Une méthodologie décellularisation pour la production d'un naturel acellulaire intestinale Matrice

Résumé

L'article décrit une méthode pour la production d'une matrice acellulaire à partir d'intestin de rat. La dérivation des échafaudages intestinale est important pour de futures applications en génie tissulaire, biologie des cellules souches et le dépistage des drogues.

Résumé

L'ingénierie tissulaire réussie implique la combinaison d'échafaudages avec des cellules appropriées in vitro ou in vivo. Les échafaudages peuvent être synthétiques, d'origine naturelle ou provenant de tissus / organes. Ces derniers sont obtenus en utilisant une technique appelée décellularisation. Decellularization peut impliquer une combinaison de méthodes enzymatiques physiques, chimiques, et. Le but de cette technique est d'enlever toutes les traces cellulaires tout en conservant l'architecture micro-macro et du tissu d'origine.

L'ingénierie tissulaire intestinale a jusqu'à présent utilisé des échafaudages relativement simples qui ne reproduisent pas l'architecture complexe de l'organe d'origine. L'objectif de cet article est de décrire une technique de decellularization efficace pour intestin grêle de rat. L'isolement de l'intestin grêle, de manière à assurer le maintien d'une liaison vasculaire est décrit. La combinaison de solutions chimiques et enzymatiques pour éliminer les cellules whilst la préservation de l'axe des villosités-crypt dans l'aspect luminal de l'échafaudage est également fixée. Enfin, l'évaluation des échafaudages produits pour les caractéristiques appropriées est discutée.

Introduction

L'ingénierie tissulaire (TE) fournit une alternative thérapeutique à la greffe d'organes, en contournant les problèmes d'immunosuppression et la pénurie d'organes. TE a récemment eu des applications réussies dans la clinique, avec le remplacement d'organes comme la vessie ^{1, 2} urètre et de la trachée, à la fois chez les adultes et les enfants de ^{5 3,4.}

Construction d'un organe de l'ingénierie tissulaire implique la combinaison d'un échafaudage avec les cellules appropriées. Un échafaudage peut être préparé en utilisant d'origine naturelle (par exemple, le collagène) et (par exemple l'acide poly-L-glycolique; PLGA) de synthèse des matériaux, ou être obtenue par la décellularisation d'organes et de tissus natifs. Les échafaudages qui ont été utilisés jusqu'à présent pour intestinal TE ont principalement été soit décellularisé (petite sous-muqueuse intestinale) ou synthétiques (poly-L-acide glycolique et de l'acide poly-lactique) ^13.6. Ces biomatériaux sont très simples à la fois macro-et micro-architecture, quipeut ne pas être idéal si l'intestin de l'ingénierie tissulaire doit être traduit cliniquement. Un biomatériau optimale pour l'intestin doit avoir un arbre vasculaire innée qui peut être relié à l'approvisionnement en sang de l'hôte, une paroi tubulaire à plusieurs niveaux avec des propriétés différentes pour tenir compte des couches de la paroi intestinale et un axe de villosités-crypt sur la face luminale à l'aide de repopulation par des cellules souches épithéliales.

Decellularization est une nouvelle méthodologie qui produit des échafaudages en éliminant les cellules des organes entiers, tout en conservant leur architecture d'origine ^14. Ceci est préférable pour des échafaudages déjà existant, car ils ne se répliquent pas seulement la structure de l'organe, mais contiennent également des signaux chimiques incorporés à l'intérieur de la matrice extracellulaire (ECM) que l'aide de la prolifération cellulaire et la différenciation. En 2008, une trachée cadavérique a été décellularisée ^14, ensemencée avec les propres cellules du patient, et transplanté à remplacer les bronche gauche chez un jeune homme ^{3. Depuis lors, un certain nombre de groupes ont rapporté la production d'échafaudages décellularisées pour le coeur 15, 16,17 foie, du poumon et de 18 à 20 dans les petites et les gros animaux.}

Nous avons également adapté la même méthodologie pour produire un petit échafaudage décellularisée intestinale ^21. L'objectif de la méthode décrite ici est de produire des matrices intestinaux décellularisées qui maintiennent les caractéristiques macroscopiques du tissu d'origine tels que l'approvisionnement en sang, ainsi que l'architecture microscopique de l'axe des villosités-crypt dans la lumière intestinale. Nous croyons que cette méthode pourrait finalement être adoptée pour d'autres organes pour améliorer l'efficacité de decellularization.

Protocole

Une. Isolement de Rat Intestin

1. Préparer une solution à 1 L d'une solution saline tamponnée au phosphate (Sigma, Royaume-Uni) avec 1% d'antibiotique / antimycotique (Sigma, Royaume-Uni) (PBS / AA). Monter la pompe péristaltique (Masterflex L / S vitesse variable) avec deux tubes. Run 70% d'éthanol (EtOH) à travers les tubes de la pompe péristaltique pendant 15 min à vitesse maximale, suivie par du PBS / AA pendant 15 autres minutes.
2. Euthanasier adultes Sprague-Dawley rats pesant environ 250-350 g par inhalation de CO ₂ et la dislocation cervicale conformément aux directives locales d'animaux et homologations (au Royaume-Uni, les lignes directrices du Home Office en vertu de la loi de 1986 animaux (Scientific Procedures)).
3. Autoclave les instruments chirurgicaux avant utilisation. Vaporisez et essuyez l'abdomen de l'animal en utilisant EtOH à 70%.
4. Effectuer une incision laparotomie Xifo-pubienne sur l'abdomen pour assurer un champ opératoire clair.
5. Éviscérer l'intestin grêle sur le côté droit de l'animal sur une serviette en papier pulvérisé avec EtOH à 70%. Take soins de façon continue à mouiller l'intestin avec du PBS / AA de manière à éviter la déshydratation du tissu et la dénaturation de la matrice extracellulaire (ECM).
6. Localiser l'artère mésentérique supérieure (AMS) provenant d'un angle de 90 ° par rapport à l'aorte vers l'intestin. Utiliser une canule G 27 pour entrer dans le SMA à partir de l'aorte et rapidement retirer l'aiguille pour éviter de déchirer la paroi de la cuve. Avancer le tube en plastique de la canule dans la SMA et fixer à l'aide de sutures Vicryl (5/0).
7. Confirmez canule par injection de 1 ml de PBS / AA. Utiliser des ciseaux à ressort pour inciser la aorte proximale et distale par rapport à la SMA de manière à libérer la canule.
8. Pour éviter les fuites de matières fécales en disséquant le gros intestin, de placer une (Silk 5/0) suture noeud sur l'extrémité proximale de la jonction iléo-caecale et une à l'extrémité distale du côlon sigmoïde. Ensuite, couper l'iléon terminal et du côlon entre les deux noeuds et enlever le gros intestin.
9. Couper l'intestin à la jéjuno-duodénal jonction unee libérer l'intestin de toutes les connexions du tissu conjonctif qu'elle pourrait avoir avec l'abdomen.
10. Transfert de l'intestin grêle dans une boîte de Pétri avec du PBS / AA. Cathétériser la partie proximale de l'intestin avec une pipette Pasteur en plastique (LSL laboratoire Consommables) et le fixer en place avec des sutures. Couper la pipette afin qu'il s'adapte le Luer-Lok d'une seringue de 60 ml (BD Plastipak). Rincer la lumière intestinale 2x avec 60 ml de PBS / AA pour éliminer les matières fécales et les débris.

2. Decellularization Méthodologie

1. Connectez la canule vasculaire à un robinet à trois voies. Cela facilitera la manipulation, minimiser la tension sur l'arbre vasculaire et permettre l'élimination des bulles de la tubulure.
2. Commencez à courir de l'eau déminéralisée (résistivité 18,2 MQ / cm) à travers la pompe à rouleaux à vitesse variable Masterflex L / S à 0,6 ml / h. Assurez-vous qu'aucun des bulles sont présentes dans les tubes avant de connecter avec la lumière de l'intestin robinet. Des bulles peuvent être présents dans la lumière de l'étape1,9, ce qui peut compromettre le processus de décellularisation. Varier la vitesse de la pompe et à manipuler le tissu avec une pince avec soin pour assurer la sortie des bulles à partir de l'extrémité distale. Ne branchez pas la canule vasculaire jusqu'à ce que ce processus est terminé depuis vitesses élevées peuvent endommager l'arbre vasculaire.
3. Appareil pour transférer de la chambre froide, étant donné que l'étape suivante de décellularisation est effectuée à 4 ° C. La basse température permet l'élimination des cellules tout en minimisant la décomposition des tissus. Placez la boîte de Petri dans un récipient qui permettra de recueillir la solution de débordement. Perfuser les deux la lumière intestinale et l'arbre vasculaire avec de l'eau déminéralisée (résistivité de 18,2 MQ / cm) pendant 24 heures à 0,6 ml / h. Pendant la première heure de vérifier l'appareil régulièrement pour s'assurer que toutes les connexions sont sécurisées, la fuite est minime et sans bulles sont présentes dans l'intestin.
4. Après 24 h de traitement avec de l'eau désionisée, Appareil de décellularisation déplacer en dehors de la chambre froide que le reste de la procédure sonteffectuée dans la température ambiante (RT).
5. Peser le désoxycholate de sodium (Sigma, Royaume-Uni) pour préparer 300 ml d'une solution à 4% dans de l'eau désionisée. Peser le désoxycholate de sodium sous une hotte d'aspiration, comme il s'agit d'un irritant oculaire et orale. Mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution est claire. La solution peut être conservée à 4 ° C pendant jusqu'à 1 mois.
6. Changer la solution déminéralisée au désoxycholate de sodium, vérifier les connexions, enlever les bulles et perfuser à 0,6 ml / h pendant 4 heures.
7. Suite à l'désoxycholate de sodium de l'étape de lavage avec du PBS / AA pendant 30 min afin d'éviter une interaction entre le désoxycholate de sodium et de DNase-I.
8. Peser la désoxyribonucléase I (DNase-I, Sigma) et de préparer 250 ml d'une solution 2,000 M 1 kU en chlorure de sodium, pH 7,4. Mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution est claire. Cette solution doit être préparée immédiatement avant l'utilisation et ne peut pas être stockée.
9. Perfuser avec de la DNase I pendant 3 heures à la température ambiante à une vitesse de 0,6 ml / h.
10. Après l'étape de DNase I, transférer leéchafaudage dans une hotte de culture de tissu et de changer les plaques et les instruments. Il est suggéré d'utiliser une technique aseptique.
11. Laver avec du PBS / AA pendant 30 minutes pour s'assurer que tous les restes des solutions de décellularisation sont supprimés. Placez l'échafaud dans une nouvelle boîte de Pétri et transférer à un agent de réticulation UV (Spectroline, États-Unis). Exécutez deux cycles de stérilisation. Conserver dans 5% de PBS / AA et changer la solution tous les 3 jours.

Résultats

Lors de décellularisation réussie (figure 1), l'échafaudage doit avoir un aspect macroscopique similaire à celle de l'intestin d'origine, mais avec des parois translucides (Figure 2A). La préservation de la macro-architecture devrait également être évident par la perméabilité de l'arbre vasculaire. Lorsque le colorant est injecté à travers la canule SMA, il convient de distribuer de façon uniforme tout au long de l'échafaudage et atteindre l'arbre capillaire (Figure 2B). L'échafaudage doit être exempt de matières nucléaires et cytoplasmiques, quelque chose qui peut être évaluée à l'aide d'un kit de quantification de l'ADN et l'analyse histologique simple. Hématoxyline et éosine (H & E) doivent démontrer l'absence de matières nucléaires et cytoplasmiques tout en préservant les petites couches intestinales (figure 3A). En particulier, le maintien des villosités et cryptes sur le côté luminal devrait être évident suivant la microscopie électronique à balayage (figure 4). Aconservation des composants de la matrice extracellulaire telles que le collagène, l'élastine et les glycosaminoglycanes doit également être prévu. Par exemple, la coloration au trichrome de Masson d'étalage intact le tissu conjonctif dans l'échafaudage (figure 3B).

Figure 1. . Dispositif expérimental Chronologie de la procédure de decellularization; PBS / AA: tampon phosphate salin avec NaDeoxy antibiotique antifongique,: désoxycholate de sodium, RT: température ambiante, DNase I: déoxyribonucléase-je. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 2. Échafaudages macroscopiquementc caractéristiques. aspect macroscopique de la intestin grêle de rat suivante decellularization succès (A). Injection de Rosso Ponceau teindre par la SMA démontre un réseau vasculaire intact (B); SMA: l'artère mésentérique supérieure Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3. . Histologie H & E (A) et MT (B) coloration indiquent une absence de matériau cellulaire à la préservation de l'architecture du tissu conjonctif, H & E: hématoxyline et l'éosine, MT: trichrome de Masson. Barre d'échelle:. 100 um Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 4. . Microscopie électronique microscopie électronique à balayage indique l'architecture des villosités-crypt conservé dans la lumière de l'échafaudage; barre d'échelle:. 100 um Cliquez ici pour agrandir l'image .

Discussion

Les étapes les plus difficiles dans la mise en place de cette expérience impliquent la perforation de la SMA et la mise en place et le maintien de la stérilité. Canulation du SMA chez les rongeurs, sans rupture de la paroi peut être très difficile en raison de la taille et la position du navire. En variante, une suture peut être placée autour de l'aorte proximale avant l'origine SMA, suivie par une canulation de l'aorte elle-même de manière distale, de diriger la canule en matière plastique dans le SMA. Pendant decellularization une combinaison de placement de la canule pauvres et des débits élevés peut entraîner la perte de l'accès vasculaire. La stérilité est un problème majeur en raison de la quantité de la flore bactérienne présente dans l'intestin grêle. Lavage avec du PBS / AA après la récolte est très important, et aucun signe de matières fécales ou de débris doit être retiré de la lumière. Placer une partie de l'échafaudage dans un tube Falcon avec du DMEM dans l'incubateur après la stérilisation UV doit être un indicateur si la stérilité a été atteint. Dans le casde la colonisation bactérienne, les médias vont changer le pH avec sa couleur passant du rouge au jaune. Pour régler ce problème, d'autres cycles UV sont invités ainsi que le lavage avec du PBS contenant une forte concentration de l'antibiotique / antifongique.

Une modification possible d'obtenir un échafaudage avec un accès à la fois vasculaire et veineuse serait de cathétériser la veine cave inférieure (IVC), ainsi que le SMA. Decellularization sur les côtés veineux et vasculaires devrait être tentée par intermittence pour les trois solutions. Decellularization continu peut éclater les capillaires en ayant une pression positive sur les deux côtés.

Au fil des années il ya eu un certain nombre d'efforts dans intestinale TE utilisant différentes combinaisons de cellules échafaudage in vitro et in vivo ^6,9,12. La majorité des travaux a été effectuée à l'aide non-tissé 95% PGA 5% échafaudages tubulaires PLGA revêtus de collagène de type I ^6,7,13,22. Suite à l'ensemencement avec intestinaleunités épithéliales organoïdes (UO) et une période d'implantation dans l'omentum de souris, ils forment avec les kystes muscle sur le côté extérieur et de l'épithélium à l'intérieur qui peut ensuite être tubularized. Cependant, la porosité et la simplicité dans la conception de ces échafaudages ne permet pas à la génération de grands morceaux de boyaux artificiels dans un environnement in vitro, telle que celle d'un bioréacteur. En outre, l'absence d'un réseau vasculaire innée qui peut être connecté au destinataire limite davantage l'utilisation de cet échafaudage pour l'application clinique. Outre les expériences avec les échafaudages PGA-PLGA, les autres groupes ont utilisé des échafaudages de collagène ou de SIS, qui tous deux ne se répliquent pas la complexité de l'appareil intestinal. SIS en particulier, est la seule méthodologie publiée précédent de l'ingénierie tissulaire intestinal et a été utilisé dans plus de 150 paramètres médicaux, ce qui démontre la capacité des échafaudages décellularisées pour fournir une stabilité mécanique et de promouvoir la croissance des cellules tout en plombment à aucune réponse immunogène. Cependant, le manque de l'architecture micro-macro et appropriée, a conduit à des résultats médiocres dans son «utilisation à des fins TE intestinales ^9-11,23.

Les avantages de la méthode de decellularization nous avons décrits comprennent la préservation des caractéristiques microscopiques tels que l'architecture crypte-villosité luminale qui représentent un environnement approprié pour le repeuplement par la niche de cellules souches intestinales. Dans l'aspect macroscopique, la présence d'un réseau vasculaire hiérarchique va permettre la fixation au destinataire, en permettant la fourniture de substances nutritives et de l'oxygène à toutes les couches de l'intestin ^TE-21. De plus, le maintien de composants de la MEC telles que le collagène, l'élastine et glyocosaminoglycans a un rôle important non seulement pour les caractéristiques mécaniques, mais aussi à diriger la prolifération et la différenciation cellulaire. Plus important, la capacité de la méthode de décellularisation à être étendu dans un grandtissus r tout en conservant les mêmes caractéristiques est un élément important pour la traduction clinique de TE.

La mise au point d'une matrice intestinale naturelle avec un réseau vasculaire permet de créer des segments plus larges de l'intestin artificielle qui peut être relié à l'hôte.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution d’éthanol, 70 % dans H20	Sigma	02877
Comprimés salins tamponnés au phosphate	Sigma	79382
Solution antibiotique antimycosique (100x)	Sigma	A5955
Désoxycholate de sodium	Sigma	D6750	Irritant oral et oculaire ; protection contre l’utilisation
Chlorure
Désoxyribonucléase I du pancréas bovin	Sigma	D5025