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Article de méthode

Quantitative

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DOI :

10.3791/50677

⸱

23 août 2013

 ,  , 
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

Dans cet article

Résumé

L'adhésion des neutrophiles à l'endothélium activé sur les sites d'infection est une partie intégrante de la réponse inflammatoire de l'hôte. Décrite dans le présent rapport est une analyse de liaison des neutrophiles qui permet de In vitro Quantification des neutrophiles humains primaire liaison aux cellules endothéliales activées par des médiateurs inflammatoires dans des conditions statiques.

Résumé

L'endothélium vasculaire joue un rôle essentiel dans la réponse inflammatoire. Pendant la phase aiguë de l'inflammation, les cellules endothéliales (EC) sont activés par des médiateurs d'accueil ou directement par des composants microbiens conservés ou molécules de danger dérivées de l'hôte. Activés CEs cytokines express, des chimiokines et de molécules d'adhésion qui mobilisent, activent et conservent leucocytes au site de l'infection ou de blessure. Les neutrophiles sont les premiers leucocytes à arriver, et adhèrent à l'endothélium à travers une variété de molécules d'adhésion présentes sur les surfaces des deux cellules. Les principales fonctions des neutrophiles sont d'éliminer directement les menaces microbiennes, de promouvoir le recrutement d'autres leucocytes à travers la libération de facteurs supplémentaires, et d'initier la cicatrisation des plaies. Par conséquent, leur recrutement et leur attachement à l'endothélium est une étape critique dans l'initiation de la réponse inflammatoire. Dans ce rapport, nous décrivons un test d'adhérence in vitro en utilisant des neutrophilescalcéine AM-étiqueté neutrophiles humains primaires pour quantifier le degré d'activation des cellules endothéliales microvasculaires, en conditions statiques. Cette méthode présente l'avantage supplémentaire que les mêmes échantillons quantifiés par spectrophotométrie de fluorescence peuvent également être visualisés directement par microscopie de fluorescence pour une évaluation plus qualitative de la liaison des neutrophiles.

Introduction

Depuis l'endothélium vasculaire est en contact direct avec le sang circulant, il est situé de façon unique pour initier une réponse inflammatoire rapide lors de l'infection ou de blessure. Les cellules endothéliales (EC) expriment motif récepteurs de reconnaissance qui reconnaissent une variété de composants bactériens conservés et des molécules de danger, et les récepteurs pour les hôtes médiateurs inflammatoires telles que le TNFa. L'activation de ces récepteurs induit EC de sécréter des cytokines (par exemple IL-6, IL-8, CXCL1 et CCL2), et à réguler à la hausse des molécules d'adhésion (par exemple, E / P-sélectine, VCAM-1 et ICAM-1) à leur surface cellulaire 1 , 2. Ces molécules tous facilitent la localisation des leucocytes aux sites d'infection et les blessures afin d'effacer l'hôte des agents infectieux et de lancer la réparation des tissus 3,4. La réponse des neutrophiles à l'infection implique une interaction bien coordonnée entre l'endothélium vasculaire et la réponse neutrophiles. Lors de l'activation CE, IL-8 est sécrété et forme un gradient intra-vasculaire sur l'endothélium qui permet neutrophiles à l'accueil au site de l'infection ou de blessure 5,6. E / P-sélectine médiate neutrophiles capture et rouler à travers les associations relativement faibles avec glycomolecules sur la surface des cellules neutrophiles. Ces interactions, avec liaison de l'IL-8 et de ses récepteurs apparentés, facilitent le solide, l'attachement médiée par l'intégrine et arrêt éventuel de neutrophiles à la surface des cellules endothéliales 7-10. Après l'arrestation, les neutrophiles peuvent migrer hors de la vascularisation des sites spécifiques d'infection à éliminer directement les agents pathogènes, de générer des pièges extracellulaires neutrophiles pour prévenir la propagation d'agents pathogènes, de favoriser la guérison des plaies et libérer des facteurs supplémentaires qui recrutent d'autres leucocytes tels que les monocytes, macrophages et dendritiques cellules 11-17.

Décrite dans le présent rapport est une méthode in vitro pour quantifier l'adhésion des neutrophiles à microVasculaire ECS après activation par l'hôte médiateur inflammatoire TNF. Ce test est conçu pour évaluer l'activation des EC, et non des neutrophiles. Neutrophiles humains primaires sont d'abord isolés par séparation par gradient de densité, et sont ensuite marquées à la calcéine acétoxyméthylique (AM). Estérases l'intérieur des cellules en direct hydrolyze calcéine AM à la molécule de calcéine hautement fluorescent avec une excitation de 492-495 nm et une émission de 513-516 nm 18. Les neutrophiles marquées par fluorescence sont ensuite incubés avec des monocouches CE et neutrophiles non adhérentes sont ensuite éliminés. La fluorescence des autres, les neutrophiles lié est ensuite mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre à fluorescence, et calculé en pour cent de l'apport total par fluorescence neutrophiles bien. Cette méthode présente l'avantage supplémentaire que les neutrophiles liés calcéine marqués utilisés en spectrophotométrie peuvent être directement visualisées par microscopie à fluorescence pour donner une plus qualitative lire des CE acvation. Depuis cet essai est effectué dans des conditions statiques, seuls les événements très initiales qui se produisent dans la cascade de l'adhésion des neutrophiles seront évalués. Ceci est confirmé dans ce rapport en utilisant des anticorps bloquants E-sélectine à montrer que l'adhésion des neutrophiles au TNFa humain poumon traité CE microvasculaire (HMVEC-Lung) monocouches est considérablement réduite lorsque l'interaction avec E-sélectine est perturbé.

En plus de TNF, nous avons utilisé avec succès ce test pour déterminer l'étendue de la veine activation humaine ombilical CE (HUVEC) par le récepteur Toll-like de 1/2 agonistes lipoprotéine associée à un peptidoglycane (PAL), murein lipoprotéine (MLP) et Pam3Cys et activation HMVEC-Lung par Pam3Cys 19,20. En outre, nous avons utilisé avec succès ce test avec les inhibiteurs de kinases et après knockdown ARNi médiée de surface et protéines cytoplasmiques dans HMVEC-Lung, ce qui suggère que cette méthode est compatible avec une variété de biochimie et screenindosages g 20. En résumé, ce test fournit une interface facile à utiliser, de façon reproductible, plus fonctionnel pour accéder à l'importance de l'activation CE par des médiateurs inflammatoires in vitro.

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Protocole

1. Placage et l'entretien des cellules endothéliales microvasculaires

  1. Décongeler et faire croître les cellules endothéliales microvasculaires selon les fabricants fournis instructions. Dans ce protocole, les cellules ont été cultivées dans EGM-2 médias MV (Lonza), et il est recommandé que toutes les expériences sont effectuées dans les deux semaines suivant la décongélation de minimiser toute variation due au nombre de passages. Nos expériences avec HMVEC-Lung sont effectués entre les passages 4 à 9.
  2. Jour 1: Lorsque les cellules atteignent 80-90% de confluence, trypsiniser et remettre à 120.000 cellules par ml. Plate 36.000 cellules (0,3 ml) par puits dans 48 puits, plaque de culture tissulaire en polystyrène (s). Inclure les puits de HMVEC qui ne sera pas mis à incuber avec des neutrophiles afin d'obtenir une lecture de fluorescence de fond. À moins d'utiliser des plaques à 48 puits spécialement conçues pour les essais par fluorescence, des lignes ou des colonnes en alternance permettra de minimiser toute contamination lumière des puits voisins. NOTE: Les puits peuvent être pré-enduit de poly-lysiNE, collagène ou fibronectine.
  3. Jour 2: Ajouter des milieux frais.
  4. Jour 3: En microscopie en contraste de phase, confirment les cellules sont en bonne santé (c. apparence "pavé" et peu de débris cellulaires), et ils sont 100% de confluence (Figure 1). Si les cellules ne sont pas 100% de confluence, changer les médias tous les jours jusqu'à ce qu'ils soient prêts.
  5. Une fois les monocouches HMVEC sont prêts pour le traitement, laver les cellules une fois avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et ajouter 0,3 ml d'EGM-2 médias ou médias MV frais contenant agoniste inflammatoire dans les puits appropriés. Dans ce protocole, le HMVEC-pulmonaire ont été traités avec le TNFa [100 ng / ml] (PeproTech, New Jersey) pendant 3 heures car il s'agit d'un activateur bien décrit des EC 21. NOTE: Il est recommandé de temps votre expérience afin que vos cellules HMVEC activés (étape 4.1) et calcéine AM neutrophiles marquées (Étape 3.5) sont prêts à utiliser en même temps. Il nous faut environ 2,5 heures pour isoler et étiqueter neutrophILS.

2. Isolement des neutrophiles en utilisant Polymorphprep

  1. Isoler les neutrophiles, comme décrit précédemment 22, ou avec une solution de gradient densité ready-made pour isoler les granulocytes neutrophiles dans le sang total. Employant Polymorphprep suivant le protocole par Nuzzi et.al. résultats 2007 des rendements d'environ 2-3 x 10 6 neutrophiles par ml de sang total 23. REMARQUE: Pour éviter la lyse des érythrocytes excessive, une sédimentation dextran pour éliminer les globules rouges peut être effectuée avant la centrifugation de gradient de densité 24.
  2. Porter la solution à gradient de densité Polymorphprep à RT.
  3. Recueillir 30 ml de sang total à partir d'un volontaire humain sain, en présence d'un anticoagulant tel que l'héparine, le citrate ou l'EDTA. Le sang doit être utilisé dans les 2 heures et maintenue entre 18-22 ° C.
  4. Couche 5 ml de sang total plus de 5 ml de la solution à gradient de densité dans un tube conique de 15 ml (Figure 2A). Éviter de modifier les volumes de sang et la solution de gradient de densité, car cela pourrait modifier les conditions de centrifugation ultérieures.
  5. Centrifuger à 450 g pendant 30 min à 18-22 ° C. Assurez-vous d'accélérer lentement de haut en bas de la centrifugeuse (c.-à désactiver le frein de la centrifugeuse), et d'équilibrer les tubes bien pour éviter les vibrations pour aider à réduire l'activation des neutrophiles et d'empêcher le mélange des couches. Temps de centrifugation ou la force centrifuge plus élevé se traduira par la couche leucocytaire inférieure, qui contient des neutrophiles, de migrer plus loin vers les globules rouges agglomérés.
  6. Aspirer le plasma et la bande de leucocytes supérieur contenant CMSP pour empêcher la contamination de la couche contenant les neutrophiles (figure 2B).
  7. Utiliser une pipette sérologique 1-2 ml pour enlever la couche de leucocytes polynucléaires neutrophiles inférieur contenant. Combiner les couches de neutrophiles dans 30 ml de PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +) dans un 50 mltube conique.
  8. Porter le volume à 50 ml avec du PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +) et centrifuger à 450 g pendant 10 min à 18-22 ° C.

Remarque: Les étapes 2.9 et 2.10 sont facultatives mais fortement recommandées.

  1. Aspirer le surnageant. Reprendre le neutrophiles dans 8 ml d'eau stérile pendant 30 secondes pour lyser les globules rouges, ajouter immédiatement la suspension de cellules à 2 ml de 5x PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +) et mélanger délicatement à la main. Ne pas incuber les cellules en l'eau pendant plus de 30 secondes depuis la mort de neutrophiles importante peut se produire.
  2. Centrifuger à 250 g pendant 5 min à 18-22 ° C.
  3. Laver les cellules une fois avec 10 ml de PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +) et centrifuger à 250 g pendant 5 min à 18-22 ° C.
  4. Reprendre les neutrophiles dans 10 ml de RPMI-1640 (sans rouge de phénol) et de compter les cellules vivantes en utilisant le bleu trypanteindre méthode d'exclusion. Éviter les périodes prolongées de fortes densités cellulaires supérieures à 5 x 10 6 par ml, car cela pourrait entraîner une activation des neutrophiles.

3. Neutrophiles étiquetage avec Calcein AM

  1. 6 x 10 5 cellules neutrophiles sont utilisés par puits d'une plaque à 48 puits.
  2. Après le dépouillement, transférer les cellules remises en suspension dans un tube conique de 50 ml et diluer les neutrophiles à 2-4 x 10 6 cellules par ml de rouge de phénol libre RPMI-1640.
  3. Ajouter calcéine AM solution stock à 3 pm (ie 2,98 ul de calcéine AM stock (1 mg / ml) par ml de milieu) et bien mélanger en tapotant doucement le tube. Plus de 5 uM AM calcéine va entraîner une fuite des neutrophiles. Remarque: non fluorescent calcéine AM est clivée dans les cellules par des estérases endogènes pour produire la molécule hautement fluorescent calcéine (ie les cellules mortes ne fluorescence).
  4. Couvrez le tube avec du papier d'aluminium et laisser incuber for 30 min à 37 ° C dans l'obscurité. Remarque: des temps d'incubation plus longue peut entraîner une plus calcéine être libérée des neutrophiles au cours de l'essai d'adhésion.
  5. Centrifugeuse à 450 g pendant 5 min à 18-22 ° C, et laver les neutrophiles 2x avec 10 ml de RPMI-1640 (sans rouge de phénol, préchauffé à 37 ° C). Après remise en suspension des cellules pour le second lavage, d'abord passer les neutrophiles si un filtre stérile de 40 uM à éliminer les agrégats, puis centrifuger une fois de plus à 450 g pendant 5 min à 18-22 ° C.
  6. Reprendre les neutrophiles dans RPMI 1640 (sans rouge de phénol, préchauffé à 37 ° C) à 2 x 10 6 neutrophiles par ml.

4. Essai de liaison des neutrophiles

  1. Laver les monocouches HMVEC 3x avec 0,5 ml de stérilisée par filtration (0,22 um) RPMI 1640 (sans rouge de phénol) contenant 3% de BSA par puits.
  2. Aspirer les médias et ajouter 6 x 10 5 neutrophiles calcéine marqués (0,3 ml de suspension cellulaire), Soit 0,3 ml de RPMI 1640 (sans rouge de phénol) sans neutrophiles, les puits appropriés de la plaque de 48 puits. Note: Ceci est l'équivalent de 8 x 10 5 neutrophiles par cm 2.
  3. Incuber pendant 20 min à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
  4. Nombre de neutrophiles Fluorescence (prélavage): Mesurer l'intensité de fluorescence de chaque puits avec une longueur d'onde d'excitation de 485 nm et une longueur d'onde d'émission de 520 nm (jeu de filtres fluorescéine) dans un FLUOstar, ou équivalent, spectrophotomètre. Effectuez cette étape juste avant le point final d'incubation Note: Dans ce protocole, calcéine excitation et la détection de la lumière émise ont été réalisés depuis le sommet des puits découverts, mais les deux peuvent également être effectuées à partir du fond des puits..
  5. Laver les puits contenant des monocouches HMVEC et des neutrophiles 5x avec 0,5 ml par puits de PBS (w / Ca 2 + et Mg 2 +). Retirez le papier et les lavagesen inversant la plaque et tapoter délicatement sur du papier absorbant pour enlever le liquide restant.
  6. Rajouter 0,3 ml de RPMI 1640 (sans rouge de phénol) par puits.
  7. Adhérent neutrophiles Fluorescence (POST lavage): Mesurer l'intensité de fluorescence de chaque puits comme dans l'étape 4.4.
  8. Déterminer le respect de pour cent et adhérence relative par puits:

Remarque: A ce stade, les images des neutrophiles calcéine-marqués peuvent être obtenus en utilisant un microscope capable fluorescence équipé de filtres fluorescéine standard. Les images de la figure 4 ont été obtenus sur un Olympus IX51 microscope inversé équipé d'une caméra 2000R Retiga (Q Imaging) en utilisant Q-Capture logiciel Pro7 (Q Imaging).

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Résultats

Afin d'obtenir des résultats fiables et reproductibles en utilisant un test de liaison des neutrophiles, il est essentiel que la santé et la confluence des cellules endothéliales microvasculaires sont optimales le jour de l'essai, comme illustré avec HMVEC-Lung à la figure 1. En outre, il est impératif que nombre passage bas microvasculaire EC sont utilisés (soit moins de 9 passages), et en conséquence, nous conseillons d'effectuer toutes les expériences dans les deux semaines suiva...

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Discussion

Les étapes les plus importantes pour un neutrophile succès / test d'adhérence des cellules endothéliales microvasculaires sont les suivants: 1) Utilisation de faible nombre de passage (<9), les cellules endothéliales saines; 2) le maintien des neutrophiles isolés à dire <5 x 10 6 cellules de faible densité ( / ml) et de les utiliser dans les deux heures d'isolement, et 3) le lavage fastidieuse des neutrophiles calcéine AM-étiquetés et utiliser des neutrophiles calcéine AM-étiquetés en t...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le ministère de l'UCSF des soins d'anesthésie et de soins périopératoires.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
HMVEC-LungLonzaCC-2527
EGM-2 MVLonzaCC-3202
HBSSLife Technologies14175-095Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur
Plaques de culture tissulaire à 48 puitsBD Falcon353078
PBS (sans rouge de phénol)Installation de culture cellulaire UCSFCCFAL001Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur
D-PBS (sans Ca2+ et Mg2+ et rouge de phénol)Installation de culture cellulaire UCSFPeut être remplacé par n’importe quel fournisseur
RPMI-1640 (sans rouge de phénol)Life Technologies11835-030
PolymorphprepAxis-Shield1114683
calcéine AMLife TechnologiesC3099(0,995 mM) stock soln
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154
40 &mu ; Filtres MVWR21008-949Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur
FLUOstar OPTIMA SpectrophotomètreBMG LABTECH-
CCFAL003

Références

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