une expérience. Une représentation graphique est la façon la plus intuitive de l'accomplissement de cette. À cette fin, les systèmes de référence de chaque électrode et celle du microscope doit être adaptée. Un moyen simple d'y parvenir est:
    1. Amener la pointe d'une électrode au centre du champ de vue.
    2. Mémoriser la position de chaque axe du manipulateur et chaque axe du microscope.
    3. Exécuter avec l'axe des x du manipulateur d'un mouvement relativement grand (1 mm).
    4. Localiser la pointe une fois de plus le déplacement que le microscope.
    5. Calculer la différence de la position du microscope depuis sa dernière mesurée. Ce sont les saillies du mouvement de l'axe de l'électrode sur les axes du microscope.
    6. Répéter les étapes 2.3 à 2.5 de l'axes Y et Z du manipulateur d'électrode. Cela permet une matrice de projections sur le microscope axes à déterminer ( Figure 2), aussi appelée matrice de cosinus:
      figure-protocol-1
    7. Inverser cette matrice pour permettre de calculer les déplacements, dans trois dimensions, requises par le manipulateur d'électrode pour atteindre une position donnée dans le microscope système de coordonnées:
      figure-protocol-2
    8. En utilisant le point de référence initial et la matrice de cosinus de déterminer la position de chaque électrode dans le microscope coordonnées.
    9. Afficher graphiquement, sur la base de coordonnées, la position de chaque électrode à intervalles réguliers le microscope. Nous avons choisi d'utiliser / C + + bibliothèques dessin C (GDI +) pour dessiner les positions d'électrodes toutes les 40 ms.
    10. Répéter les étapes 1.2.1 - 1.2.7 chaque fois angles manipulateurs sont modifiées, ou si les changements de position de plusieurs millimètres sont nécessaires, par exemple, lorsque le type d'électrode est modifiée.
  3. Activer le stockage de la positions des caractéristiques pertinentes dans le tissu, comme des cellules ou des points de référence anatomiques, en coordonnées microscope.
  4. Acquérir vidéo et superposer des informations pertinentes.
    1. Mécaniquement aligner l'axe des x de déplacement du microscope avec l'axe horizontal de la caméra du microscope.
    2. Installer sur l'ordinateur un framegrabber avec la vidéo en direct et la capacité de recouvrement et un kit de développement logiciel (SDK).
    3. Mettre en œuvre l'opération en direct d'affichage vidéo avec le SDK.
    4. Convertir le microscope système de coordonnées dans le système de référence de la caméra par la traduction et mise à l'échelle appropriée.
    5. Dessiner les éléments pertinents en coordonnées de la caméra et de recouvrement sur ​​la vidéo de l'image résultante en direct à intervalles réguliers d'environ 40 ms (figure 3).
  5. Amplificateurs de contrôle.
    1. Utilisez le logiciel de l'amplificateur pour contrôler les paramètres de l'amplificateur de l'interface.
  6. Control oscilloscopes.
    1. Connectez les oscilloscopes à l'ordinateur en utilisant des ports série.
    2. Déterminer l'échelle de l'oscilloscope, l'accouplement et la résolution temporelle pour les différentes étapes de la procédure de patch-clamp en voltage-clamp (par exemple électrode dans le bain, la formation de joint, configuration cellule entière) et le courant-clamp.
    3. Envoyer les commandes de réglage de l'oscilloscope appropriées lorsque les commandes de l'amplificateur sont émis à partir de l'interface.
  7. pression de la pipette de contrôle.
    1. Assembler un système de contrôle de pression selon la figure 4.
      1. Utilisez une alimentation 12 V / 5 V pour alimenter chaque composant électronique appropriée.
      2. Connecter la sortie d'une pompe à membrane dans le tampon de pression positive (un récipient de 100 ml).
      3. Connecter l'entrée d'une pompe à membrane dans le tampon de pression négative (un récipient de 100 ml).
      4. Raccorder le tuyau de support de pipette d'un capteur de pression dans le pressure système de commande et une vanne pneumatique qui se connecte à la chambre de pression principale.
      5. Relier chacun des tampons de pression pour une vanne reliée à la chambre de pression principale.
      6. Connectez une vanne entre le compartiment principal de pression et l'atmosphère.
      7. Connecter un capteur de pression à la chambre de pression principale.
      8. Connecter un capteur de pression pour chaque tampon.
      9. Connectez le système de contrôle de pression à une carte d'acquisition de données.
      10. Connecter chaque capteur de pression à une entrée analogique.
      11. Connectez chaque soupape à une sortie numérique.
    2. Retirer décalée par rapport à tous les capteurs par l'ouverture de toutes les vannes sauf ceux qui se connectent à des pompes à membrane et en soustrayant la pression mesurée à la pression atmosphérique.
    3. Mettre en œuvre le contrôle de la pression
      1. Définir dans l'interface d'un contrôle pour activer ou de désactiver le contrôle de pression positive pour chaque pipette.
      2. Définir une pression positive minimale pour la pipettes d'environ 70 mbar.
      3. Périodiquement (toutes les 0,5 secondes) détecter lorsque la pression dans les pipettes sous le contrôle de pression actif tombe en dessous du seuil fixé.
      4. Après le franchissement du seuil ouvrir le tampon de pression positive pour le compartiment de pression et ce compartiment vers la pipette en question pendant de brèves périodes (20 ms) jusqu'à ce que la pression dans les pipettes est au dessus du seuil. Fermez toutes les autres vannes.
      5. De-activer un contrôle supplémentaire de la pression que l'approche finale vers une cellule d'intérêt est lancé.
    4. Appliquer une pression négative pour la formation de joint
      1. Fermez tous les robinets et ouvrir la valve négative tampon de pression vers le compartiment de pression et ce compartiment vers la pipette en question pour la durée de l'expérimentateur nécessite en gardant un bouton enfoncé.
  8. Centraliser les commandes sur un dispositif d'interface humaine.
    1. Connectez un wirele disponible dans le commercess manette au PC.
    2. Mettre en œuvre une lecture de l'état de la manette. Par exemple, utiliser les bibliothèques DirectX pour C / C + + pour effectuer des lectures toutes les 5 ms.
    3. Comparer la situation actuelle avec l'état précédent de détecter les boutons ont été pressé, relâché ou maintenue enfoncée depuis dernière étape de temps.
    4. Assigner des fonctions à chaque bouton de la manette. Un exemple de cette application est représentée sur la Figure 5.

2. Patch-clamp procédure

  1. Préparer les tranches de cerveau de la région d'intérêt.
  2. Placer une tranche de cerveau d'intérêt, avec la région d'intérêt au centre de la plage de déplacement du microscope.
  3. Sélection de cellules
    1. Identifier les cellules d'intérêt en naviguant avec le microscope. Mémoriser la position des cellules sur la base du microscope système de coordonnées avec un droit de la souris, cliquez sur l'affichage de la vidéo en direct sur le dessus de la cellule d'intérêt.
      2. L'interface graphique permet d'afficher les cellules sélectionnées ainsi que les micropipettes pour une vue d'ensemble et de logiciels mondial va ajouter un marqueur sur la position de la cellule qui sera superposée sur les images. En outre une image de la cellule est capturée pour référence future dans le fichier 'portable #. Jpg ».
  • Attribution des cellules de pipettes
    1. Après avoir sélectionné les cellules d'intérêt, qui attribuer pipette enregistre chaque cellule. L'interface graphique fournit des contrôles d'affectation qui devraient être fixées. Visualiser un aperçu de la configuration finale en cochant la case "Afficher les positions finales.
    2. Sélectionnez chaque pipette pour qui la position finale l on souhaite ou cochez la case «Sélectionner tout». Désactiver l'affichage de la position actuelle pour une meilleure visualisation, si nécessaire.
  • Préparer les Pipettes
    1. Remplir les pipettes (6 - 8 MQ sont généralement mieux si nombreux pipettes sont utilisées) wième solution intracellulaire et les charger dans leurs détenteurs. Placez les headstages dans leurs fixations, mais ne pas les glisser vers l'avant pour éviter de toucher le bain avec la pointe de la pipette.
    2. Activer le contrôle de la pression positive et sélectionnez toutes les pipettes de s'assurer que les conseils resteront propres. Faites glisser doucement chaque headstage en place.
  • Localisation des embouts de pipette
    1. Placez le microscope à une position centrale avec un accent 3 mm au-dessus de la tranche en appuyant sur le bouton R2 tout en maintenant la touche 'A'. Utilisez la position correspondante pour chaque manipulateur stockée dans l'expérience précédente en appuyant sur la touche L2 tout en maintenant le bouton A.
      Remarque: À ce stade, il devrait y avoir soit une ombre distinctif d'une pipette en vue ou un petit mouvement le long de l'axe de la pipette devrait être suffisant pour l'observer dans la plupart des cas. Compensation pour les légères différences dans la forme de la pipette doit être effectuée manuellement.
    2. Apportez la pointe de la pipette dans le foyer. Placer l'embout sur le point rouge au centre de l'écran vidéo sans déplacer le microscope (il devrait toujours être en position [0, 0, 2000]).
    3. Informer le logiciel que la pipette est au centre de l'écran en appuyant sur la touche Z tout en maintenant le bouton C. Après chaque pointe de la pipette se trouve, l'envoyer pipette arrière de sorte que le suivant peut être situé en appuyant sur la touche L1 tout en maintenant le bouton A.
  • Approcher les cellules
    1. Une fois tous les embouts de pipette ont été précisément situé et chaque pipette est attribué à une cellule, positionner automatiquement les pipettes à proximité de leurs cellules respectives. Faites un clic droit dans le centre du groupe de cellules et sélectionnez l'option "Cluster" dans le menu contextuel. Dans la fenêtre des options de cluster qui apparaîtra, sélectionnez toutes les pipettes que vous souhaitez placer en ce moment et cliquez sur «Allez avec toutes les pipettes vérifiés. Répétez cette opération pour chaque groupe de cellules d'intérêt.
    2. Perform l'approche finale manuellement. La position des pipettes par rapport à des cellules peut être défini différemment, mais est généralement simplement 200 um à une distance à partir de la cellule dans l'axe de la pipette et 200 um ci-dessus dans le sens vertical, ce qui est suffisant pour maintenir la pointe de la pipette à l'extérieur du tissu . Attendez jusqu'à ce que le positionnement des pipettes est terminé et déplacer le microscope vers une pipette en appuyant sur la touche R1 tout en maintenant la touche C.
    3. Recalibrer chaque position de la pipette en focalisant le microscope sur sa pointe n'importe où dans l'affichage vidéo et en appuyant sur le bouton B tout en maintenant le bouton C. Un quadrillage doit apparaître brièvement indiquant la position identifiée de la pipette. Si la position n'est pas correcte, placer la pointe sur le point central de l'affichage vidéo et appuyez sur la touche Z tout en maintenant la touche C.
  • Établir la configuration cellule attachée
    1. Assurez-vous que la cellule d'intérêt pour la pipette courant est correctementmarqué. Sinon déplacer le microscope pour correspondre à la cellule d'intérêt avec le point rouge central. Sélectionnez la cellule en appuyant sur le bouton Y tout en maintenant la touche C. Appuyez sur le bouton L2 tout en maintenant le bouton C pour positionner la pipette 200 um loin de sa cellule affectée, le microscope se déplace automatiquement à la position correspondante.
    2. Ajustez la position de la pipette afin qu'il corresponde le point rouge. Réglez le décalage en appuyant sur la touche R1 tout en maintenant le bouton X. pipette
    3. Activer l'impulsion de test en appuyant sur la touche L1 tout en maintenant le bouton X. approcher lentement la pipette à sa cellule attribué.
    4. Lors de l'observation de la formation d'une fossette à la surface de la membrane de la cellule appliquer une brève impulsion de pression négative en appuyant sur la touche Y, tout en maintenant la touche Z pour permettre à la pression appliquée pour accéder à la cellule. Un potentiel de maintien de l'ordre de-65mV devrait établie à ce stade en appuyant sur le bouton L2 tout en maintenant la touche X.
  • Configuration cellule entière
    1. Une fois qu'un Giga-joint est formé, pour chaque cellule, commencer la rupture des membranes en appliquant une pression négative.
  • Effectuer des enregistrements
    1. Utilisez le système de stimulation / acquisition pour effectuer vos enregistrements. Appliquer des impulsions ou des trains d'impulsions sur une cellule individuelle à un moment et observer les réponses sur les cellules restantes de la carte la connectivité entre les cellules enregistrées.
  • Reculer pipettes
    1. Une fois les enregistrements terminés, reculer pipettes lentement du tissu par un clic droit sur le bouton radio de table. Sélectionnez «reculer-> Pipettes 500 um 'avoir les pipettes reculent à une courte distance le long de leurs axes. Observer la dérive du potentiel des cellules (effacer les conseils en appliquant une certaine pression positive peut aider).
    2. Pour reculer pipettes tout le chemin du retour, régler la vitesse de positionnement de «Fast» et répétez la même opération mais choisissez l'option "Tous". Retirez le utiliséepipettes en glissant doucement sur les headstages et dévissant les pipettes des détenteurs. Il est utile pour éviter la torsion des titulaires dans leurs orbites car cela pourrait grandement nuire à la position de la pointe de la pipette.

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    Résultats

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    Après les méthodes décrites ci-dessus nous avons réussi à effectuer un enregistrement à cellules entières jusqu'à douze neurones simultanément, doublant presque le plus grand nombre de neurones simultanément patch-serrée jusqu'à présent. Des exemples de réseaux de connexions synaptiques directes entre les neurones pyramidaux enregistrée dans la couche V du cortex somato-sensoriel chez le rat sont présentés dans la figure 6.

    La détermination de profils de probabilité de conne...

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Une question se pose immédiatement général concernant le taux de réussite de la procédure que nous avons décrit. Pour les taux de réussite élevés préparation est essentielle. Les pipettes doivent avoir des ouvertures de pointe qui sont adéquates pour les cellules des êtres enregistrées. Filtrer la solution intracellulaire pour éviter le colmatage des pipettes est également important. Extrêmement propre, pipettes fraîchement tirées sont une autre exigence. Une distribution binomiale est le modèle le plus simple qui peut ...

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    Déclarations de divulgation

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

    Remerciements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Nous tenons à remercier Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, et Sonia Garcia pour de précieux conseils sur l'amélioration de la procédure d'automatisation de patch-clamp. Nous remercions Rajnish Ranjan pour obtenir des conseils et de l'aide avec la mise en œuvre de logiciels utiles. Ce travail a été financé en partie par le projet de l'UE Synapse et en partie par la Human Frontiers Science Program.

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    Matériaux

    Liste des matériaux utilisés dans cet article
    NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
    MicroscopeOlympusBX51WI40X Manipulateurs d’objectifs à immersion
    Luigs NeumannSM-5Protocole série utilisé
    AmplificateursAxon InstrumentsMultiClamp 700BSDK d’occasion
    CameraTill PhotonicsVS 55BNC sortie analogique
    FramegrabberData TranslationDT3120SDK d’occasion
    OscilloscopesTektronixTDS 2014Communication série
    Acquisition de donnéesInstruTECHITC 1600
    Acquisition de donnéesNational InstrumentsPCI-6221Bibliothèque utilisée (.dll)
    Soupape de pressionSMCSMC070C-6BG-32
    Capteur de pressionHoneywell24PCDFA6G
    Membrane pompeSchegoOptimal

    Références

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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    Mots-clés

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