Quantification temporelle d'expression MAPK induite en simples cellules de levure

Summary

Deux méthodes complémentaires basées sur la cytométrie en flux et la microscopie sont présentées qui permettent la quantification, au niveau de la cellule unique, de la dynamique de l'expression génique induits par l'activation d'une voie de MAPK dans la levure.

Abstract

La quantification de l'expression des gènes au niveau d'une seule cellule découvre les mécanismes de régulation nouveaux occultés dans les mesures effectuées au niveau de la population. Deux méthodes basées sur la microscopie et cytométrie en flux sont présentés pour démontrer comment ces données peuvent être acquises. L'expression d'un rapporteur fluorescent induit lors de l'activation de la voie MAPK glycérol haute osmolarité dans la levure est utilisé comme un exemple. Les avantages spécifiques de chacune de ces méthodes sont mises en évidence. Cytométrie de flux mesure un grand nombre de cellules (10 000) et fournit une mesure directe de la dynamique de l'expression protéique indépendante de la cinétique de maturation lente de la protéine fluorescente. Imagerie des cellules vivantes par microscopie est en revanche limitée à la mesure de la forme mature de la journaliste dans moins de cellules. Cependant, les ensembles de données générées par cette technique peuvent être extrêmement riches grâce à la combinaison de plusieurs journalistes et à l'information spatiale et temporelleobtenu à partir de cellules individuelles. La combinaison de ces deux méthodes de mesure peut offrir de nouvelles perspectives sur la régulation de l'expression de la protéine par des voies de signalisation.

Introduction

La signalisation par l'intermédiaire de cascades de transduction aboutit souvent à l'expression de protéines. La caractérisation de ce profil d'expression est un élément clé dans la compréhension de la fonction des voies biologiques. L'identification du spectre de régulés à la hausse des protéines et la dynamique de leur activation peut être réalisée par diverses techniques telles que les micro-réseaux, des taches ou des taches Nord Ouest ^1-3. Cependant, ces moyens techniques de la réponse d'une population entière de cellules. Pour comprendre la régulation fine de l'expression des protéines, il est souhaitable de recueillir des mesures au niveau de la cellule unique. Idéalement, ces mesures devraient également fournir des données quantitatives se prêtent à développer des modèles mathématiques de la voie sous-jacent.

Microscopie et cytométrie en flux deux techniques, qui sont idéalement adaptés à la diffusion de telles mesures quantitatives de cellules individuelles. Le marquage endogène des protéines avec une protéine fluorescente peut be utilisé pour quantifier le niveau d'expression de ^4. Cependant, étant donné que l'addition d'un grand fragment fluorescent à l'extrémité de la protéine peut rendre non fonctionnel, il est souvent plus souhaitable de générer reporters d'expression spécifiques basés sur un promoteur commandant l'expression d'une construction fluorescent. Cette protéine rapporteur est exogène au système cellulaire et donc n'influence pas les événements de signalisation qui se déroulent dans la cellule.

À la fois la microscopie et la cytométrie en flux ont été largement utilisés dans le domaine de signalisation de la levure. A titre d'exemples, Colman-Lerner et collègues corrélés, dans des cellules individuelles, l'expression de l'accouplement journalistes spécifiques et exprimées de manière constitutive par microscopie à quantifier le bruit dans la levure accouplement transduction du signal cascade ^5, Acar et ses collègues ont utilisé la cytométrie en flux pour étudier le réseau de régulation contrôler l'expression des gènes GAL ^6. Dans une étude précédente ^7, nous avons utilisé un combinatisur ces deux techniques pour étudier la sortie de l'expression de l'osmolarité glycérol élevé (HOG) de la voie dans la levure bourgeonnante. Cette mitogen activated protein kinase (MAPK) est déclenchée par le stress hyper-osmotique. Elle se traduit par l'activation des MAPK Hog1, qui subit une translocation vers le noyau de la cellule pour induire la transcription d'un programme résultant dans l'expression d'approximativement 300 gènes. Pour étudier ce processus, nous avions conçu un journaliste d'expression basé sur le promoteur de STL1 (un gène induit spécifiquement en réponse à l'activité de Hog1 ⁸⁾ entraînant l'expression d'une protéine fluorescente Vénus quadruple (p STL1-qV). La cytométrie en flux des mesures ont découvert la présence de deux populations de cellules au niveau de la tension intermédiaire (0,1 M de NaCl) avec seulement une fraction de la population exprimant le rapporteur fluorescent. Nous avons utilisé la microscopie à approfondir ce comportement et découvert que ce bruit dans l'expression de la protéine a été régie par des facteurs intrinsèques ^9. Nous Could en outre observer que les cellules avec un niveau d'activité similaire Hog1 pourraient afficher de façon saisissante différents résultats d'expression. La combinaison de ces deux techniques nous a permis de montrer comment le remodelage lent des gènes de réponse au stress influencé le résultat de l'expression au niveau d'une seule cellule ^7.

Dans cet article, nous utilisons l'expression de la p-qV STL1 journaliste induite par le choc hyper-osmotique, par exemple, de la quantification de l'expression des protéines par microscopie et cytométrie de flux. La même souche soumis à NaCl 0,2 M de stress a été étudiée avec les deux techniques. Cela nous permettra de mettre en évidence certaines différences clés dans ces deux techniques très complémentaires.

Protocol

Une. Mesures de microscopie

1. Inoculer 5 ml de milieu synthétique avec de la levure.
2. Cultiver des cellules à 30 ° C pendant la nuit.
3. Mesurer la DO ₆₀₀ de la culture pendant une nuit, le lendemain matin.
4. Diluer culture d'une nuit dans 5 ml de milieu synthétique OD ₆₀₀ 0,05.
5. Cultiver la culture diluée à 30 ° C pendant au moins 4 heures.
6. Préparer trois fois concentré (0,6 M) une solution de NaCl dans un milieu synthétique.
7. Préparer une solution à 1 mg / ml de concanavaline de A (ConA) dans du PBS.
8. Filtrat ~ 200 pi de solution ConA dans la glissière de bien.
9. Laisser reposer pendant 30 min.
10. Retirer la solution ConA.
11. Ajouter 150 ul de H ₂ O dans le puits.
12. Retirer H ₂ O.
13. Mesurer la DO ₆₀₀ de la culture cellulaire.
14. Préparer 300 pl de culture cellulaire à _DO600 = 0,02 dans un microtube de 1,5 ml.
15. Soniquer les cellules dans un bain d'eau pendant 45 sec.
16. Vortex brièvement la microtube.
17. Soniquer les cellules dans un bain d'eau pendant 45 sec.
18. Vortex brièvement le microtube.
19. Ajouter 200 ul de la culture de cellules dans le puits.
20. Attendre 30 minutes pour laisser les cellules se déposent au fond du puits.
21. Placer la lame de bien sur le microscope.
22. Sélectionnez les réglages de l'éclairage pour le canal de fluorescence à enregistrer.
23. Sélectionnez les paramètres d'éclairage pour deux images de fond clair (un peu hors-sujet: 3 um ci-dessous le plan focal pour permettre une segmentation correcte des cellules).
24. Sélectionnez les intervalles de temps pour la mesure time-lapse
25. Sélectionnez les champs de vue de l'image.
26. Lancement de l'acquisition de quelques images.
27. Pause de l'acquisition d'ajouter les 100 ul de 0,6 M de NaCl moyen.
28. Reprendre imagerie.

2. Les mesures de cytométrie en flux

1. Inoculer 5 ml de milieu synthétique avec de la levure.
2. Croître à 30 ° C pendant la nuit.
3. Mesurela _DO600 de la culture pendant une nuit, le lendemain matin.
4. Diluer culture d'une nuit dans 5 ml de milieu synthétique DO ₆₀₀ de 0,1.
5. Croître à 30 ° C pendant au moins 4 heures pour atteindre une _DO600 de 0,2-0,4.
6. Préparer la solution de cycloheximide 1 mg / ml dans H ₂ O.
7. Préparer trois fois concentré (0,6 M) une solution de NaCl dans un milieu synthétique.
8. Préparer un microtube de 1,5 ml avec 100 ul de 0,6 M de NaCl moyen pour chaque point de temps pour être mesurés.
9. Au temps 0, ajouter 200 ul de la culture de cellules à chaque microtube.
10. Incuber sous agitation à 30 ° C.
11. A l'instant T, ajouter 30 ul de cycloheximide à un microtube.
12. Répéter l'étape 2.11 pour tous les points de temps désirés.
13. Incuber les microtubes pendant au moins 45 minutes et jusqu'à 3 heures à 30 ° C avec agitation par secousses.
14. Préparer des tubes FACS avec 400 ul de PBS.
15. Soniquer les cellules dans un bain d'eau pendant 1 min.
16. Vortex brièvement les microtubes.
17. Filsicat les cellules dans un bain d'eau pendant 1 min.
18. Vortex brièvement les microtubes.
19. Ajouter 100 ul de culture cellulaire de chaque microtube à son tube FACS correspondant.
20. Sélectionnez le laser d'excitation de 488 nm et 530/30 nm filtre passe-bande pour la détection.
21. Test de non-expression et exprimer pleinement échantillon pour vérifier si elles tombent dans la plage de sensibilité de détection.
22. Mesurer 10.000 cellules pour chaque échantillon acquis.

Results

Microscopie

Les cellules de levure portant l'expression reporter p STL1-qV (ySP9 ⁷⁾ ont été fixées au fond de la diapositive et bien placés sous le microscope. Les cellules ont été stimulées par l'addition de milieu de contrainte directement dans le puits au cours de la session d'imagerie. Cela nous permet d'acquérir quelques images des cellules avant l'induction voie et suivons leur sort après la stimulation. Dans le cas présent, les cellules ont été suivis pendant ~ 2 heur...

Discussion

Microscopie

Le traitement des puits avec de la ConA est une étape essentielle pour assurer une imagerie appropriée des cellules. Parce que la ConA a une faible solubilité dans du PBS (5 mg / ml), le procédé de filtration permet l'élimination des gros agrégats qui sont présents dans la solution filtrée et interfèrent avec la formation d'image. Les cellules se fixent relativement fortement à la surface traitée et l'addition de la solution ne doit pas perturber l'induction de la lo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
réactif
base d’azote de levure	ForMedium	CYN6202
CSM mélange d’acides aminés	ForMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
Cycloheximide	Fluka Aldrich Sigma	C7698	Toxique
ySP9			W303Mata leu2 ::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope	Nikon	Ti-Eclipse
Logiciel de contrôle du microscope	Micro-manager	Ver 1.4.11
Chambre d’incubation	LIS	The Box
Lumière de fluorescence source	Lumencor	SpectraX
Caméra	Hamamatsu	Flash 4.0
Cytomètre	en flux BD	FACS calibur
Bain sonicateur	Télésonique	TUC-150
lames	Thermo Lab-tek	155409
plaque à 96 puits	Bioscience matricielle	MGB096-1-2-LG
FACS tube	BD Falcon	352054