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Article de méthode

Imagerie multicolore simultanée de structures biologiques avec microscopie de localisation par photoactivation de fluorescence

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⸱

DOI :

10.3791/50680

⸱

9 décembre 2013

 ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, University of Maine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous démontrons l’utilisation de la microscopie de localisation par photo-activation de fluorescence (FPALM) pour imager simultanément plusieurs types de molécules marquées par fluorescence au sein des cellules. Les techniques décrites permettent de localiser des milliers à des centaines de milliers de protéines individuelles marquées par fluorescence, avec une précision de plusieurs dizaines de nanomètres à l’intérieur de cellules uniques.

Résumé

La microscopie à super résolution basée sur la localisation peut être appliquée pour obtenir une carte spatiale (image) de la distribution de molécules uniques individuelles marquées par fluorescence dans un échantillon avec une résolution spatiale de dizaines de nanomètres. À l’aide de protéines fluorescentes photoactivables (PAFP) ou photocommutables (PSFP) fusionnées à des protéines d’intérêt, ou à des colorants organiques conjugués à des anticorps ou à d’autres molécules d’intérêt, la microscopie de localisation par photoactivation par fluorescence (FPALM) peut imager simultanément plusieurs espèces de molécules au sein d’une seule cellule. En utilisant l’approche suivante, des populations de grands nombres (des milliers à des centaines de milliers) de molécules individuelles sont imagées dans des cellules uniques et localisées avec une précision de ~10-30 nm. Les données obtenues peuvent être appliquées pour comprendre les distributions spatiales à l’échelle nanométrique de plusieurs types de protéines au sein d’une cellule. L’un des principaux avantages de cette technique est l’augmentation spectaculaire de la résolution spatiale : alors que la diffraction limite la résolution à ~200-250 nm en microscopie optique conventionnelle, FPALM peut imager des échelles de longueur plus d’un ordre de grandeur plus petites. Comme de nombreuses hypothèses biologiques concernent les relations spatiales entre différentes biomolécules, l’amélioration de la résolution de FPALM peut donner un aperçu de questions d’organisation cellulaire qui étaient jusqu’alors inaccessibles à la microscopie à fluorescence conventionnelle. En plus de détailler les méthodes de préparation des échantillons et d’acquisition de données, nous décrivons ici la configuration optique de FPALM. Le coût est un facteur supplémentaire à prendre en compte pour les chercheurs qui souhaitent faire de la microscopie à super-résolution : les installations internes sont nettement moins chères que la plupart des machines d’imagerie disponibles dans le commerce. Les limites de cette technique comprennent la nécessité d’optimiser le marquage des molécules d’intérêt dans les échantillons cellulaires et la nécessité d’un logiciel de post-traitement pour visualiser les résultats. Nous décrivons ici l’utilisation de l’expression de PAFP et PSFP pour imager deux espèces de protéines dans des cellules fixes. L’extension de la technique à des cellules vivantes est également décrite.

Introduction

Bien que les structures cellulaires existent sur une large gamme d’échelles spatiales, l’imagerie par fluorescence de l’organisation cellulaire sur des échelles de longueur inférieures à ~250 nm est limitée en microscopie conventionnelle en raison de la contrainte physique de la limite de diffraction. Cette limite a été surmontée avec l’avènement de la microscopie de localisation par photoactivation de fluorescence (FPALM1) et de techniques similaires2,3, qui permettent de localiser un grand nombre de molécules individuelles avec une précision de ~10 nm, pour générer des images avec une résolution de quelques dizaines de nanomètres. FPALM est basé sur l’utilisation du contrôle optique pour activer et inactiver des sous-ensembles de molécules (pour une description complète de FPALM, et des instructions sur la façon de mettre en œuvre ce système d’imagerie, voir Gould et al.4). Cette technique permet de cartographier les distributions spatiales de populations entières de molécules uniques, élucidant ainsi les structures biologiques à travers des échelles de longueur allant de dizaines de nanomètres à des dizaines de microns. La microscopie à super-résolution basée sur la localisation (ci-après dénommée microscopie de localisation) a maintenant été adaptée pour répondre à une série de questions biologiques, les développements technologiques permettant, par exemple, l’imagerie d’orientations moléculaires individuelles avec la polarisation FPALM, ou P-FPALM5, l’imagerie par fluorescence de molécules uniques en trois dimensions avec Biplan FPALM6 ou d’autres techniques7-9, et l’imagerie par fluorescence à super-résolution de molécules uniques dans des cellules vivantes10-12. La microscopie de localisation a également été appliquée à l’imagerie de plusieurs espèces dans les cellules fixes13-16. Récemment, trois espèces de protéines ont été imagées simultanément avec FPALM dans des cellules fixes et vivantes17. La microscopie de localisation peut imager des échantillons étiquetés de différentes manières : il s’agit par exemple de protéines exprimées avec des marqueurs de fusion PAFP ou PSFP, d’anticorps ou de molécules marquées avec des colorants organiques en cage ou des colorants organiques conventionnels. Alors que l’utilisation de colorants fluorescents conventionnels permet le marquage des protéines en l’absence d’une étiquette de protéine de fusion, les conditions généralement requises pour l’utilisation de colorants organiques non en cage dans l’imagerie à super-résolution exigent que les échantillons soient immergés dans des tampons réducteurs2. De plus, l’administration intracellulaire de conjugués anticorps-colorant nécessite généralement que les cellules soient fixées et que leurs membranes soient perméabilisées. ou exige que les cellules vivantes soient rendues perméables par électroporation ou par d’autres moyens. Les exigences relatives à la réduction des conditions tampons et à la perméabilisation de la membrane limitent l’adéquation des colorants organiques pour l’imagerie de cellules vivantes, bien que les développements récents aient permis une utilisation efficace des HaloTags et de FPALM pour imager les structures membranaires18.

FPALM a été la première technique de microscopie de localisation à être appliquée aux cellules vivantes10. Dans les cellules vivantes, en plus de fournir une carte spatiale dépendante du temps des emplacements des molécules marquées, FPALM peut suivre des molécules uniques sur plusieurs images, et des trajectoires moléculaires déterminées sur des échelles de temps de quelques millisecondes19. Ainsi, FPALM donne accès à des échelles de temps assez courtes et à une résolution à l’échelle nanométrique.

Multicolor FPALM peut être utilisé pour une variété de sondes différentes, y compris les protéines photoactivables et les colorants organiques en cage ou non. Nous fournissons ici des détails sur le protocole et la configuration pour l’imagerie simultanée de deux espèces de protéines fluorescentes, Dendra2 et PAmCherry. Nous rapportons les résultats de l’imagerie de PAmCherry conjugué à la bêta-actine (PAmCherry-actin) et de Dendra2 conjugué à l’hémagglutinine de la grippe (Dendra2-HA) dans les fibroblastes NIH-3T3. Les composants décrits dans la configuration peuvent être échangés contre d’autres matériels plus adaptés à l’imagerie d’autres sondes. Lorsque c’est le cas, nous avons essayé d’être explicites dans le texte.

Multicolor FPALM est idéal pour rapporter les distributions spatiales de plusieurs espèces de protéines dans des cellules vivantes ou fixes. Cette technique est particulièrement adaptée à l’étude des relations spatiales et/ou dynamiques à des échelles spatiales nanométriques, bien que les images signalent une localisation sur une gamme d’échelles de longueur, allant de dizaines de nanomètres à des dizaines de microns. L’un des principaux avantages du FPALM multicolore est que la configuration est relativement peu coûteuse à construire et très flexible pour une utilisation avec diverses combinaisons de sondes. Le processus de construction et d’étalonnage du système à partir des composants permet également de mieux comprendre les facteurs qui peuvent compromettre la qualité et l’intelligibilité des données, et donc le résultat de la recherche. Nous détaillons ici les méthodes de configuration optique, de préparation d’échantillons et d’acquisition de données de plusieurs espèces de protéines, avec des constructions de fusion PSFP et PAFP, à l’aide de FPALM. Bien que ce protocole décrit l’analyse des cellules fixes, ces procédures sont facilement applicables à l’imagerie des cellules vivantes.

La configuration optique décrite ici est idéale pour l’imagerie simultanée du PSFP Dendra2 et du PAFP PAmCherry. De nombreuses autres sondes peuvent être utilisées pour l’imagerie multicolore ; Cependant, les composants précis requis peuvent varier en fonction des spectres d’excitation et d’émission des sondes choisies. Les choix de miroirs dichroïques, de filtres et de longueurs d’onde laser doivent être faits en fonction de ces considérations.

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Protocole

Remarque : Une représentation schématique des composants optiques référencés dans ce protocole se trouve à la figure 1.

1. Préparation de l’échantillon de cellule

  1. Cellules à plaque à une densité optimisée (pour les cellules NIH-3T3, cela est d’environ 2-5 x 104 cellules/cm2) dans les puits d’une chambre à 8 puits. Les cellules doivent être plaquées dans un milieu complet adapté au type de cellule, bien que les milieux doivent être fabriqués sans antibiotiques et sans rouge de phénol, qui contribue à la fluorescence de fond. Notez que les conditions d’expérimentation cellulaire, telles que la plage optimale des nombres de passages, peuvent différer pour chaque lignée cellulaire.
  2. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 °C et 5 % de CO2 (ou dans des conditions appropriées au type de cellule) pour permettre aux cellules d’adhérer à la lamelle. Cellules transfectives avec de l’ADN exempt d’endotoxines pour chacune des deux espèces de protéines construites (dans ce cas, l’ADN pour PAmCherry-actin et Dendra2-HA). Couvrez l’échantillon d’un matériau imperméable léger tel qu’une feuille d’aluminium. La transfection devrait inclure les puits avec les deux constructions d’ADN, et les puits avec une seule de chacune de ces constructions.
  3. Incuber pendant 4 à 6 heures, à 37 °C et 5 % de CO2 (ou dans des conditions appropriées au type de cellule), avant de passer à un milieu complet (avec antibiotiques, sans rouge de phénol) et d’incuber davantage pendant 16 à 48 heures pour permettre aux cellules d’exprimer les protéines souhaitées.
    1. Les cellules peuvent être réparées en les lavant trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis en les incubant avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) (ATTENTION : Toxique) dans du PBS pendant 15 minutes à RT, puis en les lavant 3 fois avec du PBS. Cependant, en fonction des protéines d’intérêt, cette fixation peut aboutir à un pool important de molécules marquées qui sont encore mobiles. Pour réduire davantage la mobilité, d’autres méthodes de fixation comprennent l’utilisation de 100 % de méthanol réfrigéré, ou de glutéraldéhyde à 0,2 % et de PFA à 4 % dans du PBS pendant >30 min à 25 °C20. Dans l’une ou l’autre méthode, les cellules doivent être lavées avec du PBS comme ci-dessus. Notez que l’utilisation du glutéraldéhyde peut augmenter la fluorescence de fond ou l’autofluorescence dans certaines conditions d’imagerie, et peut nécessiter un traitement post-fixation au borohydrure de sodium21.
  4. L’échantillon peut être conservé à 4 °C, immergé dans du PBS, scellé dans un film auto-scellant, jusqu’à 7 jours avant l’imagerie.

2. Alignement du microscope

  1. Placez une échelle d’étalonnage (réticule) sur la platine du microscope. À l’aide d’un objectif 10X et de la lampe pour la lumière transmise, centrez le réticule au centre du champ de vision (FOV).
  2. Köhler Illumination. Réglez le microscope pour l’éclairage Köhler22. Pour commencer, fermez l’ouverture de champ et, en regardant à travers les oculaires, faites la mise au point sur le réticule. Si les bords de l’ouverture du champ sont flous, ajustez la hauteur du condenseur jusqu’à ce que l’ouverture du champ et le réticule soient nets.
  3. Ajustez la position latérale de l’ouverture du champ jusqu’à ce qu’elle soit centrée par rapport au champ de vision. Fermez l’ouverture du champ jusqu’à ce que seule la grille centrale du réticule soit éclairée.
  4. Pour un alignement grossier de la position de l’appareil photo (c’est-à-dire la première fois que la configuration est alignée), utilisez une intensité de lampe élevée avec l’obturateur de l’appareil photo FERMÉ et ne placez aucun composant dans la boîte B (Figure 1) dans le chemin optique jusqu’à ce que l’étape 2.5 soit atteinte. Ne placez pas L2 et L3 dans le chemin de détection lors du premier alignement de la caméra. Centrez grossièrement l’image du réticule sur l’obturateur de l’appareil photo en ajustant la position verticale et horizontale de l’appareil photo (Figure 2B). Désactivez le gain EM, éteignez les lumières de la pièce et ouvrez l’obturateur de l’appareil photo.
  5. Après avoir réduit l’intensité de la lampe à un niveau qui n’endommagera pas le capteur de l’appareil photo, projetez la lumière de l’image du réticule directement sur le capteur de l’appareil photo (Figure 2A). Faites la mise au point du réticule en ajustant le bouton de mise au point du microscope tout en visualisant l’image en mode vidéo en direct dans le logiciel d’acquisition. Centrez l’image du réticule sur le capteur de l’appareil photo en ajustant la position verticale et horizontale de l’appareil photo (Figure 2B).
  6. Placez L2 et L3 dans la trajectoire de détection entre l’ouverture et l’appareil photo (Figure 2C). Alignez L2 et L3, de sorte que L2 soit à une distance focale du point focal du port de sortie du microscope et L3 à une distance focale du capteur de la caméra. La distance entre L2 et L3 devrait idéalement être égale à la somme des distances focales de L2 et L3, mais peut être quelque peu ajustée pour s’adapter aux contraintes d’espace. L’appareil photo et les objectifs doivent être à la même hauteur que le port de sortie.
  7. Notez que la lumière émise par le microscope doit être centrée sur L2 et L3. Ajustez la distance entre L2 et le microscope pour vous assurer que l’image du réticule est nette à la fois sur l’appareil photo et à travers les oculaires.
  8. Si nécessaire, de petites translations (par exemple <1 mm) de L2 et L3 peuvent être utilisées pour centrer l’image du réticule sur le capteur de la caméra.
  9. Module bicolore. Une fois la position de la caméra optimisée, fixez les composants illustrés dans la case B (Figure 1) dans le chemin de détection. Ces composants peuvent être fixés sur un support amovible, de sorte que l’ensemble du module peut être inséré pour le FPALM multicolore, ou retiré pour d’autres applications FPALM qui ne le nécessitent pas.
  10. La première fois que ces composants sont assemblés, ajustez les longueurs de trajet de chaque canal pour qu’elles soient égales. Projetez le réticule sur la puce de l’appareil photo, ajustez M7 et M9 et/ou fermez l’ouverture de détection (AP) pour éviter le chevauchement spatial entre les deux canaux. Focalisez l’image du réticule dans le canal de lumière réfléchie.
  11. Si l’image dans le canal de lumière transmise n’est pas nette, déplacez M9 (et tournez si nécessaire) jusqu’à ce que l’image du réticule soit nette simultanément dans les deux canaux. Notez que les deux canaux doivent être déplacés latéralement l’un de l’autre (Figure 2D). Ce déplacement, qu’il soit horizontal ou vertical, peut affecter la vitesse d’acquisition. Pour plus d'informations, consultez le manuel d'utilisation de l'appareil photo.
  12. Enregistrez un instantané de l’échelle du réticule (pour l’utiliser plus tard dans le calcul du grossissement global). À l’aide du logiciel de l’appareil photo, sélectionnez la région d’intérêt souhaitée. Des fréquences d’images plus élevées sont généralement possibles pour une région d’intérêt plus petite.

3. Alignement laser

  1. Allumez les lasers de lecture et d’activation. (ATTENTION : Les lasers ne doivent être utilisés qu’après que les opérateurs aient suivi une formation sur la sécurité laser.) Toutes les portes du laboratoire doivent rester fermées, avec seulement du personnel essentiel formé à l’intérieur du laboratoire pendant que les lasers sont alignés. Utilisez les obturateurs SH1 et SH2 pour bloquer respectivement les faisceaux de lecture et d’activation lorsqu’ils ne sont pas utilisés, et des filtres ND pour atténuer les puissances laser à des niveaux sûrs (<1 mW). Il est utile de minimiser tout l’éclairage de la pièce pendant l’alignement, à l’exception de l’éclairage nécessaire pour la sécurité.
  2. Bloquez les faisceaux d’activation et de lecture. Retirez L1 de la trajectoire laser.
  3. Placez une carte blanche couleur contre M4. La plupart des microscopes composés commerciaux sont dotés d’un obturateur intégré pour bloquer l’éclairage entrant. Si disponible, ouvrez l’obturateur du microscope et faites la mise au point jusqu’à ce que l’image du réticule soit projetée sur M4. Si un obturateur de microscope interne n’est pas disponible, utilisez-le dans un endroit pratique qui empêche tous les faisceaux laser de pénétrer dans le microscope.
  4. Laser de lecture de centrage dans le FOV. Débloquez le faisceau de lecture. Centrez le faisceau de lecture sur le réticule de l’image du réticule sur M4 en ajustant M1.
  5. Projetez l’image du réticule sur M5 et ajustez le miroir M4 jusqu’à ce que le faisceau soit centré sur le réticule de l’image sur M5, de sorte que le faisceau de lecture soit centré avec le réticule du réticule à la fois sur M4 et M5. Bloquez le faisceau de lecture.
  6. Laser d’activation de centrage dans le FOV. Projetez l’image du réticule sur M3 et retirez l’expanseur de faisceau (BE) de la trajectoire laser. Débloquez le faisceau d’activation.
  7. Ajustez M2 pour centrer le faisceau d’activation sur le réticule de l’image du réticule sur M3. Une fois centré, replacez le BE entre M2 et M3, et ajustez la position du BE jusqu’à ce que le faisceau soit centré sur le réticule de l’image du réticule sur M3.
  8. À l’aide d’un objectif 10X, projetez l’image du réticule sur M5, en ajustant le bouton de mise au point du microscope si nécessaire pour obtenir la mise au point. Ajustez l’angle de DM1 jusqu’à ce que le faisceau d’activation soit centré sur l’image du réticule. Bloquez les deux faisceaux.
  9. En l’absence d’objectif en place et l’obturateur du microscope ouvert, projetez le laser de lecture à travers l’ouverture arrière du microscope. (ATTENTION : Cette étape crée un risque pour la sécurité laser en dirigeant un faisceau laser parallèle dans une trajectoire verticale non bloquée.) Ajustez M5 jusqu’à ce que le faisceau sorte directement du microscope et atterrisse sur le plafond juste au-dessus, ou qu’il soit centré sur une carte placée sur la monture de l’objectif dans la tourelle.
  10. FACULTATIF : La détermination de l’alignement correct peut être facilitée par l’utilisation d’un échantillon de colorant en solution (dans ce cas, la rhodamine B à ~100 μM dans l’eau ou le méthanol à une profondeur de >0,5 cm à des fins visuelles), placé sur la platine de l’échantillon avec la lentille de l’objectif 60X en place. Si le faisceau est correctement aligné, l’objectif projettera un cône de fluorescence aligné avec l’axe de l’objectif et du microscope. De petits écarts dans le placement du faisceau laser dans l’ouverture arrière de l’objectif feront basculer le cône loin d’un alignement purement vertical.
  11. Bloquez les deux faisceaux. Montez L1 dans la trajectoire du laser à la distance appropriée (c’est-à-dire une distance focale) de l’ouverture arrière de l’objectif de l’objectif. Avec l’objectif 60X en place, laissez le faisceau de lecture se projeter sur le plafond. Ajustez la position horizontale et verticale de L1 (perpendiculaire à la direction de propagation du laser) jusqu’à ce que le faisceau soit centré au-dessus du microscope. Remarque : dans cette étape, le faisceau formera un point plus grand qu’à l’étape précédente.
  12. La position axiale de L1 et sa distance focale affecteront la taille de la zone éclairée au niveau de l’échantillon. À proprement parler, le calcul du profil d’éclairage au niveau de l’échantillon doit tenir compte de la diffraction23. En gros, cependant, le fait de placer L1 à une distance axiale autre qu’une distance focale du plan focal arrière de l’objectif provoquera dans de nombreux cas un profil d’éclairage laser plus petit et plus intense que lorsque L1 se trouve exactement à une distance focale du plan focal arrière. Une zone éclairée plus petite peut être utilisée pour produire une intensité laser plus élevée pour certaines applications, telles que l’imagerie à grande vitesse, par exemple.
  13. Mesure du profil du faisceau de lecture. Avec L1 en place, placez un échantillon de solution de colorant concentré appropriée (dans ce cas, de la rhodamine B à ~100 μM dans l’eau) sur la platine.
  14. Avec le laser d’activation bloqué, projetez le laser de lecture (ajustez ND1 pour obtenir une puissance <<1 mW pour tous les faisceaux exposés) à travers l’objectif 60X et dans le colorant, et (avec le gain EM désactivé) envoyez cette image à la caméra.
  15. Concentrez l’objectif sur l’échantillon. Pour cette étape, une ouverture suffisamment grande est nécessaire pour permettre l’imagerie du profil du faisceau complet.
  16. Déplacez le PA latéralement de sorte que le centre du profil du faisceau et le PA soient concentriques. À l’aide du logiciel de la caméra, choisissez la région d’intérêt pour permettre la lecture de la plus petite région de la caméra encapsulant les deux canaux. Notez ces coordonnées. Enregistrez un seul instantané (il s’agit du profil du faisceau de lecture).
  17. Des images qui reflètent plus correctement le profil du laser au niveau du plan focal seront obtenues lorsque l’échantillon de solution de colorant est aussi mince que possible. Un échantillon aussi mince peut être créé en plaçant une goutte de ~5 ul de solution de colorant entre une lame de microscope et une lamelle.
  18. Mesure du profil du faisceau d’activation. Bloquez le laser de lecture. Projeter le laser d’activation sur l’échantillon ; et projeter cette image à travers la caméra.
  19. Si nécessaire, utilisez le gain EM <100 et ajustez DM1 jusqu’à ce que le faisceau soit centré dans chaque FOV. Enregistrez un instantané du profil du faisceau d’activation.
  20. Mesurez la puissance de chaque faisceau. Retirez la solution de colorant et placez un capteur de wattmètre sur l’objectif 60X (sans milieu d’immersion). Mesurez la puissance de chaque faisceau (activation et lecture) séparément. Notez que la position du wattmètre doit être ajustée avec soin pour s’assurer que toute la puissance laser émise frappe le capteur du wattmètre.
  21. Pour chaque laser, utilisez des filtres à densité neutre (ND1 et ND2) pour ajuster la puissance afin de produire des intensités à l’échantillon approprié pour l’expérience.
  22. Intensité du laser de lecture pour l’acquisition d’images. L’intensité du laser de lecture doit être suffisamment élevée pour exciter et photoblanchir des molécules uniques en l’espace de quelques images. Les valeurs typiques sont 103-10 4 W/cm2 (voir aussi Gould et al.4). L’intensité de l’échantillon dépend de la taille de la zone de l’image, de sorte que la puissance requise pour atteindre l’intensité souhaitée variera d’un système à l’autre.
  23. Intensité du laser d’activation. L’intensité du laser d’activation doit être choisie de telle sorte que le nombre de molécules actives soit faible (par exemple 1-100) dans une trame d’acquisition donnée. En gros, la densité souhaitée est atteinte lorsque la distance la plus proche entre les molécules actives est légèrement supérieure à la résolution limitée par la diffraction (voir aussi Section 6, Imagerie). À mesure que la population de molécules uniques inactives diminue, des intensités plus élevées du laser d’activation sont nécessaires. Les intensités typiques sont de 10-1-10 2 W/cm2.
  24. Optimisez la plaque quart de vague. La plaque quart d’onde (QWP) est facultative, mais l’augmentation du degré de polarisation circulaire de la lecture et les lasers d’activation avec un QWP peuvent augmenter la densité des molécules dans les images finales. Pour optimiser le QWP, placez un polariseur entre le QWP et M5. Bloquez le laser d’activation. Projetez le laser de lecture sur un wattmètre au-dessus de l’objectif 60X sec.
  25. Enregistrez l’angle du QWP. Ajustez le polariseur jusqu’à ce que les puissances maximales et minimales soient atteintes. Notez chacune de ces valeurs et calculez le rapport minimum/maximum. Ajustez l’angle du QWP et répétez ces mesures. Bien qu’il soit souhaitable d’obtenir des valeurs aussi proches que possible de 1,0, un rapport de >0,8 est suffisant pour l’imagerie.

4. Création d’un échantillon durable de perles pour l’alignement des canaux

  1. Diluez un échantillon de billes fluorescentes (de 40 à 100 nm de diamètre) 1:70 dans de l’eau de qualité HPLC. Diluez davantage cette solution mère 1:15 dans de l’eau HPLC, pour un volume final de 200 μl de suspension de billes dans l’eau.
  2. Enduire une lamelle de poly-L-lysine liquide. Incuber à RT pendant 30 min. Aspirez pour éliminer la solution et lavez la lamelle trois fois avec de l’eau de qualité HPLC. Aspirez toute trace d’eau de la lamelle et laissez sécher à RT.
  3. Pipeter 200 μl de la suspension de la bille sur la lamelle. Laissez cette lamelle pendant 20 min à RT avant de laver trois fois avec de l’eau HPLC. Vous pouvez également laisser la lamelle O/N à RT pour permettre à la suspension de sécher.
  4. À l’aide de ~20 μl d’eau HPLC ou de support de montage, montez la lamelle sur une lame de verre. Scellez la périphérie de la lamelle avec du vernis à ongles transparent. Une fois que le vernis a séché, placez la lamelle (et le milieu d’immersion de l’objectif approprié, soit de l’eau ou de l’huile) sur l’objectif 60X.

5. Acquisition d’images : échantillon de billes d’imagerie pour l’alignement des canaux de détection

  1. Illuminez l’échantillon de billes avec le faisceau laser de lecture à une intensité environ 10 fois inférieure à celle utilisée pour l’imagerie. Avec le gain EM réglé sur 100, projetez l’image sur l’appareil photo et ajustez la mise au point jusqu’à ce que des perles soient visibles dans les deux canaux.
  2. Si les billes sont faibles, augmentez la puissance du laser ou le gain EM. La minimisation du bruit dans les images de billes (en détectant un grand nombre de photons, c’est-à-dire au moins 5 000 au total à partir de chaque bille) est essentielle pour un repérage précis des canaux. Configurez l’appareil photo pour qu’il enregistre 100 images, avec le même temps d’exposition que celui utilisé pour les images FPALM ultérieures.
  3. Recherchez des régions où les billes sont réparties à la fois au centre et à la périphérie des canaux, et où la densité des billes est suffisamment faible pour que les billes individuelles soient bien séparées et puissent être identifiées individuellement.
  4. Acquérez entre 10 et 20 ensembles d’images de différentes régions à ces densités de billes. Voir la section des résultats pour plus de détails sur l’utilisation des images de perles pour l’étalonnage des canaux.

6. Acquisition d’images : FPALM multicolore

  1. Il est important d’imager les cellules qui ont été transfectées avec une seule de chacune des constructions, ainsi que d’enregistrer des images des cellules avec toutes les constructions. Ces données aideront à établir les histogrammes alpha de chacune des sondes utilisées, et sont nécessaires à l’interprétation des données multicolores.
  2. Trouvez des cellules exprimant des sondes photocommutables, le cas échéant. Éliminez tout éclairage de pièce. Projetez la lampe à mercure, via la monture à bascule (FM), sur l’échantillon (contenant les cellules transfectées). Remplacez le cube du filtre de la tourelle par un cube contenant la combinaison miroir/filtre dichroïque appropriée pour permettre l’excitation de l’état préphotocommuté de l’étiquette. Par exemple, pour l’imagerie de Dendra2 préphotocommutés, ou de sondes avec une émission verte précommutée, un choix pour DM4 est un dichroïque qui réfléchit la lumière bleue (<488 nm) et pour F5 est un filtre qui laisse passer la lumière de ~500-570 nm, tout en bloquant la lumière en dehors de cette plage.
  3. À l’aide de l’oculaire, recherchez les cellules qui expriment la sonde préphotoswtichée. Par exemple, les cellules exprimant Dendra2 apparaîtront en vert. Notez que toutes les sondes ne sont pas photocommutables et, en fonction de leurs spectres d’émission précommutés, celles qui le sont peuvent nécessiter des combinaisons de DM4/F5 différentes de celles énumérées ici.
  4. Une fois qu’une pile est choisie, déplacez le FM vers le bas pour permettre aux lasers de passer dans le microscope (bloquez la lumière au mercure du chemin). Changez la tourelle du filtre pour celle contenant le dichroïque approprié pour l’imagerie (dans ce cas, DM2 doit refléter à la fois le laser de lecture et le laser d’activation, tout en transmettant des longueurs d’onde plus longues, et F1 doit transmettre des longueurs d’onde au rouge du laser et idéalement présenter une suppression élevée à la longueur d’onde du laser).
  5. Si les cellules n’expriment pas de sonde photocommutable, recherchez les cellules en projetant l’image sur la caméra et en utilisant le laser de lecture pour éclairer l’échantillon. Des molécules uniques seront probablement visibles (voir figure 3) dans de nombreuses cellules.
  6. Pour distinguer les cellules transfectées de la fluorescence de fond (qui peuvent encore apparaître sous forme de molécules clignotantes individuellement), et pour confirmer que les molécules sont photoactivables, éclairez brièvement l’échantillon avec une faible puissance du laser d’activation (généralement de l’ordre des microwatts). Le nombre de molécules photoactivables visibles sous le faisceau de lecture doit augmenter considérablement et rester élevé pendant une courte période, même après que l’éclairage d’activation a été à nouveau bloqué. Notez que la luminosité des différentes sondes peut varier considérablement en termes de luminosité, d’efficacité de photoconversion et de puissance laser requise pour l’activation24-27.
  7. Préparez le logiciel de la caméra pour une acquisition en série cinétique en réglant le gain EM sur 200 et en choisissant le nombre d’images souhaité (généralement 5 000 à 10 000) et le temps d’exposition (généralement 10 à 30 ms est approprié). Bien que le gain EM puisse être réglé au-dessus de 200, au-delà d’un certain point, l’augmentation du gain EM peut augmenter le bruit.
  8. Bloquez le faisceau d’activation. Débloquez le faisceau de lecture et projetez l’image de la cellule éclairée sur la caméra.
  9. Vérifiez que la cellule est transfectée (étape 6.6). Pendant que vous visualisez la cellule, ajustez la mise au point jusqu’à ce que le plan focal souhaité soit visible et que les molécules soient nettes.
  10. Pour choisir un plan focal qui prend des images près de la membrane cellulaire inférieure, décalez la mise au point vers le bas jusqu’à ce que les molécules individuelles ne soient plus visibles. Ensuite, déplacez progressivement le foyer vers le haut jusqu’à ce que les molécules deviennent d’abord visibles.
  11. Pour obtenir une image près de la membrane cellulaire supérieure, continuez à décaler la mise au point vers le haut de la quantité souhaitée, en notant la distance à l’aide du bouton de mise au point du microscope ou de la mise au point automatique. Le choix d’une zone focale entre ces deux limites entraînera l’imagerie d’une région située au milieu de la cellule.
  12. Débloquez le faisceau d’activation et éclairez l’échantillon avec une faible intensité (utilisez les filtres ND2 pour atténuer le faisceau à une intensité très faible, environ <1 W/cm2 sur l’échantillon).
  13. Lancez l’acquisition des données. Une forte densité de molécules actives est souhaitée ; Cependant, il est essentiel pour les étapes d’analyse que ces molécules ne se chevauchent pas dans l’espace.
  14. Tenter de maintenir une densité de molécules photoactivables visibles de ~0,1-1 μm-2 en ajustant ND2. Typiquement, pour une région d’image de ~10-20 μm de diamètre, il y aura ~10-100 molécules visibles à la fois (voir les figures 3 et 4 pour référence). Au fur et à mesure que le nombre de molécules inactives restantes diminue au cours de l’acquisition, la puissance du laser d’activation peut devoir augmenter progressivement pour maintenir la densité.
  15. Si l’imagerie TIRF est souhaitée*, M5 et L1 doivent tous deux être montés sur une seule platine de translation (TS, Figure 1) pour être déplacés latéralement (c’est-à-dire dans une direction perpendiculaire au laser juste derrière l’entrée du microscope). Au fur et à mesure que M5 et L1 sont traduits, les lasers sortant de l’objectif vers le haut à travers l’échantillon basculent progressivement d’un côté (ATTENTION : risque pour la sécurité laser).
  16. Lorsque l’angle des lasers atteint 90° par rapport à la verticale, le laser émergent lui-même disparaîtra, le laser de lecture entrant sera réfléchi par le retour, émergeant comme un faisceau sortant de l’ouverture arrière de l’objectif, anti-parallèle au faisceau entrant et déplacé sur le côté.
  17. Simultanément, la fluorescence de fond deviendra presque entièrement atténuée et l’épaisseur de la région de l’échantillon contenant des molécules uniques discernables et focalisées sera considérablement réduite.
    *TIRF permettra d’imager une section mince de l’échantillon qui se trouve à ~100-500 nm au-dessus de la lamelle. L’imagerie de plans focaux plus éloignés dans l’échantillon est facilement réalisée à l’aide d’un éclairage à grand champ (section 3), mais ne convient pas pour TIRF.
  18. Une fois l’acquisition terminée, fermez immédiatement l’obturateur du microscope et bloquez les deux faisceaux. Désactivez le gain EM, réglez la caméra pour qu’elle enregistre une image et réglez la région de lecture de la caméra sur sa taille maximale.
  19. Bloquez un canal en plaçant une carte sur F3 ou F4. À l’aide d’un filtre passe-long (>580 nm) monté sur la lampe du microscope, éclairez l’échantillon et projetez cette image sur la caméra. Enregistrez un instantané de la cellule.
  20. FACULTATIF : Avec un canal toujours bloqué, ouvrez l’ouverture de sorte qu’une grande partie de l’échantillon soit visible par éclairage en lumière transmise. Enregistrez un instantané. Ces images en lumière transmise sont très utiles pour visualiser le contexte des images FPALM correspondantes.
  21. Imagerie de cellules vivantes. Pour imager des cellules vivantes, transfectez les cellules selon les étapes 1.1 à 1.3, mais ne fixez pas ces échantillons. Au lieu de cela, alignez la configuration comme décrit ci-dessus dans son intégralité, mais avant d’imager les échantillons, retirez-les de 37 °C et 5 % de CO2, lavez-les 3 fois dans du PBS et immergez-les dans un support d’imagerie (par exemple PBS avec 20 mM de glucose). L’enlèvement des milieux de culture et le lavage réduiront le bruit de fond associé à la plupart des milieux cellulaires.
  22. Les échantillons peuvent être imagés à RT si nécessaire, comme le sont les cellules fixes, ou à 37 °C et 5 % de CO2 à l’aide d’une platine d’incubation montée sur la platine du microscope. Un seul échantillon de cellules NIH 3T3 ne doit pas être immergé dans un support d’imagerie pendant plus d’environ 1 heure. Il peut être utile de surveiller comment les cellules réagissent à l’immersion dans un milieu d’imagerie avant de se préparer à des expériences de ce type, afin d’optimiser le temps d’immersion et potentiellement la composition du milieu d’imagerie pour réduire la perturbation des cellules.

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Résultats

L'hémagglutinine (HA) de la grippe forme des agrégats de l'ordre de dizaines de nanomètres à quelques micromètres, et ces agrégats colocalisent de manière variable avec l'actine (Figure 5). Ces distributions spatiales confirment des images à plus grande échelle de ces deux protéines28, ainsi que la dépendance des distributions spatiales de l'HA vis-à-vis de l'actine19. Des images multicolores obtenues par FPALM peuvent être utilisées davantage pour décrire la densité, la surface et ...

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Discussion

L’imagerie super-résolution basée sur la localisation offre de nombreuses capacités puissantes pour l’imagerie biologique. Le passage de composants optiques individuels placés sur la table à un microscope fonctionnel à super-résolution capable d’imager simultanément plusieurs espèces fluorescentes dans un échantillon biologique présente un certain nombre de défis. Certains aspects de l’alignement sont plus critiques que d’autres ; Nous nous efforçons ci-dessous de fournir des conseils aux utilisateurs potentiels confront...

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Déclarations de divulgation

S.T.H. et M.J.M. détiennent des brevets en microscopie à super-résolution. S.T.H. siège au conseil consultatif scientifique de Vutara, Inc.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Philip Andresen, Matthew Parent et Sean Carter pour la programmation informatique, l’assistance technique et les conversations utiles, ainsi que Pat Byard pour l’aide administrative. Ce travail a été financé par le NIH Career Award K25-AI65459, le NIH R15 GM094713, le NSF MRI CHE-0722759, le Maine Technology Institute MTAF 1106 et 2061 et le Maine Economic Improvement Fund.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chambres LabTek IINunc
Perles fluorescentesInvitrogenF-8801Perles pour étalonnage Perles
TetraspeckInvitrogenT-7279Quatre perles de couleur pour l’étalonnage
Huile d’immersion d’objectifZeiss518FHuile d’immersion pour objectif à grande ouverture numérique (en fonction du choix de l’objectif)
Eau HPLCFisher ScientificW5-4
MediaATCC30-2003Or Cellgro 10-090
AntibiotiquesGIBCO15070-063
sérumThermo ScientificSH30087.03
LipofectamineInvitrogen52887
Optimem IGIBCO11058-021
TrypsineMPBiomedicals
paraformaldéhydeFisher ScientificAA433689MATTENTION : Toxique
1689149

Références

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