Un procédé de culture embryonnaire C. elegans Cellules

Summary

Nous décrivons ici un protocole révisé pour la culture à grande échelle de l'embryon C. elegans cellules. Embryonnaire C. elegans cellules cultivées in vitro à l'aide de cette méthode, semblent différencier récapituler et l'expression de gènes d'une manière spécifique de la cellule. Les techniques qui nécessitent un accès direct à des cellules ou à l'isolement de types de cellules spécifiques à partir d'autres tissus peuvent être appliquées sur C. elegans cellules cultivées.

Abstract

C. elegans est un puissant système de modèle, dans lequel des techniques génétiques et moléculaires sont facilement applicables. Jusqu'à récemment, cependant, les techniques qui nécessitent un accès direct à des cellules et l'isolement de types cellulaires spécifiques, ne pouvaient pas être appliquées dans C. elegans. Cette limitation est due au fait que les tissus sont confinés à l'intérieur d'une cuticule sous pression qui n'est pas facilement digéré par traitement avec des enzymes et / ou des détergents. Basé sur les premiers travaux de pionnier par Laird Bloom, Christensen et ses collègues ¹ développé une méthode robuste pour la culture de C. elegans cellules embryonnaires à grande échelle. Les oeufs sont isolés des adultes gravides par traitement avec l'eau de Javel / NaOH et ensuite traitées avec chitinase pour enlever les coquilles. Les cellules embryonnaires sont alors dissociées par pipetage manuel et étalées sur substrat de verre recouvert dans les médias de sérum enrichi. Dans les 24 heures de cellules d'isolement commencer à se différencier en changeant la morphologie et en exprimant Marke spécifique de cellulers. C. elegans cellules cultivées en utilisant cette méthode survivre jusqu'à deux semaines in vitro et ont été utilisés pour électrophysiologique, immunochimique, et l'imagerie des analyses aussi bien qu'ils ont été triés et utilisés pour microarray profilage.

Introduction

Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme modèle puissant pour l'étude des bases moléculaires de la fonction cellulaire, la différenciation et le comportement. Alors que son génome, les voies métaboliques et biosynthétiques sont similaires chez les vertébrés », sa traçabilité génétique et moléculaire sont beaucoup plus ^2. Parmi ses avantages sont sa taille et simple anatomie, son cycle de vie rapide (3 jours à 25 ° C), durée de vie courte (2 semaines) et un grand nombre de descendants (> 200). En raison de sa nature hermaphrodite et cycle de vie court, les manipulations génétiques et moléculaires sont simples dans C. elegans,

Protocol

Les astérisques (*) indiquent des étapes nouvelles ou modifiées par rapport à Christensen et al. ^Une

Une. Matériel d'installation

1. Le mode opératoire de culture cellulaire nécessite de grandes quantités d'oeufs isolés des adultes gravides. Cultivez C. elegans sur 8P plaques de gélose ensemencée avec NA22 (disponible sur le C. elegans Consortium génétique - CGC) des bactéries à isoler de grandes quantités d'œufs. Dans ces plaques la quantité de peptone utilisée est 8 fois le montant qui est normalement utilisé pour les plaques NGM. La concentration de peptone supérieur soutient la....

Results

C. elegans cellules cultivées se différencient et cellules expriment des marqueurs spécifiques

Christensen et ses collègues à l'aide de la coloration au bleu trypan démontré que> 99% des embryonnaire C. elegans cellules survivent à la procédure d'isolement. Au jour 9 et 22 après l'étalement, 85% et 65%, respectivement, sont encore vivantes ^1. Isolé embryonnaire C. cellules elegans doivent adhérer à un substrat afin de différencier. Les cellules .......

Discussion

C. elegans est un organisme modèle puissant pour déchiffrer les voies génétiques impliqués dans le développement, le comportement et le vieillissement. Sa commodité provient principalement de la facilité avec laquelle il peut être manipulé génétiquement et de son cycle de vie court. Malgré sa commodité, C. elegans a ses limites. C. cellules elegans sont minuscules et confinée à l'intérieur d'une cuticule sous pression qui limite l'application des procédés qui nécessitent u.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RÉACTIFS
Bacto Peptone	VWR International Inc.	90000-382
Difco Agar Granulated	VWR International Inc.	90000-784
Bacto Tryptone	VWR International Inc.	90000-284
Extrait de levure Bacto	VWR International Inc.	90000-724
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)	Invitrogen	liquide 11415-064
Sérum fœtal bovin	Invitrogen	16140-063
Pénicilline-streptomycine	Sigma	P4333-100ML
Chitinase de Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
NA22 Escherichia coli	Caenorhabditis Centre
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
Sucrose	Sigma	57903-1KG
D-(+)Glucose	Sigma	67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin– ; thylether), N,N,N',N'- acide tétraacide (EGTA)	Sigma	E0396-25G
Hepes	Sigma	H3375-500G
Cholestérol
NaCl	Sigma	57653-1KG
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl2	Sigma	C1016-500G
MgCl2	Sigma	M8266-100G
MgSO4	Sigma	M2643-500 g
K2HPO4	Sigma	P2222-500G
KH2PO4	Sigma	P9791-500G
NaOH	Sigma	S8045-500G
KOH	Sigma	P1767-500G
Éthanol
Autoclavé distillé H2O
Eau de Javel
EQUIPMENT
101-1000 &mu ; l Pointes de pipette graduées bleues	USA Scentific	1111-2821
Pipette stérilisée de 10 ml emballée individuellement	USA Scentific	1071-0810
Volume variable ergonomique (100-1000 &mu ; l) Pipette avec éjecteur de pointe	VWR International Inc.	89079-974
Aide à pipette portable, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfert Pipette en plastique stérile	VWR International Inc.	14670-114
Tube conique 15 ml	USA Scentific	1475-1611
Tube conique 50 ml	USA Scentific	1500-1811
Aiguilles stériles de calibre 18	Becton, Dickinson and Co.
Seringues stériles de 10 ml	Becton, Dickinson and Co.
Filtres à seringue en plastique Corning 0,20 &mu ; Filtre	Corning	431224
Acrodic 25 mm avec 5 & m versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
Boîte de Pétri 60x15 mm Stérile	VWR International Inc.	82050-548
Boîte de Pétri 100x15 mm Stérile	VWR International Inc.	82050-912
Lamelles en verre de 12 mm de diamètre VWR	International Inc.	48300-560
Plaques de culture cellulaire transparentes 24 puits à fond plat avec couvercle	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifugeuse 5702	Eppendorf	022629883
capot
avec objectif
			humidifié à l’air ambiant