Le poisson zèbre, un petit poisson tropical, est devenu un modèle populaire pour étudier la fonction des gènes au cours du développement des vertébrés et de la maladie. L'expression spatiale et temporelle des gènes cibles peut être déterminée par In situ Hybridation. Notre protocole amélioré permet la détection de faibles relevés de notes abondantes avec signal de fond non spécifique faible.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Cet article se concentre sur l'ensemble du montage hybridation in situ (WISH) des embryons de poisson zèbre. La technologie WISH facilite l'évaluation d'expression de gènes à la fois en termes de distribution des tissus et le stade de développement. Les protocoles sont décrits pour l'utilisation des embryons de poisson zèbre WISH de l'aide d'ARN antisens sondes marquées à la digoxigénine. Les sondes sont générés par l'incorporation des nucléotides digoxigénine liés par transcription in vitro des modèles de gènes qui ont été clonés et linéarisé. Les chorions d'embryons récoltés à des stades de développement définis sont retirés avant l'incubation avec des sondes spécifiques. Selon un procédé de lavage pour éliminer la sonde en excès, les embryons sont mis à incuber avec un anticorps anti-digoxigénine conjugué à la phosphatase alcaline. En utilisant un substrat chromogène de la phosphatase alcaline, l'expression du gène spécifique peut être évaluée. En fonction du niveau de l'expression génique de toute la procédure peut être complété dans les 2-3 jours.
Introduction
Le poisson-zèbre (Danio rerio) a émergé comme un modèle animal puissant pour l'étude du développement des vertébrés, la maladie, le comportement et le dépistage dans la drogue 1-3. Embryons de poissons zèbres peuvent être obtenues dans un grand nombre d'un seul passage. Fertilisation et le développement survient ex utero et les embryons optiquement transparents se développent rapidement. Événements critiques du développement se produisent pendant les 48 premières heures après la fécondation (HPF). Cela comprend l'apparition de l'organe ébauches et l'ouverture d'cytodifférenciation. Démontables ou la sur-expression ....
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Protocole
1. Whole-mount hybridation in situ des embryons de poisson zèbre
1.1 Préparation des embryons
- Recueillir des embryons à des stades de développement requis. S'il vous plaît voir Kimmel et al. 5 pour la description du stade embryonnaire.
- Retirer chorions manuellement à l'aide des pinces (Dumont horlogers pince pas. 5).
- Fixer embryons dans une solution à 4% de paraformaldéhyde (PFA) composé dans du PBS (tampon phosphate salin) pendant une nuit à 4 ° C.
- Lavez embryons avec PBS au moins 3x pendant 5 minutes chacun à la température ambiante.
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Résultats
En utilisant le protocole avec 50 embryons par panier (par gène / par condition expérimentale) le profil d'expression de ce gène peut être obtenue dans une expérience. Presque tous les embryons présentent des profils d'expression similaires pour un gène particulier. Des exemples représentatifs de la coloration dans d'hybridation in situ sont présentés aux figures 3-6.
Tant le sens et anti-sens ribosondes ont été synthétisés à partir des ADNc cor.......
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Discussion
Nous avons mis au point des méthodes améliorées pour visualiser l'ARN avec une haute résolution. Le dans les procédures d'hybridation in situ sont réalisées en utilisant des paniers sur mesure simples à fond poreux (figure 1). Les embryons sont traités à l'aide des solutions sans RNase dans des plaques 6 puits à température ambiante dans des conditions stériles.
De séparer les embryons paniers sont fabriqués à partir de différents tubes Eppendor.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 et HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Tampon Phénol saturé | Invitrogen | 15513039 | Conserver à 4 °C. Irritant et cancérogène suspecté pour les yeux, la peau et les voies respiratoires. Des précautions doivent être prises lors de la manipulation. |
| Chloroforme | Fisher | C607-1 | Toxique et cancérogène présumé. Travailler sous hotte. |
| DNAse sans RNase I | Roche | 4716728001 | Préparez de petites aliquotes et stockez-les à -20°C. |
| Mélange de marquage DIG-RNA avec ARN polymérase Sp6, T7 et T3 | Roche | 11277073910 | |
| inhibiteur de RNase | Roche | 10777-019 | |
| 3,0 M Acétate de sodium (pH 5,5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100 % éthanol | Alcools | ||
| Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | Le DEPC est un irritant pour les yeux, la peau et les voies respiratoires. Évitez tout contact avec la peau et les yeux. Utilisez des lunettes de sécurité, des gants et un masque. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0,5 m (pH 8,0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Systèmes d’aquarium | instantanés au sel de mer | N/A | |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldéhyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Préparer et conserver à -20° ; C sous forme d’aliquotes de 40 ml pour une utilisation ultérieure. Le PFA est toxique. Utilisez des lunettes de sécurité, des gants et un masque anti-poussière. |
| Phénylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC est très toxique. Utilisez des lunettes de sécurité, des gants et un masque anti-poussière. |
| Méthanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (horloger' s) Pince modèle n° 5 | de sciences fines | ||
| Grappe de culture cellulaire à six puits | Sarstedt | 83.1839 | |
| Les paniers sont faits de maille de nylon et de tubes Eppendorf | Préparation | Pour fabriquer les paniers, coupez des tubes Eppendorf (1,5 ml) avec ou sans rebords pour retirer l’extrémité conique. Coupez la maille de nylon en petits morceaux correspondant à la taille de ; les extrémités coupées des tubes d’Eppendorf. Placez les tubes avec la maille en nylon recouvrant l’extrémité coupée sur un Chauffer la plaque jusqu’à ce que le tube et le maillage en nylon collent ensemble (effectuer dans la hotte). Coupez l’excédent de maille des paniers et stockez-les dans du méthanol à 100 % jusqu’à ce qu’ils soient utilisés. | |
| Polyoxyéthylènesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Anhydride acétique | Sigma | 242845 | |
| Triéthanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, grade de haute pureté | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Résine | Bio Rad | 142-6424 | |
| Acide citrique monohydraté | Sigma | C0706-500G | |
| Héparine Sel sodique | Sigma | H3393-25KU | |
| Tampon de citrate salin-sodique (SSC) | Sigma | S6639 | |
| ARNt de levure de boulanger type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Chlorhydrate de lévamisole | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydre (DMF) | Sigma | 227056 | Irritant, toxique, combustible et tératogène suspecté. Manipulez avec un vêtement de sécurité approprié, y compris des gants et des lunettes de protection. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protégez cette solution de la lumière. |
| Nitroblue tétrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protégez cette solution de la lumière. |
| Albumine de sérum bovin, fraction V purifiée (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Mouton Anti-digoxigénine-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycérol | Sigma | G5516-500ML | |
| Plaques de culture cellulaire à 96 puits | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1 :GFP)ml2/Tg(hb9 :GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1 :GFP)ml2 | |
| Systèmes d’aquarium | Instant Ocean | N/A |
Références
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
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Réimpressions et autorisations
