Quantification simultanée de cellulaire et extracellulaire Composants des biofilms

Les biofilms sont des communautés microbiennes structurées qui sont encapsulées dans une matrice extracellulaire autoproduite, et sont attachées à des surfaces biologiques ou inertes¹. Les biofilms représentent un mode de vie commun à de nombreuses bactéries et se forment en passant par étapes de cellules flottantes (planctoniques) à des communautés multi-espèces complexes. La résistance inhérente des biofilms aux agents antimicrobiens est à l’origine de nombreuses infections bactériennes persistantes et chroniques^1,2, comme le démontrent les biofilms buccaux (plaque dentaire). Les micro-organismes cariogènes tels que les mutans, les streptocoques, traitent le saccharose et d’autres glucides pour produire une matrice extracellulaire et générer des acides qui peuvent déminéraliser la structure des dents et provoquer des caries dentaires. La plupart des matrices de biofilm sont des biopolymères constitués de composants cellulaires et extracellulaires tels que des exopolysaccharides (EPS), des protéines et des acides nucléiques^3,4.

La microscopie confocale à balayage laser (CLSM), la technique la plus largement utilisée pour l’imagerie de fluorescence, a radicalement transformé l’imagerie optique en biologie car elle a la capacité de collecter des images 3D de structures biologiques hydratées sans fixation^5,6,7. Cette technique non destructive consiste à collecter des images de lames minces dans une région d’intérêt sur l’échantillon de manière à ce que la contribution de la lumière floue soit supprimée. La qualité et la résolution des images capturées par CLSM sont au-delà de ce qui est réalisable avec la microscopie à fluorescence à grand champ. L’un des principaux inconvénients de la CLSM est que le balayage des images se produit à un rythme plus lent qu’avec les techniques de microscopie à grand champ, dans lesquelles des images entières sont collectées simultanément⁵. Cependant, avec une sélection croissante de fluorochromes, de lasers et de filtres, la CLSM est devenue l’une des techniques dominantes pour l’imagerie multispectrale^5,7.

Des études antérieures ont montré que la CLSM est un outil utile pour examiner la structure ou l’architecture des biofilms en utilisant une ou deux étiquettes fluorescentes ou des colorants pour mieux comprendre la distribution de l’EPS et des cellules dans les biofilms, et en particulier dans la matrice extracellulaire^7,8. En théorie, la coloration fluorescente / le marquage de plusieurs composants est souhaitable pour explorer la structure détaillée et la colocalisation des composants cellulaires et extracellulaires dans les biofilms. Cependant, l’analyse simultanée de divers composants dans les biofilms peut s’avérer difficile pour les raisons suivantes : 1) la sélection de colorants fluorescents ayant un chevauchement spectral minimal est compliquée, et 2) la quantification de plusieurs fluorochromes pose un problème multifactoriel. La colocalisation à l’aide de plusieurs fluorochromes nécessite l’utilisation de colorants très spécifiques avec une interférence spectrale minimale pour éviter tout effet de fuite, ce qui se produit lorsque deux fluorochromes ont un chevauchement significatif dans leur pic spectral, ce qui fait que l’un est plus fortement excité que l’autre⁹. Idéalement, les fluorochromes ayant des spectres d’excitation qui ne se chevauchent pas donneraient les meilleurs résultats, mais il est très difficile de trouver des colorants qui répondent à ce critère. Au lieu de cela, la sélection des colorants est optimisée en choisissant des fluorochromes dont les spectres d’émission se chevauchent minimalement, ce qui permet de visualiser les colorants un par un dans une bande d’onde d’observation limitée⁹.

La superposition d’images de fluorescence est probablement la méthode la plus largement utilisée pour évaluer la distribution simultanée des fluorochromes. La colocalisation des différents composants se manifeste par un chevauchement de différentes couleurs à travers de multiples canaux créés par les fluorochromes examinés¹⁰. Les outils permettant d’afficher des images de fluorescence multicanaux sous forme d’images couleur fusionnées sont disponibles dans la plupart des logiciels CLSM et des logiciels d’analyse d’images biologiques. Bien que la superposition d’images soit utile pour l’évaluation spatiale de la colocalisation, les images ne peuvent être examinées qualitativement que par une analyse visuelle. Cela fournit une quantité limitée d’informations, car ces représentations ne sont généralement pas utiles pour quantifier la colocalisation dans différentes conditions expérimentales et ne déterminent pas non plus si la colocalisation dépasse la coïncidence^{aléatoire 11}. Jusqu’à présent, très peu d’études ont utilisé des méthodes quantitatives pour analyser la structure tridimensionnelle des biofilms et des composants de biofilms, et encore moins ont quantifié l’effet des traitements antibactériens ou des mesures antisalissure sur les composants du biofilm.

L’objectif de cette étude était de présenter une méthodologie de quantification et de comparaison des distributions tridimensionnelles concurrentes de trois composants cellulaires et extracellulaires de biofilms. La méthode comprend des étapes distinctes mais interconnectées impliquant la croissance du biofilm, la coloration, l’imagerie CLSM des biofilms, l’analyse structurelle et la visualisation du biofilm, et l’analyse statistique des paramètres structurels. Le test de croissance du biofilm permet la croissance du biofilm sur des substrats pertinents et produit des structures de biofilm reproductibles. La combinaison d’une nouvelle coloration simultanée de l’EPS, des protéines et des composants d’acides nucléiques avec la mesure des paramètres structurels des biofilms 3D permet d’obtenir des distributions quantifiables des composants dans les biofilms. L’analyse statistique des paramètres structurels du biofilm facilite l’évaluation des biofilms dans des conditions expérimentales spécifiques (par exemple après un traitement avec des bains de bouche), comme nous le verrons dans la section suivante.

1. Préparation des milieux et des réactifs

1. Préparez 300 ml de milieu de culture de nuit (THY ; bouillon Todd Hewitt à 3 % préparé selon les instructions du fabricant complété par 0,3 % d'extrait de levure dans de l'eau ultrapure) et autoclave. Conserver à température ambiante jusqu’à 2 mois.
2. Préparez 1 L d’agar THY (3 % de bouillon Todd Hewitt, 0,3 % d’extrait de levure et 1,5 % d’agar dans de l’eau ultrapure), autoclave, et laissez refroidir à 60 °C avant de verser dans des boîtes de Pétri. Conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois.
3. Préparez 150 ml de milieu de croissance de biofilm (0,5X TY complété par 10 mM de saccharose, 1,5 % de tryptone, 0,5 % d’extrait de levure et 10 mM de saccharose dans de l’eau ultrapure) et filtrez la stérilisation. Conserver à température ambiante jusqu’à 1 mois.
4. Préparez 1 L de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ et 0,24 g de KH₂PO₄ dans de l’eau ultrapure) et d’autoclave. Conserver à température ambiante pendant plusieurs mois.
5. Préparez 600 ml de tampon Tris HCl de 10 mM complété par 10 mM de CaCl₂ dans de l’eau ultrapure (tampon TC ; pH 7,2) et en autoclave. Conserver à température ambiante pendant plusieurs mois.
6. Autoclave 1 L d’eau ultra-pure. Conserver à température ambiante pendant plusieurs mois.

2. Fabrication de l’échantillon

1. Fabriquez des échantillons en forme de disque de composites de résine dentaire Point 4 (PF) et TPH³ (TP) dans un moule en acier inoxydable sur mesure en deux incréments. Chaque incrément est photopolymérisé pendant 40 secondes à l’aide d’une unité de photopolymérisation LED. Les deux produits ont des compositions et des niveaux de charge légèrement différents, ce qui produit des topographies de surface différentes sur lesquelles les biofilms seront cultivés.
   1. Des échantillons de substrats pertinents ont pu être fabriqués à l’aide de protocoles établis dans d’autres disciplines au lieu de l’étape 2.1.
2. Finissez et polissez les éprouvettes jusqu’à ce qu’ils atteignent une finition de surface finale acceptable, par exemple à l’aide d’une meuleuse-polisseuse semi-automatisée. Rincer les échantillons polis à l’eau ultra-pure et les sécher à l’air comprimé.
3. Stérilisez les échantillons à l’aide d’oxyde d’éthylène gazeux ou d’une autre méthode de stérilisation.

3. Croissance du biofilm

1. Inoculer une seule colonie de S. mutans dans 4 ml de milieu de culture pendant la nuit (étape 1.1). Incuber toute la nuit à 37 °C pendant 16-18 heures. La densité optique (OD₆₀₀) de la culture doit être de ≥0,9.
   1. Il est préférable d’utiliser une colonie à partir de cultures sur plaques qui ont été passées 2x à partir d’un stock d’origine, car cela entraîne une croissance plus cohérente du biofilm.
2. Créer une dilution de 1:100 à l’aide de la culture de nuit (étape 1.1) dans 10 ml de milieu de croissance de biofilm (étape 1.3).
3. Transférez des échantillons composites de résine stérile (par exemple PF, TP) sur des plaques stériles à 12 puits.
4. Ajouter 2,5 ml de milieu de culture dilué (étape 3.2) dans les puits de traitement (bain de bouche) et les groupes témoins. Ajouter 2,5 ml de milieu de croissance de biofilm stérile non inoculé dans les puits de contrôle de la stérilité.
5. Cultivez les biofilms dans des conditions microaérophiles. Placez les assiettes sur un agitateur à 100 tr/min à l’intérieur d’un incubateur à 37 °C pendant 24 heures.
6. Après 24 heures, aspirer aseptiquement le milieu de tous les puits et laver deux fois avec du PBS stérile (étape 1.4 ; 2,5 ml/puits), en aspirant le PBS après chaque lavage. Réapprovisionnez 2,5 ml de milieu de croissance de biofilm frais dans chaque puits et incubez pendant 24 heures supplémentaires dans des conditions identiques à celles de l’étape précédente, pour un temps de croissance total du biofilm de 48 heures.
7. Au lieu des étapes ci-dessus, des biofilms d’autres espèces pourraient être cultivés sur des substrats en utilisant des protocoles établis.

4. Traitements antibactériens/bains de bouche

1. Milieu d’aspiration une fois la croissance du biofilm terminée.
2. Ajoutez 2,5 ml de rince-bouche Biotène PBF (BIO) ou Listerine Total Care (LTO), ou une autre modalité de traitement, dans les puits pour les groupes de traitement, et ajoutez 2,5 ml d’eau stérile ultrapure dans le puits du groupe témoin. Immerger les échantillons pendant 60 secondes, selon les instructions du fabricant, tout en agitant les plaques sur un agitateur orbital à 150 tr/min. Aspirez immédiatement le bain de bouche et l’eau ultrapure des puits.
3. Lavez les échantillons 5 fois pendant 15 secondes par lavage avec de l’eau ultrapure stérile sur l’agitateur orbital à 150 tr/min, en aspirant de l’eau après chaque étape de lavage.
4. Au lieu des étapes ci-dessus, d’autres agents antibactériens pourraient être testés à l’aide de protocoles établis.

5. Coloration

1. Préparez les dilutions de coloration pour l’analyse du biofilm.
   1. Préparez une solution mère à 5 mg/ml de conjugué Concanavalin A, Alexa Fluor 647 (AF) dans du bicarbonate de sodium 0,1 M pH 8,3. Conserver à -20 °C dans des aliquotes à usage unique pendant plusieurs mois car la congélation et la décongélation sont déconseillées. À l’aide de cette solution mère d’AF, préparer une dilution de 250 μg/ml dans un tampon TC.
   2. Préparer une dilution de 10 μM à l’aide de la solution mère de Syto 9 (SY) de 5 mM, fournie par le fabricant, dans un tampon TC. Conservez le reste de la solution mère SY à -20 °C pendant plusieurs mois.
   3. Préparez une dilution 10x en utilisant la solution mère (SR) Sypro Red 5 000x, telle que fournie par le fabricant, dans de l’eau ultrapure stérile. Conservez le reste de la solution mère SR à -20 °C pendant plusieurs mois.
2. Lavez tous les biofilms 2 fois avec un tampon TC (2,5 ml/puits) en utilisant un mouvement de rotation de la main, en laissant le deuxième lavage dans la plaque pendant 30 minutes à température ambiante. Aspirer.
3. Placez une goutte de 50 μl de colorant AF sur chaque échantillon de biofilm. Colorer 30 min à température ambiante, à l’abri de la lumière. Laver 2 fois avec un tampon TC (2,5 ml/puits), en aspirant après chaque lavage.
4. Appliquez ensuite une goutte de 50 μl de colorant SY sur chaque échantillon de biofilm. Colorer 30 min à température ambiante, à l’abri de la lumière. Laver 2 fois avec de l’eau stérile ultrapure (2,5 ml/puits), en aspirant après chaque lavage
5. Enfin, placez une goutte de 50 μl de colorant SR sur chaque échantillon de biofilm. Colorer 30 min à température ambiante, à l’abri de la lumière. Laver 3 fois avec de l’eau stérile ultra-pure (2,5 ml/puits), en aspirant après chaque lavage.
6. Transférez les échantillons dans une plaque à 6 puits, en plaçant un échantillon par puits dans 6 ml d’eau ultrapure stérile pour faciliter la microscopie confocale.

6. Imagerie par microscopie confocale à balayage laser

1. Acquérir des images de chaque composant (colorant) dans les biofilms des groupes de traitement et de contrôle à l’aide des paramètres du microscope confocal à balayage laser indiqués au tableau 1. Un objectif plongeant 63X avec une ouverture numérique de 0,9 et une distance de travail de 2,2 mm a été utilisé dans cette étude.
   
2. Réglez la taille de balayage sur 250 μm x 250 μm et une résolution minimale de pixels de 512 x 512 pour acquérir des images CLSM à une résolution adéquate pour l’analyse quantitative.
3. Utilisez la coloration SY pour définir les points supérieur et inférieur de la pile d’images du biofilm, puis réglez le pas z pour qu’il soit adéquat pour l’analyse quantitative (0,6 μm pour cette étude). Avant de collecter un scan, optimisez les paramètres de l’image et de la coloration (c’est-à-dire la tension et le décalage PMT) à l’aide de l’option QLUT. Une table de recherche des couleurs a été utilisée pour attribuer des pseudo-couleurs à chaque coloration (vert pour SY, rouge pour SR et bleu pour AF) afin de rendre chaque composant du biofilm plus distinct dans la reconstruction 3D.
4. Collectez des images CLSM à 400 Hz à l’aide d’un balayage séquentiel en mode « entre les piles » pour optimiser la capture d’images de plusieurs colorants au sein d’un même biofilm.

7. Analyse structurale du biofilm

1. Analyser les images CLSM collectées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images pour les biofilms. Les étapes suivantes décrivent l’utilisation du logiciel ISA3D¹² pour calculer les paramètres structurels des images de biofilm collectées.
   1. Copiez les fichiers d'image CLSM de chaque biofilm dans le dossier Images, comme spécifié dans le manuel du logiciel. Assurez-vous que la convention de nommage des fichiers CLSM requise par le logiciel est respectée. Le logiciel permet d’analyser les fichiers dans les sous-dossiers en mode batch, facilitant ainsi l’analyse des biofilms de traitement et de groupe témoin dans le même cycle.
   2. Entrez les dimensions des axes x, y et z des images CLSM dans les champs dxy et dz de la boîte de dialogue principale. Sélectionnez les paramètres de cartographie de seuil et de distance, comme décrit dans le manuel du logiciel (Otsu et Quasi-Euclidien ont été utilisés pour cette étude, respectivement). Entrez un nom approprié pour le fichier de résultats, puis exécutez le programme. Un fichier de résultats sera généré dans le dossier ISA.
   3. Consultez le fichier de résultats pour obtenir des valeurs pour vingt paramètres structurels 3D¹² tels que le biovolume et l’épaisseur moyenne du biofilm (mesurée dans cette étude) qui quantifient la distribution 3D de chaque composant (colorant) au sein du biofilm.

8. Visualisation de la structure du biofilm

1. Créez une reconstruction des composants superposés (colorants) dans chaque biofilm à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Les étapes suivantes décrivent l’utilisation du logiciel Volocity pour créer des reconstructions 3D.
   1. Créez une bibliothèque pour chaque biofilm en copiant les fichiers d’image CLSM dans le logiciel, comme décrit dans le manuel.
   2. Utilisez l’option de menu Rendu 3D pour produire une image 3D reconstruite à partir des images CLSM de chaque biofilm (le format d’opacité HR a été utilisé pour cette étude).
   3. Faites pivoter l’image 3D pour orienter tous les biofilms de la même manière par rapport aux axes des coordonnées x, y et z. Capturez un instantané de la reconstruction du biofilm correctement orientée, puis exportez-le au format TIFF, JPEG ou dans un autre format approprié.
2. Effectuer une analyse visuelle de la distribution simultanée de l’EPS, des protéines et des composants d’acides nucléiques dans les biofilms sur les images reconstruites.
3. Utilisez le coefficient de corrélation de Pearson et le coefficient de chevauchement de Manders pour effectuer une analyse de colocalisation de plusieurs composants du biofilm (la colocalisation n'a pas été mesurée dans cette étude).

9. Analyse statistique

1. Utiliser des analyses statistiques de modèles mixtes distincts pour comparer les valeurs moyennes des paramètres structurels entre les groupes de rince-bouche et de contrôle (α=0,05). Pour cette étude, le logiciel SAS a été utilisé pour effectuer l’analyse statistique.

Des résultats représentatifs pour les traitements (bains de bouche) et le groupe témoin non traité sont présentés dans le tableau 2 et les figures 1 et 2. Le tableau 2 présente les valeurs moyennes et d’écart-type des paramètres structurels du biofilm, le biovolume (μm3) et l’épaisseur moyenne du biofilm (μm) qui ont été calculés à l’aide du logiciel ISA3D. Les paramètres structurels des biofilms traités avec un rince-bouche qui différaient significativement de ceux des biofilms du groupe témoin (p<0,05) ont des valeurs moyennes et d’écart-type surlignées en rouge. Les résultats des analyses statistiques des modèles mixtes ont démontré que le rince-bouche BIO produisait des structures de biofilm qui différaient significativement du témoin (p<0,05) sur les deux composites de résine, tandis que le rince-bouche LTO ne produisait pas de différences significatives (p>0,05) sur l’un ou l’autre des composites de résine. Les résultats montrent clairement que les composants du biofilm cellulaire et extracellulaire restant après les deux traitements de rince-bouche différaient. Il convient également de noter que les biofilms de S. mutans cultivés sur les deux substrats (PF et TP) différaient par leur structure 3D, même s’ils ont été cultivés dans des conditions similaires et que les deux substrats ont été polis avec des abrasifs similaires.

La distribution simultanée de l’EPS, des protéines et des acides nucléiques dans les biofilms peut être visualisée via les reconstructions 3D générées à l’aide du logiciel Volocity. Les figures 1 et 2 montrent des reconstructions représentatives de biofilms du groupe témoin cultivés sur des composites de résine PF et TP, respectivement. La coloration bleue représente l’EPS dans les biofilms de S. mutans, la coloration verte montre les acides nucléiques et la coloration rouge montre les protéines. L’espace intermédiaire peut être occupé par de l’eau ou d’autres composants de biofilms non marqués par fluorescence.

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Tableau 2. Valeurs moyennes et d’écart-type du biovolume (BV) et épaisseur moyenne du biofilm (MT) des biofilms traités avec BIO ou LTO, ou laissés non traités (groupe témoin). Les paramètres structurels des biofilms traités avec des bains de bouche qui différaient significativement de ceux des biofilms du groupe témoin (p<0,05) ont des valeurs moyennes et d’écart-type surlignées en rouge.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents. La production et l’accès gratuit à cet article sont sponsorisés par Leica Microsystems.