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La microscopie à super résolution basée sur la localisation peut être appliquée pour obtenir une carte spatiale (image) de la distribution de molécules uniques individuelles marquées par fluorescence dans un échantillon avec une résolution spatiale de dizaines de nanomètres. À l’aide de protéines fluorescentes photoactivables (PAFP) ou photocommutables (PSFP) fusionnées à des protéines d’intérêt, ou à des colorants organiques conjugués à des anticorps ou à d’autres molécules d’intérêt, la microscopie de localisation par photoactivation par fluorescence (FPALM) peut imager simultanément plusieurs espèces de molécules au sein d’une seule cellule. En utilisant l’approche suivante, des populations de grands nombres (des milliers à des centaines de milliers) de molécules individuelles sont imagées dans des cellules uniques et localisées avec une précision de ~10-30 nm. Les données obtenues peuvent être appliquées pour comprendre les distributions spatiales à l’échelle nanométrique de plusieurs types de protéines au sein d’une cellule. L’un des principaux avantages de cette technique est l’augmentation spectaculaire de la résolution spatiale : alors que la diffraction limite la résolution à ~200-250 nm en microscopie optique conventionnelle, FPALM peut imager des échelles de longueur plus d’un ordre de grandeur plus petites. Comme de nombreuses hypothèses biologiques concernent les relations spatiales entre différentes biomolécules, l’amélioration de la résolution de FPALM peut donner un aperçu de questions d’organisation cellulaire qui étaient jusqu’alors inaccessibles à la microscopie à fluorescence conventionnelle. En plus de détailler les méthodes de préparation des échantillons et d’acquisition de données, nous décrivons ici la configuration optique de FPALM. Le coût est un facteur supplémentaire à prendre en compte pour les chercheurs qui souhaitent faire de la microscopie à super-résolution : les installations internes sont nettement moins chères que la plupart des machines d’imagerie disponibles dans le commerce. Les limites de cette technique comprennent la nécessité d’optimiser le marquage des molécules d’intérêt dans les échantillons cellulaires et la nécessité d’un logiciel de post-traitement pour visualiser les résultats. Nous décrivons ici l’utilisation de l’expression de PAFP et PSFP pour imager deux espèces de protéines dans des cellules fixes. L’extension de la technique à des cellules vivantes est également décrite.