Quantification simultanée de cellulaire et extracellulaire Composants des biofilms

Summary

Un protocole pour la quantification et la comparaison simultanées de trois composants cellulaires et extracellulaires dans des biofilms est présenté. La méthodologie implique l’utilisation d’une microscopie confocale à balayage laser, d’un logiciel d’analyse structurelle et de visualisation de biofilm et d’un logiciel d’analyse statistique.

Abstract

La microscopie confocale à balayage laser (CLSM) est un outil puissant pour l’étude des biofilms. Très peu d’études ont réussi à quantifier la distribution simultanée de plus de deux composants dans les biofilms parce que : 1) la sélection de colorants fluorescents ayant un chevauchement spectral minimal est compliquée, et 2) la quantification de plusieurs fluorochromes pose un problème multifactoriel. Objectifs: Présenter une méthodologie pour quantifier et comparer les distributions tridimensionnelles simultanées de trois composants cellulaires/extracellulaires de biofilms cultivés sur des substrats pertinents. méthode: La méthode comprend des étapes distinctes et interconnectées impliquant la croissance du biofilm, la coloration, l’imagerie CLSM, l’analyse structurelle et la visualisation du biofilm, et l’analyse statistique des paramètres structurels. Des biofilms de Streptococcus mutans (souche UA159) ont été cultivés pendant 48 heures sur des échantillons stériles de composites de résine Point 4 et TPH³. Les échantillons ont ensuite été immergés pendant 60 secondes dans des bains de bouche Biotène PBF (BIO) ou Listerine Total Care (LTO), ou dans de l’eau (groupe témoin ; n = 5/groupe). Des biofilms ont été colorés avec des fluorochromes pour des substances polymères extracellulaires, des protéines et des acides nucléiques avant d’être imagés avec CLSM. Les paramètres structurels du biofilm calculés à l’aide du logiciel d’analyse d’images ISA3D étaient le biovolume et l’épaisseur moyenne du biofilm. Des analyses statistiques de modèles mixtes ont comparé les paramètres structurels entre les groupes de rince-bouche et de contrôle (logiciel SAS ; α=0,05). Le logiciel Volocity a permis de visualiser les distributions 3D des composants de biofilm superposés (fluorochromes). résultats: Le rince-bouche BIO a produit des structures de biofilm qui différaient considérablement de celles du témoin (p<0,05) sur les deux composites de résine, tandis que le LTO n’a produit aucune différence (p>0,05) sur l’un ou l’autre produit. Conclusions: Cette méthodologie a permis de quantifier et de comparer efficacement et avec succès les distributions 3D simultanées de trois composants majeurs dans les biofilms de S. mutans sur des substrats pertinents, surmontant ainsi deux défis liés à l’évaluation simultanée des composants du biofilm. Cette méthode peut également être utilisée pour déterminer l’efficacité des agents antibactériens/antisalissures contre plusieurs composants du biofilm, comme le montrent les bains de bouche. De plus, cette méthode a une large application car elle facilite la comparaison des structures/architectures 3D des biofilms dans une variété de disciplines.

Introduction

Les biofilms sont des communautés microbiennes structurées qui sont encapsulées dans une matrice extracellulaire autoproduite, et sont attachées à des surfaces biologiques ou inertes¹. Les biofilms représentent un mode de vie commun à de nombreuses bactéries et se forment en passant par étapes de cellules flottantes (planctoniques) à des communautés multi-espèces complexes. La résistance inhérente des biofilms aux agents antimicrobiens est à l’origine de nombreuses infections bactériennes persistantes et chroniques^1,2, comme le démontrent les biofilms buccaux (plaque dentaire). Les micro-organismes cariogènes tels que les mutans, les streptocoques, traitent le saccharose et d’autres glucides pour produire une matrice extracellulaire et générer des acides qui peuvent déminéraliser la structure des dents et provoquer des caries dentaires. La plupart des matrices de biofilm sont des biopolymères constitués de composants cellulaires et extracellulaires tels que des exopolysaccharides (EPS), des protéines et des acides nucléiques^3,4.

La microscopie confocale à balayage laser (CLSM), la technique la plus largement utilisée pour l’imagerie de fluorescence, a radicalement transformé l’imagerie optique en biologie car elle a la capacité de collecter des images 3D de structures biologiques hydratées sans fixation^5,6,7. Cette technique non destructive consiste à collecter des images de lames minces dans une région d’intérêt sur l’échantillon de manière à ce que la contribution de la lumière floue soit supprimée. La qualité et la résolution des images capturées par CLSM sont au-delà de ce qui est réalisable avec la microscopie à fluorescence à grand champ. L’un des principaux inconvénients de la CLSM est que le balayage des images se produit à un rythme plus lent qu’avec les techniques de microscopie à grand champ, dans lesquelles des images entières sont collectées simultanément⁵. Cependant, avec une sélection croissante de fluorochromes, de lasers et de filtres, la CLSM est devenue l’une des techniques dominantes pour l’imagerie multispectrale^5,7.

Des études antérieures ont montré que la CLSM est un outil utile pour examiner la structure ou l’architecture des biofilms en utilisant une ou deux étiquettes fluorescentes ou des colorants pour mieux comprendre la distribution de l’EPS et des cellules dans les biofilms, et en particulier dans la matrice extracellulaire^7,8. En théorie, la coloration fluorescente / le marquage de plusieurs composants est souhaitable pour explorer la structure détaillée et la colocalisation des composants cellulaires et extracellulaires dans les biofilms. Cependant, l’analyse simultanée de divers composants dans les biofilms peut s’avérer difficile pour les raisons suivantes : 1) la sélection de colorants fluorescents ayant un chevauchement spectral minimal est compliquée, et 2) la quantification de plusieurs fluorochromes pose un problème multifactoriel. La colocalisation à l’aide de plusieurs fluorochromes nécessite l’utilisation de colorants très spécifiques avec une interférence spectrale minimale pour éviter tout effet de fuite, ce qui se produit lorsque deux fluorochromes ont un chevauchement significatif dans leur pic spectral, ce qui fait que l’un est plus fortement excité que l’autre⁹. Idéalement, les fluorochromes ayant des spectres d’excitation qui ne se chevauchent pas donneraient les meilleurs résultats, mais il est très difficile de trouver des colorants qui répondent à ce critère. Au lieu de cela, la sélection des colorants est optimisée en choisissant des fluorochromes dont les spectres d’émission se chevauchent minimalement, ce qui permet de visualiser les colorants un par un dans une bande d’onde d’observation limitée⁹.

La superposition d’images de fluorescence est probablement la méthode la plus largement utilisée pour évaluer la distribution simultanée des fluorochromes. La colocalisation des différents composants se manifeste par un chevauchement de différentes couleurs à travers de multiples canaux créés par les fluorochromes examinés¹⁰. Les outils permettant d’afficher des images de fluorescence multicanaux sous forme d’images couleur fusionnées sont disponibles dans la plupart des logiciels CLSM et des logiciels d’analyse d’images biologiques. Bien que la superposition d’images soit utile pour l’évaluation spatiale de la colocalisation, les images ne peuvent être examinées qualitativement que par une analyse visuelle. Cela fournit une quantité limitée d’informations, car ces représentations ne sont généralement pas utiles pour quantifier la colocalisation dans différentes conditions expérimentales et ne déterminent pas non plus si la colocalisation dépasse la coïncidence^{aléatoire 11}. Jusqu’à présent, très peu d’études ont utilisé des méthodes quantitatives pour analyser la structure tridimensionnelle des biofilms et des composants de biofilms, et encore moins ont quantifié l’effet des traitements antibactériens ou des mesures antisalissure sur les composants du biofilm.

L’objectif de cette étude était de présenter une méthodologie de quantification et de comparaison des distributions tridimensionnelles concurrentes de trois composants cellulaires et extracellulaires de biofilms. La méthode comprend des étapes distinctes mais interconnectées impliquant la croissance du biofilm, la coloration, l’imagerie CLSM des biofilms, l’analyse structurelle et la visualisation du biofilm, et l’analyse statistique des paramètres structurels. Le test de croissance du biofilm permet la croissance du biofilm sur des substrats pertinents et produit des structures de biofilm reproductibles. La combinaison d’une nouvelle coloration simultanée de l’EPS, des protéines et des composants d’acides nucléiques avec la mesure des paramètres structurels des biofilms 3D permet d’obtenir des distributions quantifiables des composants dans les biofilms. L’analyse statistique des paramètres structurels du biofilm facilite l’évaluation des biofilms dans des conditions expérimentales spécifiques (par exemple après un traitement avec des bains de bouche), comme nous le verrons dans la section suivante.

Protocol

1. Préparation des milieux et des réactifs

1. Préparez 300 ml de milieu de culture de nuit (THY ; bouillon Todd Hewitt à 3 % préparé selon les instructions du fabricant complété par 0,3 % d'extrait de levure dans de l'eau ultrapure) et autoclave. Conserver à température ambiante jusqu’à 2 mois.
2. Préparez 1 L d’agar THY (3 % de bouillon Todd Hewitt, 0,3 % d’extrait de levure et 1,5 % d’agar dans de l’eau ultrapure), autoclave, et laissez refroidir à 60 °C avant de verser dans des boîtes de Pétri. Conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois.
3. Préparez 150 ml de milieu de croissance de biofilm (0,5X TY complété par 10 mM de saccharose, 1,5 % de tryptone, 0,5 % d’extrait de levure et 10 mM de saccharose dans de l’eau ultrapure) et filtrez la stérilisation. Conserver à température ambiante jusqu’à 1 mois.
4. Préparez 1 L de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ et 0,24 g de KH₂PO₄ dans de l’eau ultrapure) et d’autoclave. Conserver à température ambiante pendant plusieurs mois.
5. Préparez 600 ml de tampon Tris HCl de 10 mM complété par 10 mM de CaCl₂ dans de l’eau ultrapure (tampon TC ; pH 7,2) et en autoclave. Conserver à température ambiante pendant plusieurs mois.
6. Autoclave 1 L d’eau ultra-pure. Conserver à température ambiante pendant plusieurs mois.

2. Fabrication de l’échantillon

1. Fabriquez des échantillons en forme de disque de composites de résine dentaire Point 4 (PF) et TPH³ (TP) dans un moule en acier inoxydable sur mesure en deux incréments. Chaque incrément est photopolymérisé pendant 40 secondes à l’aide d’une unité de photopolymérisation LED. Les deux produits ont des compositions et des niveaux de charge légèrement différents, ce qui produit des topographies de surface différentes sur lesquelles les biofilms seront cultivés.
   1. Des échantillons de substrats pertinents ont pu être fabriqués à l’aide de protocoles établis dans d’autres disciplines au lieu de l’étape 2.1.
2. Finissez et polissez les éprouvettes jusqu’à ce qu’ils atteignent une finition de surface finale acceptable, par exemple à l’aide d’une meuleuse-polisseuse semi-automatisée. Rincer les échantillons polis à l’eau ultra-pure et les sécher à l’air comprimé.
3. Stérilisez les échantillons à l’aide d’oxyde d’éthylène gazeux ou d’une autre méthode de stérilisation.

3. Croissance du biofilm

1. Inoculer une seule colonie de S. mutans dans 4 ml de milieu de culture pendant la nuit (étape 1.1). Incuber toute la nuit à 37 °C pendant 16-18 heures. La densité optique (OD₆₀₀) de la culture doit être de ≥0,9.
   1. Il est préférable d’utiliser une colonie à partir de cultures sur plaques qui ont été passées 2x à partir d’un stock d’origine, car cela entraîne une croissance plus cohérente du biofilm.
2. Créer une dilution de 1:100 à l’aide de la culture de nuit (étape 1.1) dans 10 ml de milieu de croissance de biofilm (étape 1.3).
3. Transférez des échantillons composites de résine stérile (par exemple PF, TP) sur des plaques stériles à 12 puits.
4. Ajouter 2,5 ml de milieu de culture dilué (étape 3.2) dans les puits de traitement (bain de bouche) et les groupes témoins. Ajouter 2,5 ml de milieu de croissance de biofilm stérile non inoculé dans les puits de contrôle de la stérilité.
5. Cultivez les biofilms dans des conditions microaérophiles. Placez les assiettes sur un agitateur à 100 tr/min à l’intérieur d’un incubateur à 37 °C pendant 24 heures.
6. Après 24 heures, aspirer aseptiquement le milieu de tous les puits et laver deux fois avec du PBS stérile (étape 1.4 ; 2,5 ml/puits), en aspirant le PBS après chaque lavage. Réapprovisionnez 2,5 ml de milieu de croissance de biofilm frais dans chaque puits et incubez pendant 24 heures supplémentaires dans des conditions identiques à celles de l’étape précédente, pour un temps de croissance total du biofilm de 48 heures.
7. Au lieu des étapes ci-dessus, des biofilms d’autres espèces pourraient être cultivés sur des substrats en utilisant des protocoles établis.

4. Traitements antibactériens/bains de bouche

1. Milieu d’aspiration une fois la croissance du biofilm terminée.
2. Ajoutez 2,5 ml de rince-bouche Biotène PBF (BIO) ou Listerine Total Care (LTO), ou une autre modalité de traitement, dans les puits pour les groupes de traitement, et ajoutez 2,5 ml d’eau stérile ultrapure dans le puits du groupe témoin. Immerger les échantillons pendant 60 secondes, selon les instructions du fabricant, tout en agitant les plaques sur un agitateur orbital à 150 tr/min. Aspirez immédiatement le bain de bouche et l’eau ultrapure des puits.
3. Lavez les échantillons 5 fois pendant 15 secondes par lavage avec de l’eau ultrapure stérile sur l’agitateur orbital à 150 tr/min, en aspirant de l’eau après chaque étape de lavage.
4. Au lieu des étapes ci-dessus, d’autres agents antibactériens pourraient être testés à l’aide de protocoles établis.

5. Coloration

1. Préparez les dilutions de coloration pour l’analyse du biofilm.
   1. Préparez une solution mère à 5 mg/ml de conjugué Concanavalin A, Alexa Fluor 647 (AF) dans du bicarbonate de sodium 0,1 M pH 8,3. Conserver à -20 °C dans des aliquotes à usage unique pendant plusieurs mois car la congélation et la décongélation sont déconseillées. À l’aide de cette solution mère d’AF, préparer une dilution de 250 μg/ml dans un tampon TC.
   2. Préparer une dilution de 10 μM à l’aide de la solution mère de Syto 9 (SY) de 5 mM, fournie par le fabricant, dans un tampon TC. Conservez le reste de la solution mère SY à -20 °C pendant plusieurs mois.
   3. Préparez une dilution 10x en utilisant la solution mère (SR) Sypro Red 5 000x, telle que fournie par le fabricant, dans de l’eau ultrapure stérile. Conservez le reste de la solution mère SR à -20 °C pendant plusieurs mois.
2. Lavez tous les biofilms 2 fois avec un tampon TC (2,5 ml/puits) en utilisant un mouvement de rotation de la main, en laissant le deuxième lavage dans la plaque pendant 30 minutes à température ambiante. Aspirer.
3. Placez une goutte de 50 μl de colorant AF sur chaque échantillon de biofilm. Colorer 30 min à température ambiante, à l’abri de la lumière. Laver 2 fois avec un tampon TC (2,5 ml/puits), en aspirant après chaque lavage.
4. Appliquez ensuite une goutte de 50 μl de colorant SY sur chaque échantillon de biofilm. Colorer 30 min à température ambiante, à l’abri de la lumière. Laver 2 fois avec de l’eau stérile ultrapure (2,5 ml/puits), en aspirant après chaque lavage
5. Enfin, placez une goutte de 50 μl de colorant SR sur chaque échantillon de biofilm. Colorer 30 min à température ambiante, à l’abri de la lumière. Laver 3 fois avec de l’eau stérile ultra-pure (2,5 ml/puits), en aspirant après chaque lavage.
6. Transférez les échantillons dans une plaque à 6 puits, en plaçant un échantillon par puits dans 6 ml d’eau ultrapure stérile pour faciliter la microscopie confocale.

6. Imagerie par microscopie confocale à balayage laser

1. Acquérir des images de chaque composant (colorant) dans les biofilms des groupes de traitement et de contrôle à l’aide des paramètres du microscope confocal à balayage laser indiqués au tableau 1. Un objectif plongeant 63X avec une ouverture numérique de 0,9 et une distance de travail de 2,2 mm a été utilisé dans cette étude.
   
2. Réglez la taille de balayage sur 250 μm x 250 μm et une résolution minimale de pixels de 512 x 512 pour acquérir des images CLSM à une résolution adéquate pour l’analyse quantitative.
3. Utilisez la coloration SY pour définir les points supérieur et inférieur de la pile d’images du biofilm, puis réglez le pas z pour qu’il soit adéquat pour l’analyse quantitative (0,6 μm pour cette étude). Avant de collecter un scan, optimisez les paramètres de l’image et de la coloration (c’est-à-dire la tension et le décalage PMT) à l’aide de l’option QLUT. Une table de recherche des couleurs a été utilisée pour attribuer des pseudo-couleurs à chaque coloration (vert pour SY, rouge pour SR et bleu pour AF) afin de rendre chaque composant du biofilm plus distinct dans la reconstruction 3D.
4. Collectez des images CLSM à 400 Hz à l’aide d’un balayage séquentiel en mode « entre les piles » pour optimiser la capture d’images de plusieurs colorants au sein d’un même biofilm.

7. Analyse structurale du biofilm

1. Analyser les images CLSM collectées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images pour les biofilms. Les étapes suivantes décrivent l’utilisation du logiciel ISA3D¹² pour calculer les paramètres structurels des images de biofilm collectées.
   1. Copiez les fichiers d'image CLSM de chaque biofilm dans le dossier Images, comme spécifié dans le manuel du logiciel. Assurez-vous que la convention de nommage des fichiers CLSM requise par le logiciel est respectée. Le logiciel permet d’analyser les fichiers dans les sous-dossiers en mode batch, facilitant ainsi l’analyse des biofilms de traitement et de groupe témoin dans le même cycle.
   2. Entrez les dimensions des axes x, y et z des images CLSM dans les champs dxy et dz de la boîte de dialogue principale. Sélectionnez les paramètres de cartographie de seuil et de distance, comme décrit dans le manuel du logiciel (Otsu et Quasi-Euclidien ont été utilisés pour cette étude, respectivement). Entrez un nom approprié pour le fichier de résultats, puis exécutez le programme. Un fichier de résultats sera généré dans le dossier ISA.
   3. Consultez le fichier de résultats pour obtenir des valeurs pour vingt paramètres structurels 3D¹² tels que le biovolume et l’épaisseur moyenne du biofilm (mesurée dans cette étude) qui quantifient la distribution 3D de chaque composant (colorant) au sein du biofilm.

8. Visualisation de la structure du biofilm

1. Créez une reconstruction des composants superposés (colorants) dans chaque biofilm à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Les étapes suivantes décrivent l’utilisation du logiciel Volocity pour créer des reconstructions 3D.
   1. Créez une bibliothèque pour chaque biofilm en copiant les fichiers d’image CLSM dans le logiciel, comme décrit dans le manuel.
   2. Utilisez l’option de menu Rendu 3D pour produire une image 3D reconstruite à partir des images CLSM de chaque biofilm (le format d’opacité HR a été utilisé pour cette étude).
   3. Faites pivoter l’image 3D pour orienter tous les biofilms de la même manière par rapport aux axes des coordonnées x, y et z. Capturez un instantané de la reconstruction du biofilm correctement orientée, puis exportez-le au format TIFF, JPEG ou dans un autre format approprié.
2. Effectuer une analyse visuelle de la distribution simultanée de l’EPS, des protéines et des composants d’acides nucléiques dans les biofilms sur les images reconstruites.
3. Utilisez le coefficient de corrélation de Pearson et le coefficient de chevauchement de Manders pour effectuer une analyse de colocalisation de plusieurs composants du biofilm (la colocalisation n'a pas été mesurée dans cette étude).

9. Analyse statistique

1. Utiliser des analyses statistiques de modèles mixtes distincts pour comparer les valeurs moyennes des paramètres structurels entre les groupes de rince-bouche et de contrôle (α=0,05). Pour cette étude, le logiciel SAS a été utilisé pour effectuer l’analyse statistique.

Results

Des résultats représentatifs pour les traitements (bains de bouche) et le groupe témoin non traité sont présentés dans le tableau 2 et les figures 1 et 2. Le tableau 2 présente les valeurs moyennes et d’écart-type des paramètres structurels du biofilm, le biovolume (μm³) et l’épaisseur moyenne du biofilm (μm) qui ont été calculés à l’aide du logiciel ISA3D. Les paramètres structurels des biofilms traités avec un rince-bouche qui différaient significativement de ceux des biofilms du groupe témoin (p<0,05) ont des valeurs moyennes et d’écart-type surlignées en rouge. Les résultats des analyses statistiques des modèles mixtes ont démontré que le rince-bouche BIO produisait des structures de biofilm qui différaient significativement du témoin (p<0,05) sur les deux composites de résine, tandis que le rince-bouche LTO ne produisait pas de différences significatives (p>0,05) sur l’un ou l’autre des composites de résine. Les résultats montrent clairement que les composants du biofilm cellulaire et extracellulaire restant après les deux traitements de rince-bouche différaient. Il convient également de noter que les biofilms de S. mutans cultivés sur les deux substrats (PF et TP) différaient par leur structure 3D, même s’ils ont été cultivés dans des conditions similaires et que les deux substrats ont été polis avec des abrasifs similaires.

La distribution simultanée de l’EPS, des protéines et des acides nucléiques dans les biofilms peut être visualisée via les reconstructions 3D générées à l’aide du logiciel Volocity. Les figures 1 et 2 montrent des reconstructions représentatives de biofilms du groupe témoin cultivés sur des composites de résine PF et TP, respectivement. La coloration bleue représente l’EPS dans les biofilms de S. mutans, la coloration verte montre les acides nucléiques et la coloration rouge montre les protéines. L’espace intermédiaire peut être occupé par de l’eau ou d’autres composants de biofilms non marqués par fluorescence.

Cliquez ici pour agrandir la figure.

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Résine composite		Point 4		TPH3
bain de bouche	composant	VB (μm3)	MT (μm)	VB (μm3)	MT (μm)
Biotène PBF	Acides nucléiques	279 517±53 291	9.32±2.80	195 033±42 014	7,45±3,70
	Eps	344 902±56 386	35.22±17.19	197 840±62 351	9.83±7.26
	protéine	298 796±62 868	54.21±21.65	216 033±66 654	24.33±39.64
Listerine Soins Complets	Acides nucléiques	355 707±110 444	26.45±14.21	273 296±47 323	13.43±2.89
	Eps	494 099±180 592	64,90± 26,68	329 150±47 145	34.35±30.32
	protéine	348 416±161 316	58.68±47.28	303 150±54 705	34.18±41.46
Lutte (non traitée)	Acides nucléiques	388 375±42 152	51.15±40.66	327 809±39 400	17.08±1.65
	Eps	660 448±173 197	91.37±74.84	363 850±67 612	28.33± 15.07
	protéine	517 274±119 475	127.96±73.84	353 161±56 518	21.17±4.41

Tableau 2. Valeurs moyennes et d’écart-type du biovolume (BV) et épaisseur moyenne du biofilm (MT) des biofilms traités avec BIO ou LTO, ou laissés non traités (groupe témoin). Les paramètres structurels des biofilms traités avec des bains de bouche qui différaient significativement de ceux des biofilms du groupe témoin (p<0,05) ont des valeurs moyennes et d’écart-type surlignées en rouge.

Discussion

L’acquisition d’images CLSM doit être effectuée de la manière et dans le format nécessaires à la quantification des biofilms et à l’analyse de colocalisation, de sorte que la distribution de l’intensité du signal dans chaque image soit une représentation fiable de la distribution de chaque fluorochrome dans l’empilement de biofilms. L’intensité du signal doit pouvoir être distinguée du bruit et du bruit de fond^10,11, ne pas être affectée par l’autofluorescence du substrat et présenter un débordement minimal en raison des interférences spectrales entre les fluorochromes utilisés¹¹. Le bruit est une limitation inévitable de la microscopie à fluorescence¹¹, et la qualité de l’image peut parfois être limitée pour des raisons techniques ou logistiques. L’identification des fluorochromes avec un chevauchement spectral minimal est essentielle au succès de cette méthode, mais peut être compliquée. De plus, la quantification de plusieurs fluorochromes pose un problème multifactoriel. Par conséquent, il n’est pas surprenant que très peu d’études aient réussi à quantifier la distribution simultanée de plus de deux composants dans les structures des biofilms.

L’objectif de cette étude était de présenter une méthodologie composée d’étapes distinctes mais interconnectées pour la quantification et la comparaison des distributions tridimensionnelles concurrentes de trois composants cellulaires et extracellulaires dans les biofilms. L’essai de croissance du biofilm décrit permet la croissance du biofilm sur des substrats pertinents et produit des structures de biofilm reproductibles, comme le démontrent les résultats rapportés dans le tableau 1. La combinaison d’une nouvelle coloration simultanée de l’EPS, des protéines et des composants d’acides nucléiques avec la mesure des paramètres structurels des biofilms 3D permet d’obtenir des distributions quantifiables des composants dans les biofilms. L’analyse visuelle qualitative de la distribution simultanée de l’EPS, des protéines et des acides nucléiques dans les biofilms est possible grâce à la reconstruction des colorants superposés dans chaque biofilm. Le logiciel ISA3D¹² contient plusieurs paramètres structurels uniques tels que la dimension fractale, l’homogénéité et le coefficient de rugosité du biofilm, en plus des paramètres traditionnellement mesurés tels que la porosité et l’épaisseur du biofilm pour améliorer la quantification des structures 3D des biofilms. L’analyse statistique des paramètres structurels du biofilm permet des comparaisons pertinentes des biofilms dans des conditions expérimentales spécifiques telles que l’efficacité antibactérienne/antisalissure (par exemple après un traitement avec des bains de bouche) ou dans le temps (effets temporels).

Cette méthodologie a permis de quantifier et de comparer efficacement et avec succès les distributions 3D simultanées de trois composants majeurs dans les biofilms de S. mutans qui ont été cultivés sur des substrats pertinents, surmontant ainsi deux défis à l’évaluation simultanée des composants du biofilm. Cette méthode peut également être utilisée pour déterminer l’efficacité des traitements antibactériens ou des mesures antisalissure contre plusieurs composants du biofilm, comme le montre l’utilisation de bains de bouche dans cette étude. De plus, la majorité des protocoles décrits ci-dessus peuvent être remplacés par des protocoles pour la fabrication de substrats pertinents et des essais de croissance de biofilm de micro-organismes pertinents. Par conséquent, cette méthode a une large application car elle facilite la comparaison des structures/architectures 3D des biofilms in vitro et in vivo dans une variété de disciplines, notamment les sciences médicales, dentaires, géologiques et marines.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010
Bacto Todd Hewitt Broth	Becton, Dickinson and Company	249240
Extrait de levure, EMD granulé	Millipore	1.03753.0500
Bacto Tryptone	Becton, Dickinson and Company	211705
OmniPur Saccharose	EMD Millipore	8510
Chlorure de potassium, réactif ACS, 99,0-100,5 %	Sigma-Aldrich	P3911-500G
Phosphate de potassium, monobasique, &ge ; 99.0 %, Réactif ACS	Sigma-Aldrich	P0662-500G
Chlorure	de sodium Sigma-Aldrich	S9888-500G
Phosphate de sodium, monobasique, monohydraté	EMD Millipore	SX0710-1
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane, 99.8+ %, réactif ACS	Sigma-Aldrich	252859-500G
Concanavalin A, Alexa Fluor 647	Conjugue Invitrogen	C21421
Syto 9	Invitrogen	S34854
Sypro Red	Invitrogen	S12012 ou S6653
Biotè ; Rince-bouche PBF	GlaxoSmithKline	N/A
Listerine Total Care	McNeil-PPC, Inc.	n/a