Article de méthode

Utilisation d’un système de suivi 3D automatisé pour enregistrer les individus et les bancs de poissons-zèbres adultes

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DOI :

10.3791/50681

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5 décembre 2013

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1R&D, xyZfish

Dans cet article

Résumé

L’utilisation d’un système vidéo automatique 3D capable de suivre des individus et des groupes de poissons-zèbres est décrite. À titre d’exemple d’application, nous explorons les effets de l’antagoniste du récepteur NMDA MK-801 sur des bancs de poissons-zèbres.

Résumé

Comme beaucoup d’animaux aquatiques, le poisson-zèbre (Danio rerio) se déplace dans un espace 3D. Il est donc préférable d’utiliser un système d’enregistrement 3D pour étudier son comportement. Le système de suivi vidéo automatique présenté accomplit cela en utilisant un système de miroir et une procédure de calibrage qui corrige l’erreur considérable introduite par le passage de la lumière de l’eau à l’air. Avec ce système, il est possible d’enregistrer à la fois des poissons zèbres simples et des groupes de poissons-zèbres adultes. Avant utilisation, le système doit être calibré. Le système se compose de trois modules : l’enregistrement, la reconstruction de chemin et le traitement des données. Les protocoles étape par étape pour l’étalonnage et l’utilisation des trois modules sont présentés. Selon la configuration expérimentale, le système peut être utilisé pour tester la néophobie, l’aversion blanche, la cohésion sociale, les déficiences motrices, l’exploration de nouveaux objets, etc. Il est particulièrement prometteur en tant qu’outil de première étape pour étudier les effets des médicaments ou des mutations sur les modèles comportementaux de base. Le système fournit des informations sur la distribution verticale et horizontale du poisson-zèbre, sur les composantes xyz des paramètres cinématiques (tels que la locomotion, la vitesse, l’accélération et l’angle de braquage) et il fournit les données nécessaires pour calculer les paramètres de cohésion sociale lors de l’essai des bancs.

Introduction

Le poisson-zèbre est devenu un modèle important pour la recherche biologique et pharmacologique1-3. Le suivi des mouvements et de la distribution spatiale des poissons-zèbres et des bancs de poissons-zèbres est inestimable. Les études plus anciennes appliquent une quantification manuelle basée sur des images enregistrées4. Aujourd’hui, les systèmes de suivi vidéo automatique 2D sont couramment utilisés5. Cependant, comme le poisson-zèbre et de nombreux autres animaux aquatiques et non aquatiques se déplacent dans un espace tridimensionnel, l’intérêt pour les systèmes 3D ne cesse de croître6. Le système 3D décrit a été publié pour la première fois en 20077. Pour plus de détails techniques et des comparaisons avec d’autres systèmes, voir8. L’avantage fondamental de ce système par rapport à d’autres systèmes est qu’il acquiert deux (éventuellement trois) vues synchrones et indépendantes à l’aide d’un système de mise en miroir et qu’il utilise un protocole d’étalonnage en deux étapes. Dans un premier temps, la géométrie 3D du système stéréo (formée par la caméra et les miroirs) est calibrée. Dans la deuxième étape, les erreurs non linéaires introduites par la réfraction de la lumière sont corrigées. Lors de l’étude des animaux aquatiques, l’impact de la réfraction de la lumière peut être considérable lorsqu’il n’est pas corrigé. D’autres systèmes publiés jusqu’à présent (même des développements plus récents9) omettent la procédure d’étalonnage en deux étapes. Pour des détails techniques sur l’identification d’objets, l’occlusion avec suivi multi-objets, le bruit de jigging, etc. Le lecteur est prié de se reporter aux publications originales8,9. Le système a été validé pour l’étude des réponses comportementales analytiques10,11, des bancs8,11,12 et, dans une étude préliminaire, pour le comportement antagoniste chez le poisson-zèbre13. Il a également été testé pour d’autres espèces de poissons (poisson rouge8, porte-épée, barbe tigrée) et pour des souris9.

Dans ce qui suit, les protocoles d’étalonnage et d’utilisation du système sont décrits et les résultats d’une expérience testant les effets de l’antagoniste non compétitif du récepteur NMDA MK-801 sur le poisson-zèbre en bancs sont présentés à titre d’exemple représentatif pour démontrer le type de données qui peuvent être obtenues avec le système.

Tant dans le milieu naturel que dans les aquariums, le poisson-zèbre nage généralement en bancs14. Les préférences en matière de bancs semblent dépendre de plusieurs facteurs, tels que l’élevage, le sexe et la disponibilité de la nourriture14,15. Il est intéressant de noter que la distance entre les poissons-zèbres dans un banc devient plus petite lorsque des signaux de danger potentiel sont présents, tels que les phéromones d’alarme16 ou la nouveauté11. Le paradigme du haut-fond est donc également utilisé pour tester les médicaments anxiolytiques17. Les hiérarchies de dominance18 et l’apprentissage social19 sont des aspects fascinants du comportement du poisson zèbre. En raison de son caractère socio-comportemental très développé, le poisson-zèbre est également devenu un intérêt pour la recherche sur l’autisme20,21.

MK-801 a été signalé pour modifier le comportement social chez le poisson zèbre5,22,23, ce qui rappelle ses effets sur les mammifères24. Cependant, MK-801 a également de nombreux autres effets sur d’autres comportements (tels que le comportement de nage, l’évitement inhibiteur et la préférencede place 25-27). Il est donc crucial, dans les expériences initiales, d’obtenir autant d’informations que possible à partir d’observations de base. Cela servira de base à la conception d’expériences plus ciblées.

Relevé de l’appareil d’enregistrement et du logiciel

Dans sa configuration actuelle, le conteneur d’observation (25 cm x 25 cm x 18 cm, L x l x H), contenant le poisson zèbre, est positionné dans la chambre d’observation (91 cm x 46 cm x 56 cm, L x l x H). La chambre contient également une caméra, un miroir suspendu à un angle d’environ >45° au-dessus du conteneur et des barres lumineuses LED. La figure 1 montre un schéma simplifié. La caméra enregistre à la fois la vue de face et la vue de dessus (miroir) pour construire les trajectoires 3D du poisson-zèbre en déterminant ses coordonnées x, y et z. À des fins d’orientation, les vecteurs de coordonnées sont présentés dans le coin avant gauche du conteneur d’observation (position par rapport à la caméra), ce qui correspond aux vecteurs présentés sur les vues 3D (par exemple Figure 15) générées par le module de reconstruction de trajectoire (voir plus bas). Le taux d’échantillonnage dépend de l’appareil photo et de l’ordinateur. Dans nos expériences, il est d’environ 40 images/s (fps). La résolution spatiale des images enregistrées est de 640 x 480 pixels (cette configuration a été choisie comme équilibre optimal entre la résolution spatiale et temporelle). Windows XP ou une version ultérieure est requis.

Avant le premier enregistrement, le système doit être calibré pour déterminer l’emplacement des parois du récipient et de la surface de l’eau, pour déterminer le facteur d’échelle des images enregistrées et pour s’ajuster à l’erreur considérable générée par la réfraction de la lumière lors du passage de l’eau à l’air. En principe, l’étalonnage ne doit être effectué que lors de l’installation initiale et après le déplacement ou le remplacement de pièces de l’installation, telles que l’appareil photo ou le miroir. Néanmoins, il est recommandé de vérifier de temps en temps si l’étalonnage est toujours correct et de le recalibrer si nécessaire.

Le logiciel se compose de trois modules. Le module d’enregistrement enregistre les trames (deux exemples de trames sont illustrés à la figure 2). Le module de trajectoire reconstruit les trajectoires de chaque poisson-zèbre. Le module de traitement des données calcule une gamme de paramètres cinématiques et spatiaux standard. À des fins d’analyse plus approfondie, les données peuvent être importées dans un tableur ou un logiciel statistique.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément au Guide du National Institute of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Étalonnage

  1. Placez un récipient d’observation vide dans la chambre de manière à ce que les pieds du récipient soient insérés dans les trous prévus pour un alignement correct. Orientez le récipient de manière à ce que les parois semi-transparentes (le but de leur structure est de réduire les reflets) soient orientées vers le côté éloigné et à droite de la caméra.
  2. Ouvrez le module d'enregistrement, sélectionnez « Contrôle de l'appareil photo » et ajustez le « gain » et l'« obturateur » (après les avoir désélectionnés, cases à droite) pour que l'image soit claire. Placez le rétroviseur latéral à un angle d’environ 45° sur le côté gauche du conteneur d’observation de sorte que la vue latérale du conteneur sur l’écran de l’ordinateur soit entièrement visible. De plus, le miroir doit être aligné de telle sorte que la paroi avant du récipient soit visible sur une seule ligne (comme l’indique la flèche de la figure 3).
  3. Connectez le panneau d'étalonnage au port parallèle (de la carte de l'appareil photo) et appuyez sur le bouton « Panneau LED marche/arrêt » dans le module d'enregistrement pour allumer les LED.
  4. Placez le panneau d’étalonnage dans le conteneur d’observation vide de sorte que les 5 LED puissent être vues de face, de haut et de côté sur l’écran de l’ordinateur comme sur la figure 3 (parfois le câble bloque la vue, dans ce cas déplacez-la). Assurez-vous également que les LED se trouvent en dessous des repères pour le niveau d’eau (ces repères sont gravés dans les récipients d’observation à 135 mm du fond intérieur du réservoir) et que la position du panneau est stable (afin qu’il ne bouge pas lors du remplissage du récipient avec de l’eau à l’étape 1.9).
  5. Éteignez les lumières de la chambre d’observation et fermez le rideau (attention à ne pas toucher le câble du panneau de calibrage ou le rétroviseur latéral).
  6. Appuyez sur le bouton « Emplacement des données » et créez ou sélectionnez un dossier pour les fichiers d'étalonnage. Ces fichiers seront utilisés pour tous les enregistrements (ou expériences) ultérieurs jusqu’à ce qu’un réétalonnage devienne nécessaire. Ainsi, idéalement, faites en sorte que les données d’étalonnage fassent partie du nom du dossier d’étalonnage.
  7. Ajustez les trois cases rouges sur l’écran de l’ordinateur de sorte que chacune d’entre elles n’englobe que les 5 voyants de l’une des trois vues (Figure 4, panneau de gauche). Utilisez à nouveau 'gain' et 'shutter' sous 'Camera control' pour obtenir des images claires des LED, sans images d'autres points lumineux (qui sont dus au bruit, aux reflets ou aux gouttelettes d'eau sur la paroi du récipient), comme dans la figure 4, panneau de droite.
  8. Éteignez les LED et appuyez sur le bouton « Collecter l'étalonnage sans eau ». Sur l'écran de l'ordinateur, 5 étiquettes ('x') numérotées de 0 à 4 apparaissent. Allumez le panneau. L’emplacement des balises doit coïncider avec les LED. Si ce n’est pas le cas, répétez l’étape 1.7 (voir la figure 4 pour une illustration de l’attribution incorrecte des balises sur le panneau de gauche et de l’affectation correcte des balises sur le panneau de droite).
  9. Remplissez la chambre d’observation avec de l’eau jusqu’au repère. Les LED doivent être sous le niveau de l’eau (comme expliqué à l’étape 1.4). S’ils sont au-dessus du niveau de l’eau, videz le récipient et revenez à l’étape 1.4. Lorsque vous remplissez l’eau dans le récipient, veillez à ce que le panneau LED ne bouge pas. Cependant, si cela se produit, videz le récipient et revenez à l’étape 1.4. Ceci est important, car l’étalonnage est basé sur la détermination des différences entre les positions des LED enregistrées sans et avec de l’eau.
  10. Appuyez sur le bouton « Collecter l'étalonnage avec l'eau ». Encore une fois, comme à l’étape 1.8, cinq balises apparaîtront à l’écran, qui dans la plupart des cas seront légèrement décalées par rapport à celles obtenues lors de l’étalonnage sans eau. Dans cette étape, le gain et l’obturateur peuvent devoir être réajustés. Répétez l’opération jusqu’à ce que les étiquettes soient correctement placées sur les voyants (comme sur la Figure 4, panneau de droite).
  11. Allumez les lumières dans la chambre d'observation, ajustez le gain et l'obturateur (sous « Contrôle de la caméra ») afin que l'image ne soit pas trop lumineuse.
  12. La figure 5 montre les six points qui doivent être sélectionnés séquentiellement en cliquant avec le bouton droit de la souris. Assurez-vous que les points se trouvent sur les lignes désignées : 1. vue de face niveau d’eau, 2. crête supérieure gauche du conteneur en vue de dessus, 3. ligne verticale qui délimite la paroi avant en vue de côté. La longueur de la ligne n’est pas essentielle. Entre les positions de clic 1 et 2, 3 et 4, et 5 et 6, des lignes droites apparaîtront (les chiffres n’apparaîtront pas réellement à l’écran). Appuyez sur « Collecter les informations du conteneur » pour enregistrer ces informations.
  13. Retirez le rétroviseur latéral et le panneau LED et remplissez l’eau exactement jusqu’à la marque. Sélectionnez « Démarrer l'enregistrement ». Une nouvelle fenêtre demande la durée en minutes. Pour l’objectif actuel, 1 minute suffit. Appuyez sur OK.
  14. Après l'enregistrement, quittez le module d'enregistrement, ouvrez le module de trajectoire, sélectionnez le dossier d'étalonnage (effectué à l'étape 1.6) avec 'Emplacement des données' (le chargement du fichier peut prendre un certain temps). Ce dossier contient les fichiers d’étalonnage et les fichiers des données qui viennent d’être enregistrées (étape 1.13).
  15. Appuyez sur le bouton « Acquérir l'arrière-plan ». Une nouvelle fenêtre s’ouvre, sans rien changer, appuyez sur OK. Attendez qu’une image (à l’envers) du réservoir d’observation apparaisse sur le moniteur. Appuyez ensuite sur 'Charger l'arrière-plan'. L’image d’arrière-plan sera corrigée. Une nouvelle fenêtre s’ouvre qui demande d’ajuster les boîtes. Appuyez simplement sur OK.
  16. Appuyez séquentiellement sur le troisième au septième bouton : « Charger la correspondance sans eau », « Calibrer la ou les caméras virtuelles », « Charger la correspondance réfractée », « Collecter les géométries des conteneurs », « Récupérer les informations sur les conteneurs d'animaux ». Cette dernière étape peut prendre plusieurs minutes. Il est terminé lorsque trois lignes blanches apparaissent à l’écran (qui sont les lignes qui ont été tracées à l’étape 1.12). Appuyez sur le bouton « Enregistrer les informations sur le conteneur ».
  17. Appuyez sur le bouton « Collecter le volume ». Maintenant, comme le montre la figure 6, marquez consécutivement les 8 coins du plan d’eau, qui est un cuboïde. Pour chaque point, cliquez d’abord dessus dans la vue de face, puis dans la vue de dessus.
  18. Sélectionnez « 3D » dans le coin gauche de la fenêtre. Maintenant, une nouvelle fenêtre s’ouvre montrant le contour d’une boîte avec un fond blanc (comme sur la figure 15, mais sans la trajectoire). Cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner les rotations et les translations de la vue de la boîte. Si aucune image n'apparaît ou si l'image n'est pas celle d'un cuboïde (c'est-à-dire qu'à l'étape 1.17, les coins ont été cliqués avec le bouton droit de la souris dans le mauvais ordre), procédez comme suit : en quittant, mais sans fermer le module de trajectoire, en utilisant Windows, allez dans le dossier d'étalonnage (effectué à l'étape 1.6), sélectionnez le sous-dossier 'Données du conteneur animal' et supprimez le fichier nommé TankVertices et répétez l'étape 1.17.
  19. Félicitations, le calibrage est terminé. Idéalement, un test avec un poisson factice devrait être effectué pour vérifier si tout fonctionne bien. La bonne nouvelle, c’est que le recalibrage ne doit être effectué que si les positions du miroir ou de l’appareil photo ont été (même légèrement) modifiées ou s’il y a des problèmes de suivi (voir section 3).

2. Enregistrement

  1. Placez le récipient d’observation rempli d’eau jusqu’aux marques dans la chambre d’observation de manière à ce que les pieds du récipient soient insérés dans les trous prévus pour un alignement correct. Orientez le conteneur de manière à ce que les parois semi-transparentes (ou blanches dans notre exemple - voir Discussion) soient orientées vers l’autre côté et vers la droite telles que vues de la caméra.
  2. Allumez les lumières dans le compartiment, mettez le poisson (expérimental ou factice) dans le récipient et fermez les rideaux. Remarque : le système peut enregistrer plusieurs poissons (voir la section Résultats représentatifs) ; Cependant, il est conseillé d’acquérir une certaine expérience du système en enregistrant d’abord un seul poisson.
  3. Ouvrez le module d’enregistrement. Sur l’écran apparaît l’image de la vue de face et de dessus (miroir) du conteneur. L’image peut ne pas être idéale (par exemple, surexposée, par exemple la figure 7) et doit être ajustée (les trois étapes suivantes) pour obtenir un bon contraste entre le poisson et l’arrière-plan (par exemple, la figure 8).
  4. Sélectionnez « Contrôle de l'appareil photo » et, dans la fenêtre « Paramètres généraux » qui s'ouvre, ajustez « Obturateur » et « Gain » (après avoir désélectionné les cases correspondantes à droite, voir Figure 9) de manière à ce que l'image ne soit pas surexposée et qu'il y ait un bon contraste entre le poisson et l'arrière-plan.
  5. Sur le côté gauche de la fenêtre « Contrôle de l'appareil photo », sélectionnez « Balance des blancs/Couleur » et dans la nouvelle fenêtre, décochez la case « Auto » et ajustez les valeurs Rouge et Bleu (voir Figure 10) pour obtenir le meilleur contraste de couleurs en vue de face et de dessus.
  6. Il peut être nécessaire de basculer plusieurs fois entre le réglage de la couleur (sous « Balance des blancs/Couleur ») et le réglage du gain et de l'obturateur (sous « Paramètres généraux ») pour obtenir le meilleur réglage de l'appareil photo. Sachez que même si vous deviez être satisfait sans aucun réglage, il est crucial de désélectionner les cases 'Obturateur', 'Gain' et 'Auto' (comme expliqué aux étapes 2.4 et 2.5), sinon l'arrière-plan fluctuera au cours de l'enregistrement, ce qui rendra impossible l'extraction des trajectoires. Ne modifiez aucun des autres paramètres. Lorsque vous avez terminé, fermez la fenêtre « Contrôle de la caméra ».
  7. Dans le menu principal du module d'enregistrement, sélectionnez « Emplacement des données » pour créer ou ouvrir un dossier précédemment créé. Notez que chaque enregistrement (par exemple, poisson ou banc) a son propre dossier, qui devrait idéalement être un sous-dossier du dossier de l’expérience.
  8. Appuyez sur « Démarrer l'enregistrement ». Une fenêtre s’ouvre qui demande la durée de l’enregistrement en minutes (entrez uniquement des nombres entiers). Appuyez sur « OK », ce qui démarre la session d'enregistrement proprement dite.
  9. Une fois l’enregistrement terminé, quittez le programme. Avant d’enregistrer le prochain poisson, il est recommandé de redémarrer l’ordinateur. Utilisez l’option Redémarrer dans Windows pour conserver les paramètres de l’appareil photo (à partir des étapes 2.4 et 2.5). La nécessité de redémarrer l’ordinateur entre les enregistrements est due à certains problèmes avec la carte de l’appareil photo.
  10. Avant d'accéder au module de trajectoire pour la reconstruction de la trajectoire, copiez et collez les sous-dossiers « Données du conteneur animal » et « Données de correspondance » du dossier d'étalonnage (effectué dans la première section de ce protocole) dans chaque dossier créé lors de l'enregistrement. Dans ces derniers dossiers, deux autres sous-dossiers sont présents, à savoir 'Données brutes' et 'Horodatage'. Le premier contient toutes les images enregistrées au format JPEG ; Ce dernier contient des informations sur le nombre total d’images et les intervalles entre les images (en ms).

3. Reconstruction du chemin

  1. Ouvrez le module de trajectoire, appuyez sur « Emplacement des données » pour sélectionner le dossier qui a été créé avec le module d'enregistrement, puis appuyez sur le bouton « Configuration du système » pour ouvrir les « Paramètres » (voir Figure 11).
  2. Sélectionnez les seuils de couleur de la vue supérieure et inférieure. Une bonne valeur de départ est de 1 000. Si cette valeur est faible, le logiciel est plus susceptible d’enregistrer du bruit. Cependant, si la valeur est trop élevée, le poisson peut être en dessous de la plage de détection. Plus tard (étapes 3.11 et 3.12), il peut s’avérer nécessaire de réajuster les seuils de couleur. Notez également que les seuils de couleur supérieur et inférieur ne doivent pas être identiques.
  3. Sélectionnez Seuils de taille de vue supérieure et inférieure. Une bonne valeur de départ pour un poisson-zèbre de taille moyenne est de 10, pour un très grand de 20 et pour un très petit de 5. Plus le seuil de taille est élevé, moins il est susceptible de capter du bruit. Cependant, s’il est trop élevé, le logiciel peut ne pas être en mesure de détecter le poisson non plus. Encore une fois, aux étapes 3.11 et 3.12, il peut s’avérer nécessaire de réajuster les seuils de taille. Notez également que les seuils de taille supérieure et inférieure ne doivent pas être identiques.
  4. Pour le 'Seuil de taille supérieur', une valeur de 3 000 est généralement bonne et pour 'Longueur spécifique', laissez-la à 220 (déjà prédéfinie). Le « nombre de poissons » fait référence au nombre de poissons dans le bassin d'observation. Le « nombre maximum de points » fait référence au nombre total d'images. Souvenez-vous (ou notez) ce nombre ou un nombre légèrement inférieur (par exemple, 45 703 pourrait être mémorisé comme 45 000). Appuyez sur OK.
  5. Appuyez successivement sur les boutons 'Charger la correspondance sans eau', 'Calibrer/les caméra(s) virtuelle(s)' et 'Charger les informations sur le conteneur d'animaux'. Un message d'erreur sera généré si les sous-dossiers d'étalonnage 'Données du conteneur animal' et 'Données correspondantes' n'ont pas été copiés dans le dossier expérimental actuel (voir étape 2.10). Si c’est le cas, copiez et collez ces sous-dossiers maintenant et appuyez à nouveau sur les boutons.
  6. Appuyez sur le bouton 'Acquérir l'arrière-plan'. Une nouvelle fenêtre vous demandera de remplir 'from' et 'to' avec les valeurs par défaut 0 et 100, respectivement. Remplacez le nombre maximal de 100 images (dans l’exemple donné à l’étape 3.4, ce nombre peut être simplifié en 45 000). Appuyez sur OK.
  7. Attendez qu’une image (déformée) apparaisse. Appuyez ensuite sur 'Charger l'arrière-plan' pour établir l'image d'arrière-plan correcte. Le poisson ne doit pas être visible sur cette image d’arrière-plan. Si le poisson est visible, essayez d’obtenir un meilleur arrière-plan à partir d’autres segments d’enregistrement (par exemple, essayez 0-1 000, 1 000-2 000, etc. à l’étape 3.6).
  8. Si le poisson n'a pas bougé du tout pendant la session d'enregistrement, la seule façon d'acquérir un arrière-plan est de retirer le poisson et de faire un nouvel enregistrement court sans le poisson, mais avec les mêmes paramètres « Commandes de la caméra » (c'est important). Récupérez l'arrière-plan et copiez le sous-dossier 'Données d'arrière-plan' dans le dossier expérimental actuel. Appuyez maintenant sur 'Charger l'arrière-plan', n'appuyez pas sur 'Acquérir l'arrière-plan'. Notez que l’ouverture et la fermeture du rideau entraînent souvent un arrière-plan quelque peu modifié, il peut donc devenir nécessaire d’ajuster les seuils aux étapes 3.2 et 3.3 pour réduire le bruit. L’étape 3.11 montre comment vérifier la présence de bruit.
  9. Après avoir chargé l’arrière-plan, ajustez les trois cases rouges (à l’aide de la souris) comme illustré à la figure 12. Les cases marquent les zones dans lesquelles le logiciel recherche le poisson. Fermez la case de gauche (c’est-à-dire réduisez-la à une ligne ou à un point) car la vue latérale n’est utilisée que pour l’étalonnage (comme expliqué à l’étape 1.7).
  10. Appuyez sur le bouton « Commencer à générer des trajectoires ». Une fenêtre s’ouvre et vous demande le numéro de l’image de départ. Optez pour le « 0 » par défaut. Après avoir appuyé sur « OK », la fenêtre « Affectations de balises » s'ouvre (voir Figure 13). Appuyez sur « Pas en avant » jusqu'à ce que la balise (« X0 ») apparaisse à l'écran. Si l'étiquette n'est pas placée sur l'image du poisson, appuyez sur « Non » jusqu'à ce qu'elle soit correctement placée. Appuyez ensuite sur « Go ». S'il n'est jamais attribué correctement (ou pas du tout), appuyez quand même sur « Go » et recherchez le problème (étape suivante).
  11. La reconstruction du chemin commence. Idéalement, l’étiquette devrait toujours (ou du moins la plupart du temps) être placée sur l’image du poisson. S'il est souvent mal placé, ouvrez la fenêtre 'Info' (deuxième choix au-dessus de l'écran vidéo). La figure 14A montre le cas idéal, où l’on ne voit que les contours du poisson. La figure 14B montre un cas de bruit excessif qui empêche l’attribution correcte des étiquettes. Si vous voyez une image claire du poisson sans bruit (comme dans la figure 14A), mais que l’étiquette ne sera jamais ou rarement attribuée correctement, la raison la plus probable est que l’étalonnage est désactivé. Recalibrer et refaire la reconstruction du chemin. Si, pendant l’étalonnage, le miroir et les caméras ne sont pas déplacés, les nouvelles données d’étalonnage peuvent être utilisées pour les enregistrements précédemment effectués.
  12. En cas de bruit excessif (comme sur la Figure 14B), appuyez sur « Stop » dans le menu principal et choisissez de nouveaux seuils de couleur et de taille (étapes 3.2 et 3.3). Vérifiez également si les cases rouges (étape 3.9) peuvent être un peu réduites (par exemple pour exclure le bruit généré par les mouvements de l’eau en haut). Notez que parfois le programme est 'bloqué' (si aucune balise n'a pu être allouée du tout) : dans ce cas, redémarrez le programme.
  13. Regardez la trajectoire sur l’écran 3D (troisième choix au-dessus de l’écran). Graphique 15. représente un exemple de trajectoire. En cliquant avec le bouton droit de la souris, sélectionnez entre la rotation et les translations de la configuration 3D.
  14. Lorsque la trajectoire est terminée, appuyez séquentiellement sur les boutons 'Enregistrer' (et non 'Stop', qui supprime la trajectoire !), 'Nettoyage de la trajectoire' et 'Lissage de la trajectoire'. Une nouvelle fenêtre s’ouvre avec les paramètres de filtre pour le lissage (Figure 16). Ne modifiez pas les valeurs par défaut avant d’avoir acquis plus d’expérience avec le système. Appuyez sur « OK ».
  15. À présent, il devrait être si important de choisir un bon réglage de l’appareil photo (avec un bon contraste entre le poisson et l’arrière-plan) avant l’enregistrement (voir les étapes 2.4-2.6). Passez au traitement des données.

4. Traitement des données

  1. Tout d’abord, jetez un coup d’œil au dossier qui a servi à enregistrer le poisson (figure 17). Il contient les sous-dossiers « Données du conteneur d'animaux » et « Données de correspondance » qui ont été copiés à partir du dossier d'étalonnage (étape 2.10), les sous-dossiers « Horodatageages » et « Données brutes » qui ont été créés lors de l'enregistrement du poisson et les sous-dossiers « Données d'arrière-plan » et « Trajectoires » qui ont été créés lors de la reconstruction du chemin.
  2. La figure 17 montre également que le sous-dossier « Trajectoires » contient trois fichiers. Le fichier point.smoothed est le fichier qui sera utilisé pour le traitement ultérieur des données. En cas d’enregistrement de plusieurs poissons (par exemple, une expérience de banc), un fichier point.smoothed distinct sera généré pour chaque poisson.
  3. La figure 18 montre la partie supérieure d’un exemple de fichier point.smoothed. La première ligne donne le nombre total d’échantillons ou d’images, la deuxième la durée de l’enregistrement (en minutes) et la troisième ligne les coordonnées (séquence : x, z, y) du centre du plan d’eau par rapport à la caméra. Celle-ci est suivie d’une ligne pour chaque image donnant les coordonnées x, y, z (en mm) du poisson et la durée de cet échantillon (en secondes).
  4. Il existe deux façons de traiter les données fournies dans les fichiers point.smoothed : utiliser le module de traitement des données ou utiliser d’autres logiciels, tels qu’Excel ou MATLAB, pour effectuer des calculs qui ne sont pas (encore) incorporés dans le module de traitement des données.
  5. Ouvrez le module de traitement des données, sélectionnez « Projet » dans la barre d'outils, puis dans le menu déroulant, sélectionnez « Nouveau », puis donnez un nom à l'expérience. Sélectionnez « Modifier le projet » dans la barre d'outils, sélectionnez « Ajouter au projet » dans le menu déroulant, puis « Nouveau groupe » et indiquez un nom pour le groupe (par exemple, « Contrôles »). Attention, à ce moment-là, les noms de projet et de groupe ne sont pas vraiment utilisés, mais les noms doivent être remplis. Les dossiers créés peuvent être utilisés pour stocker les fichiers de sortie (voir étape 4.10).
  6. Sélectionnez un groupe (par exemple « Commandes ») dans la fenêtre de droite (voir Figure 19). La barre d’outils changera. Sélectionnez « Modifier le groupe », puis « Ajouter au groupe » dans le menu déroulant, puis « Nouvelles mesures ». Cela ouvrira un navigateur. Ouvrez le dossier créé lors de l'enregistrement (étape 2.7), sélectionnez le sous-dossier 'trajectoires' puis le fichier-lissé point.smoothed. Dans l’exemple présenté à la figure 19, pour le groupe A, six fichiers ont été chargés, pour le groupe B quatre fichiers. (Notez que dans l’exemple illustré, les fichiers lissés ont les extensions 0 et 1, car dans cette expérience, deux poissons rouges ont été testés simultanément).
  7. Pour l'analyse, sélectionnez le fichier lissé de points dans la fenêtre de droite, sélectionnez « Traitement des données », sélectionnez « Points de terminaison uniques » dans le menu déroulant et, à titre d'exemple, sélectionnez « Gel de la durée » (Figure 20). Une fenêtre s’ouvre pour spécifier le gel en termes de seuil de vitesse et de seuil de durée. Dans l’exemple, le poisson passe 25,86 % du temps d’observation sur la congélation.
  8. Pour vous familiariser avec le programme, essayez d’autres exemples, tels que la distance de déplacement, la distribution de profondeur (qui vous permet de déterminer le nombre de niveaux de profondeur) et la fréquence de rafale.
  9. Il existe des calculs plus avancés, tels que l’analyse spectrale de la composante z de l’accélération, par exemple. Dans ce cas, sélectionnez 'Caractéristiques de la série temporelle', puis 'Analyse du domaine de fréquence TD', 'Analyse spectrale' et 'Spectre Z accele'. L’analyse de Fourier sera effectuée sur le paramètre indiqué (pour l’explication7). Toutes les options affichées dans le menu ne sont pas encore entièrement mises en œuvre. Par exemple, « Path tortuosity » n'a été ajouté qu'à titre expérimental.
  10. Lorsque vous sélectionnez l'option « Traitement par lots à l'aide du seuil par défaut », environ 200 points de terminaison seront calculés. Dans ce contexte, 'default' signifie que des délimiteurs ont été définis. Par exemple, à l’heure actuelle, la distribution de profondeur est calculée pour trois niveaux de profondeur, la distribution angulaire est calculée pour quatre sections (c’est-à-dire les quadrants), etc. Après avoir généré les paramètres, une nouvelle fenêtre s’ouvre qui demande l’emplacement et le nom du fichier à créer. Ceux-ci seront enregistrés au format CSV et pourront être importés dans d’autres logiciels, tels qu’Excel, pour un traitement ultérieur.
  11. Contrairement au module d’enregistrement et au module de trajectoire, le module de traitement des données est un module évolutif qui sera adapté aux besoins des chercheurs.

Résultats

Des zébres femelles âgées de six mois (Danio rerio) d'une souche sauvage non précisée (« à nageoires courtes ») ont été achetées chez Aquatica Tropicals, Inc. Au total, 120 zébres ont été utilisés. Ils ont été acclimatés aux conditions de laboratoire pendant environ 8 semaines dans des aquariums de 38 L avant le début des expériences. La température de l'eau était égale à la température ambiante (~23 °C). Régime lumineux : 14 h d'éclairage (6:00-20:00), 10 h d'obscurité. Les zébres étaient nourris trois fois par jour : à 8:00 des flocons Tetra tropical ; à 12:00 des larves de crevettes Artemia vivantes ; à 15:00 des flocons Tetra tropical. Les jours des expériences, les zébres n'étaient nourris qu'avec des flocons à 8:00. Immédiatement après le deuxième enregistrement, les zébres ont été euthanasiés avec du tricaine méthanesulfonate (MS-222) à 300 mg/L.

Pour le groupe témoin, 14 quadruplés (soit des groupes de quatre zebrafish) ont été utilisés (n = 14), et pour le groupe MK-801, 16 quadruplés (n = 16). Après une exposition de 1 heure à 10 µM de MK-801 (démarrée à 9h30) dans des récipients de 1 L, les quadruplés ont été transférés dans les récipients d'observation. L'enregistrement a commencé immédiatement (à 10h30) et a duré 20 minutes. Par la suite, les zebrafish ont été laissés dans les récipients pendant 3,5 heures. Pendant cette période, une aération a été assurée par un tube relié à une pompe à air. À 14h00, un second enregistrement de 20 minutes a été effectué. L'objectif des deux enregistrements était d'étudier les effets de l'habituation et/ou de la diminution des effets du médicament (la demi-vie du MK-801 chez le rat est d'environ 2 heures28). Nous avons analysé (1) les distances sociales moyennes (également appelées distances interindividuelles11,29) comme mesure de la cohésion sociale, (2) la répartition verticale sur dix niveaux de profondeur, (3) la répartition horizontale sur quatre zones radiales (voir Figure 24A, encart pour l'emplacement des zones) et sur les quadrants (voir Figure 24B, encart pour l'emplacement des quadrants), ainsi que (4) les trois composantes (x,y,z) de la distance parcourue. Les données ont été moyennées par banc. Après que les tests de Shapiro-Wilks ont montré que toutes les variables n'étaient pas normalement distribuées, des tests U de Mann-Whitney ont été appliqués pour toutes les variables afin de comparer les moyennes des groupes témoin et MK-801. Ces comparaisons ont été effectuées séparément pour les sessions du matin et de l'après-midi. Nous avons pris α = 0,05/4 = 0,0125, car quatre groupes (ou ensembles) de variables ont été utilisés (voir ci-dessus).

Figure 2A montre un cadre typique représentatif pour les zebrafish contrôles et Figure 2B montre un cadre typique représentatif pour les zebrafish traités au MK-801, tous deux enregistrés pendant la session du matin. On observe que les zebrafish contrôles se trouvaient près du fond, proches de la paroi avant (cest-à-dire le côté le plus proche de la caméra) et restaient regroupés étroitement (cest-à-dire la cohésion sociale était élevée). En revanche, les zebrafish traités au MK-801 se situaient près de la surface, ne présentaient aucune préférence dans le plan horizontal et nageaient à une distance notable les uns des autres (cest-à-dire la cohésion sociale était faible). Figure 21 montre des trajectoires représentatives. Les zebrafish contrôles avaient une nette tendance à rester du côté avant du récipient d’observation. De plus, ils demeuraient la plupart du temps près du fond. Les zebrafish traités au MK-801, en revanche, nageaient n’importe où dans le plan horizontal. Toutefois, ils présentaient une préférence marquée pour les niveaux de profondeur supérieurs à 10h30. À 14h00, leur répartition verticale devenait plus homogène.

L'analyse quantitative des données a confirmé notre description. Figure 22A montre que la distance sociale moyenne (à savoir la distance interindividuelle moyenne entre les quatre zebrafish des quadruplets) était chez les zebrafish traités au MK-801 plus de trois fois supérieure à celle des zebrafish témoins durant la matinée (à 10h30), avec U = 0 et p<0,00001. Après une habituation de 3,5 heures (à 14h00), la distance sociale chez les zebrafish témoins a augmenté, tandis qu'elle est restée plus ou moins inchangée chez les zebrafish traités au MK-801. Toutefois, elle est restée significativement différente entre les deux groupes (U = 19, p<0,0005). Figure 22B présente les courbes temporelles de la distance sociale pour les deux groupes expérimentaux, à 10h30 et à 14h00.

La répartition verticale était également très différente pour les deux groupes. Figure 23 montre que, tant le matin (10h30) qu’en après-midi (14h00), les zebrafish témoins passaient la majeure partie du temps aux deux ou trois niveaux de profondeur les plus bas (à savoir les niveaux les plus proches du fond du récipient d’observation). Les zebrafish traités au MK-801, en revanche, nageaient la plupart du temps près de la surface de l’eau à 10h30 (Figure 23A). Après une période d’acclimatation de 3,5 h, à 14h00, ils étaient répartis plus ou moins uniformément sur tous les niveaux de profondeur.

La distribution horizontale était également très différente pour les deux groupes expérimentaux. Sur la figure 24A, on observe que les zebrafish traités au MK-801 ont passé moins de temps dans la zone externe et plus de temps dans les zones médiane et centrale que les zebrafish témoins. Les différences entre les groupes concernant les quadrants étaient encore plus marquées (figure 24B). Les zebrafish témoins présentaient une préférence très nette pour les deux quadrants avant (1 et 4), c.-à-d. le côté du récipient le plus proche de la caméra. En revanche, les zebrafish traités au MK-801 étaient répartis plus ou moins uniformément dans les quatre quadrants.

En ce qui concerne les paramètres cinématiques, nous limitons ici la discussion à la distance parcourue (Figure 25). Les zebrafish traités au MK-801 se sont déplacés davantage que les zebrafish témoins. Fait intéressant, cette différence était particulièrement marquée pour la composante y de la distance parcourue, correspondant à la direction de la caméra (voir Figure 1). En effet, les zebrafish témoins sont restés la plupart du temps près de la paroi avant, dans les quadrants 1 et 4 (comme on peut le voir sur les Figures 24A et 24B). En revanche, les zebrafish traités au MK-801 ont effectué des allers-retours entre la moitié avant et la moitié arrière du récipient.

Ici, nous avons présenté uniquement un échantillon des méthodes possibles pour analyser les données fournies par l'expérience. À ce stade, nous nous abstentions d'attribuer une interprétation biologique spécifique aux résultats. Cependant, il convient de mentionner que le MK-801 a été trouvé responsable d'induire un retrait social30 et de réduire les comportements d'investigation sociale chez les rats31, et a été étudié comme modèle des symptômes négatifs de la schizophrénie30. Il a également provoqué une hyperactivité31, un comportement de rotation32, une altération sensorielle33 et une réduction de l'inhibition préimpulsionnelle34 chez les mammifères. Bien que nous n'ayons pas spécifiquement testé ces altérations, nos résultats semblent compatibles avec celles-ci. Des dispositifs expérimentaux plus spécifiques sont nécessaires pour déterminer si les effets décrits du MK-801 chez le poisson zèbre sont comparables à ceux observés chez les mammifères. Des analyses et expériences supplémentaires seraient également nécessaires pour établir si l'anxiété, les troubles respiratoires, la désorientation spatiale, le déficit d'attention, la stéréotypie, etc., ont joué un rôle important dans les comportements altérés induits par le MK-801 chez le poisson zèbre.

Schéma du dispositif de mesure optique avec caméra, ordinateur, cube et miroir ; étude en photonique
Figure 1. Schéma du dispositif expérimental. La caméra acquiert des images successives (cad. des clichés fixes) montrant à la fois la vue de face et la vue de dessus de la cuve d’observation. Ces images sont stockées sur l’ordinateur pour un traitement ultérieur. Remarquez les positions des dimensions xyz, qui sont importantes pour décrire les caractéristiques tridimensionnelles des déplacements et des positions des poissons-zèbres. Dans notre expérience (voir Résultats représentatifs), les deux parois ombrées (ainsi que le fond de la cuve) ont été peintes en blanc, tandis que les deux autres parois étaient transparentes. Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle.

Expérience de comportement en aquarium, deux aquariums avec répartition des poissons, dispositif d'étude comportementale.
Figure 2. Exemples de clichés. Remarquez que les vues de face ou de dessus prises isolément entraînent une perte d'information. Cela est particulièrement évident dans le panneau B, où les trois zebrafish situés à gauche semblent proches les uns des autres lorsqu'on observe la vue de face, alors que la vue de dessus montre que ce n'est pas le cas. En revanche, la vue de dessus ne donne aucune indication sur la distance par rapport au fond. A) Zebrafish témoins. B) Zebrafish traités avec 10 µM de MK-801. Remarquez que la couleur (bleue) du fond a été générée par le logiciel d'enregistrement et a été choisie pour obtenir un bon contraste. La couleur réelle des parois arrière et droite ainsi que du fond était blanche. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Système de suivi du comportement des animaux aquatiques ; installation d'analyse vidéo ; panneau d'étalonnage ; processus de surveillance.
Figure 3. Alignement du miroir latéral. La flèche blanche à gauche indique le mur avant (le plus proche de la caméra) dans le miroir latéral. Si deux lignes sont visibles, corrigez la position du miroir latéral jusqu'à ce qu'une seule ligne soit visible (étape 1.2). Les 5 LED du panneau d'étalonnage sont clairement visibles sur les trois vues. Notez que, comme les lumières de la chambre sont allumées, de nombreux autres reflets apparaissent sur le panneau LED (étape 1.4). Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Processus de détection des particules, boîtes rouges marquées, diagramme d'analyse optique, conditions de faible luminosité.
Figure 4. Repérage des DEL. Le panneau de gauche montre que les cinq repères (numérotés de 0 à 4) identifiés par la procédure d'étalonnage ne correspondent pas aux DEL réelles. Outre les DEL, d'autres taches lumineuses (en réalité des réflexions) sont visibles. Sur le panneau de droite, le gain et l'obturateur ont été réduits de sorte que seules les DEL soient visibles. Les cinq repères sont maintenant correctement attribués (comme décrit aux étapes 1.7 à 1.10). Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Interface d'un logiciel de suivi du comportement d'animaux aquatiques montrant le contrôle de la caméra et la configuration de l'étalonnage.
Figure 5. Collecter les informations sur le récipient. La séquence des six points à sélectionner (en cliquant avec le bouton droit de la souris) est indiquée. Les lignes seront tracées automatiquement. Remarque : les numéros indiqués ici n'apparaissent pas à l'écran. Une fois terminé, appuyez sur « Collecter les informations sur le récipient » (comme décrit à l'étape 1.12). Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Schéma de l'expérience d'hydrodynamique ; installation d'un réservoir pour l'étude de la dynamique des fluides et de la flottabilité ; composants annotés.
Figure 6. Volume à collecter. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur les emplacements indiqués, marquant les coins du plan d’eau : marquez d’abord le coin dans la vue de face, puis dans la vue de dessus. Passez ensuite au coin suivant (de 1 à 8). Notez que les huit points délimitent le contour du plan d’eau, et non celui du réservoir. Remarquez également que, lors d’un clic droit, seul « x0 » apparaît, ce qui disparaîtra en cliquant sur l’emplacement suivant (ainsi, les numéros 1 à 8 n’apparaissent pas réellement à l’écran). La procédure est décrite à l’étape 1.17. Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle.

Installation de suivi du comportement d'animaux aquatiques avec commande de caméra, surveillance des déplacements des animaux dans un réservoir d'eau.
Figure 7. Contraste non corrigé. L'image est surexposée et le contraste entre le poisson et l'arrière-plan (en particulier dans la vue de face) est faible. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Dispositif aquatique avec poissons utilisé dans l'étude de l'équilibre statique ; expérience en dynamique des fluides.

Figure 8. Contraste corrigé. Le contraste est désormais amélioré par rapport à la figure 7. Notez que les couleurs à l'écran sont des fausses couleurs. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Interface des paramètres de la caméra Bumblebee2 BB2-03S2C, montrant les réglages de luminosité, d'exposition et de saturation.
Figure 9. Paramètres généraux. Après avoir sélectionné « Contrôle de la caméra » dans le menu principal, la fenêtre « Paramètres généraux » s'ouvre. Désactivez les cases « Obturateur » et « Gain » et utilisez les curseurs pour obtenir le meilleur contraste entre le poisson et l'arrière-plan. Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle.

Interface graphique de réglage de la balance des blancs de la caméra ; curseurs rouge/bleu ; optimisation du traitement d'image.
Figure 10. Réglages de couleur. Dans la fenêtre « Balance des blancs/Couleur », désélectionnez la case « Auto » et utilisez les curseurs « Rouge » et « Bleu » pour trouver la meilleure combinaison assurant un bon contraste entre le poisson et l'arrière-plan. Paramètres. Après avoir ouvert le module Trajectoire, sélectionnez le fichier expérimental à l’aide de « Emplacement des données », puis ouvrez la fenêtre « Paramètres » via « Configuration du système ». De bonnes valeurs initiales sont ici attribuées aux paramètres. Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle.

Interface d'un logiciel de suivi du comportement d'animaux aquatiques ; paramètres d'étalonnage ; configuration de l'analyse vidéo.
Figure 11. Paramètres. Après avoir ouvert le module Trajectory, sélectionnez le fichier expérimental à l’aide de « Emplacement des données » puis ouvrez la fenêtre « Paramètres » via « Configuration du système ». De bonnes valeurs initiales sont ici attribuées aux paramètres. .Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle.

Installation de suivi du comportement aquatique, étalonnage du système 3D, interface logicielle, analyse des trajectoires.
Figure 12. Alignement des boîtes. Remarquez comment les boîtes rouges des vues supérieure et frontale définissent les zones dans lesquelles le poisson pourrait se trouver. La boîte située à gauche est réduite à une ligne afin d'exclure cette zone de la recherche. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Interface d'un logiciel de suivi d'animaux aquatiques, illustrant le réglage et la configuration de calibration pour l'analyse du comportement.

Figure 13. Attribution des balises. Après avoir appuyé sur le bouton « Démarrer la génération des trajectoires » et sélectionné l'image initiale (généralement l'image n°0), la fenêtre « Attribution des balises » s'ouvre. Appuyez sur « Étape suivante » jusqu'à ce que la balise (« X0 ») apparaisse à l'écran. Si la balise n'est pas positionnée correctement sur l'image du poisson, appuyez sur « Non » jusqu'à ce qu'elle soit placée correctement. Ensuite, appuyez sur « OK ». Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle.

Schéma d'analyse dynamique avec vecteur de force, concentration de contrainte ; composants désignés par A, B.
Figure 14. Écran d'information. Le panneau (A) montre l'attribution correcte du marqueur. Le marqueur (« X0 ») est placé sur l'image du poisson dans les deux vues. Généralement, une ligne traverse le marqueur. Le panneau (B) montre un bruit excessif et l'absence d'attribution de marqueur. Les images ont été obtenues à partir de l'enregistrement identique en modifiant les seuils de couleur et de taille (à l'étape 2.2), passant respectivement de 1 000-50 à 10-5. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Analyse tridimensionnelle de la trajectoire, diagramme vectoriel illustrant le déplacement des particules en coordonnées cartésiennes.
Figure 15. Représentation tridimensionnelle du trajet reconstruit. L'origine des flèches se situe à l'angle avant gauche du réservoir, à des fins d'orientation (voir également la figure 1). Ainsi, dans cet exemple, le poisson reste proche de la paroi gauche (par rapport à la caméra). Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle.

Fenêtre de configuration des paramètres pour le lissage des trajectoires ; réglages du filtre : seuils de bruit, taille de la fenêtre.
Figure 16. Lissage des trajectoires. Cette fenêtre s'ouvre après avoir cliqué sur le bouton « Lissage des trajectoires ». Pour l'instant, acceptez la valeur par défaut en appuyant sur « OK ». Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle.

Diagramme d’organisation des fichiers montrant le transfert de données depuis le dossier « fish1 » vers le sous-dossier « Trajectories ».
Figure 17. Sous-dossiers. Le dossier généré pendant l’enregistrement est affiché ci-dessus. Après la reconstruction du trajet, il contient les six sous-dossiers indiqués. Cliquez ici pour agrandir l’image.

Données numériques au format texte pour l'analyse statistique.
Figure 18. Fichier lissé. La partie supérieure d’un exemple de fichier point.smoothed est présentée, indiquant le nombre d’images, la durée de l’enregistrement (en min), les coordonnées du centre du plan d’eau par rapport à la caméra, ainsi que, pour chaque image, les coordonnées et la durée. Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle.

Interface du logiciel de traitement des données pour l'analyse des trajectoires ; configuration du projet et attribution des groupes.
Figure 19. Traitement des données. Sélection des fichiers à analyser (fenêtre de droite). Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle.

Interface de traitement de données 3D ABMT affichant la configuration de l'analyse de figement pour l'évaluation des trajectoires.
Figure 20. Exemple d'analyse. Les paramètres d'intérêt peuvent être calculés en les sélectionnant dans le menu. Dans cet exemple, « Durée de figement » a été sélectionnée. Le programme demande de définir des seuils de vitesse et de durée caractérisant le figement. Le résultat est exprimé en pourcentage de la durée totale de l'enregistrement. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Diagramme d'analyse de la locomotion, chemins de suivi chez les souris témoins et les souris MK-801 au fil des intervalles de temps.
Figure 21. Trajectoires représentatives. Deux trajectoires représentatives pour des zebrafish témoins et deux trajectoires représentatives pour des zebrafish traités avec 10 µM de MK-801 sont présentées, respectivement pour la session matinale commençant à 10h30 (ligne supérieure) et pour la session après-midi commençant à 14h00 (ligne inférieure). Les trajectoires des zebrafish individuels de chaque quadruplet sont représentées par une couleur différente. Toutefois, noter qu'un échange de balises peut s'être produit. Une correction manuelle est nécessaire si le suivi précis de chaque trajectoire individuelle est essentiel. Le côté avant gauche (origine des flèches insérées) du récipient représenté correspond au côté le plus proche de la caméra (voir Figure 1 pour la positionnement du réservoir). Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Analyse de la distance sociale ; graphique ; effet du contrôle par rapport au MK-801 ; résultats comparatifs des séances ; série temporelle.
Figure 22. Distance sociale moyenne entre les poissons. A) Les distances sociales moyennes chez les zebrafish contrôles et chez les zebrafish traités avec 10 µM de MK-801 sont présentées pour les séances du matin et de l'après-midi. La moyenne et l'erreur standard de la moyenne (S.E.M.) sont indiquées. ***, p<0,001. B) Les courbes temporelles de la distance interindividuelle moyenne sont présentées pour les deux groupes. Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle.

Analyse de profondeur ; graphique multivarié ; comparaison entre contrôle et MK-801 ; pourcentage de temps en fonction des niveaux de profondeur.
Figure 23. Répartition en fonction de la profondeur. A) Répartition des zebrafish sur dix niveaux de profondeur égaux (le niveau 1 étant le plus proche du fond) pour la session du matin. B) Répartition des zebrafish pour la session de l'après-midi. La moyenne et l'erreur standard de la moyenne (S.E.M.) sont indiquées. *, p<0,0125 ; **, p<0,005 ; ***, p<0,001. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Graphique de la proportion temporelle par zone radiale et par quadrant ; analyse des données ; résultats de l'expérience psychologique.
Figure 24. Répartitions horizontales. (A) La répartition temporelle au sein des quatre zones radiales des groupes expérimentaux est présentée. L'encart montre l'emplacement des zones du centre vers la périphérie : zones centrale, intermédiaire, externe et zones combinées des coins. (B) La répartition temporelle au sein des quatre quadrants des groupes expérimentaux est présentée. L'encart indique la position des quadrants. Les murs représentés par des lignes doubles correspondent aux murs blancs, tandis que ceux représentés par des lignes simples correspondent aux murs transparents. La caméra se trouve à gauche de l'encart, c.-à-d. la plus proche des quadrants 1 et 4 (voir également la Figure 1). La moyenne et l'erreur type de la moyenne (S.E.M.) sont indiquées. Les astérisques noirs indiquent les comparaisons entre les groupes pour la session du matin, et les astérisques gris pour les sessions de l'après-midi : *, p<0,0125 ; **, p<0,005 ; ***, p<0,001. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Graphique d'équilibre statique ; distance parcourue en fonction des coordonnées ; contrôle par rapport à MK-801 ; analyse des données.
Figure 25. Distance parcourue. Les composantes xyz de la distance parcourue par le poisson-zèbre pendant les séances du matin et de l'après-midi sont présentées. La moyenne et l'erreur standard de la moyenne (S.E.M.) sont indiquées. Les astérisques noirs indiquent les comparaisons entre les groupes pour la séance du matin, et les astérisques gris pour les séances de l'après-midi : *, p<0,0125 ; ***, p<0,001. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Discussion

La procédure expérimentale présentée ici permet d’enregistrer des poissons zèbres individuels, des couples de poissons-zèbres (par exemple pour étudier l’accouplement ou l’agression) et des bancs de poissons-zèbres (comme le montre l’exemple représentatif). Le système est particulièrement adapté pour obtenir simultanément des informations sur la distribution 3D (verticale et horizontale), les caractéristiques cinématiques (par exemple, la vitesse, l’accélération, l’angle de braquage) et les paramètres sociaux (par exemple, la cohésion sociale). Dans ce qui suit, nous énumérons quelques points importants à prendre en compte lors de la planification d’expériences.

Selon la procédure expérimentale, différents systèmes comportementaux peuvent être étudiés. Par exemple, pour explorer la néophobie (c’est-à-dire la peur de nouveaux environnements), l’enregistrement doit être commencé immédiatement après avoir introduit le poisson-zèbre dans le bassin d’observation (après avoir attendu quelques secondes que l’eau se calme pour diminuer le bruit), sans accoutumance préalable11,17,37. D’autre part, certains sujets de recherche pourraient nécessiter que le poisson-zèbre soit bien habitué, par exemple lors de l’étude des effets des phéromones d’alarme16. Lors de l’étude de groupes de poissons-zèbres, l’expérimentateur doit être conscient que, bien que le logiciel minimise la commutation des balises, il n’est pas possible pour le moment de suivre des poissons-zèbres individuels. Ce n’est pas non plus important pour les études sur les bancs où l’accent est mis sur la cohésion sociale, mais ce serait crucial lors de l’exploration de l’agression ou de l’accouplement. La réaffectation manuelle des balises est une option, mais peut prendre beaucoup de temps.

La couleur des parois du récipient d’observation et de la chambre d’observation peut avoir une grande influence sur le comportement du poisson zèbre. Par exemple, il a été décrit que les murs blancs induisent des réponses d’aversion36, 37. Lorsque vous essayez différentes couleurs, gardez deux choses à l’esprit : 1) il est important que la paroi avant (c’est-à-dire la paroi la plus proche de l’appareil photo) reste transparente et qu’un couvercle (le cas échéant) doit également être transparent ; 2) Lorsque vous sélectionnez une couleur jamais utilisée auparavant, déterminez d’abord si le contraste entre le poisson zèbre et l’arrière-plan est approprié pour l’enregistrement. Faites un test. La modification des paramètres de l’appareil photo pour l’enregistrement (gain, obturateur, rouge et bleu, comme expliqué aux étapes 2.5 et 2.6) et les paramètres de reconstruction de trajectoire (par exemple, les seuils de couleur et de taille, comme expliqué aux étapes 3.3, 3.5, 3.11 et 3.12) peut faire une grande différence. Encore une fois, l’expérience du système contribuera grandement à décider de ce qui est possible.

Selon l’objectif de l’expérience, une source lumineuse ayant des caractéristiques différentes (par exemple, spectre, intensité) peut être souhaitable. Les barres LED peuvent être facilement remplacées. Assurez-vous que la lumière atteint toutes les parties du récipient.

Si l’expérience exige que le poisson-zèbre reste dans le récipient d’observation pendant plusieurs heures, assurez-vous de prévoir une aération. Un tube d’air peut être fixé dans le coin arrière droit à l’aide d’un clip. Vérifiez sur l’écran de l’ordinateur que le clip n’interfère pas avec l’enregistrement, c’est-à-dire que le poisson-zèbre n’est à aucun moment caché à la vue. Dans les figures 2A et 2B , le clip noir peut être vu sur la vue de dessus. Idéalement, l’aération devrait être assurée avant ou entre les enregistrements, mais pas pendant l’enregistrement afin d’éviter le bruit. Notez également que l’activation ou la désactivation d’une forte aération peut effrayer le poisson-zèbre.

Si l’expérience nécessite de garder le poisson-zèbre dans le récipient pendant la nuit, il est utile de couvrir la chambre d’observation avec un couvercle transparent pour empêcher le poisson-zèbre de sauter (ce qui est un phénomène très courant). Si le couvercle n’est pas retiré avant l’enregistrement (afin de ne pas déranger le poisson-zèbre), tenez compte des deux points suivants : 1) assurez-vous que les images miroir des sources lumineuses n’obstruent pas l’enregistrement (par exemple en déplaçant les sources lumineuses ou en choisissant un couvercle qui ne réfléchit la lumière que de manière minimale) ; 2) considérer que le couvercle peut devenir brumeux lorsqu’il est utilisé pendant la nuit, d’autant plus que dans ce cas, l’aération doit également être prévue ; Une façon de réduire cela est de choisir un couvercle avec de petits trous.

Pour certaines expériences, il peut être essentiel de déterminer le comportement de base du poisson-zèbre avant d’administrer un médicament. Dans ce cas, le médicament peut être ajouté entre les séances au moyen d’un tube (similaire au tube d’aération discuté ci-dessus).

Bien que l’accent ait été mis ici sur l’enregistrement du poisson-zèbre (Danio rerio), d’autres espèces de poissons peuvent bien sûr également être enregistrées avec le système. Il a été utilisé pour étudier les comportements des poissons rouges (juvéniles) (Carassius auratus), de l’ardillon tigré (Barbus tetrazona) et de la porte-épée verte (Xiphophorus helleri).

Enfin, il convient de noter que d’autres dimensions des bassins d’observation sont principalement possibles. Cependant, cela nécessiterait de reconfigurer le système et de trouver un bon équilibre entre la résolution spatiale et temporelle lors de l’utilisation de conteneurs d’observation beaucoup plus grands. De plus, la forme du récipient doit être cuboïde. Le nombre de poissons-zèbres ou d’autres sujets expérimentaux est théoriquement illimité ; Cependant, l’échange de balises augmente avec le nombre de sujets.

Déclarations de divulgation

Hans Maaswinkel, Liqun Zhu et Wei Weng sont des employés de xyZfish, Ronkonkoma NY, qui produit le système de suivi utilisé dans cet article.

Remerciements

Les auteurs n’ont aucune reconnaissance.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AABT-3D Matériel de suivixyZfishAABT IIComprend une caméra, une carte vidéo, un compartiment d’observation avec miroir et éclairage
AABT-3D Équipement d’étalonnagexyZfishcalibContient un panneau d’étalonnage et un rétroviseur latéral
AABT-3D Conteneurs d’observationxyZfishcubes  ;
AABT-3D Logiciel de suivixyZfishv.1.0  ;
Ordinateuren optionN/AWindows XP ou supérieur
(+)-MK-801 Maléate d’hydrogèneSigmaM107  ;
Pompe à airFusion500  ;
Tuyau de conduite d’air 3/16"Lee' s Produits pour aquariums et animaux de compagnie14508  ;
Pinces de reliure moyennesOfficeDepot561339Pour fixer l’avion à un conteneur d’observation

Références

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