Un protocole pour Phage Display et Affinity sélection en utilisant appâts protéine recombinante

Summary

La présentation de phage est une technique puissante pour capturer des protéines ou des fragments protéiques qui interagissent avec une molécule d'intérêt immobilisé. Une fois la décision du type de banque d'ADNc de phage pour créer et écran a été fait, le protocole décrit ici permet la sélection d'affinité efficace menant à l'identification des interacteurs.

Abstract

Utilisation de phage recombinant comme un échafaudage pour présenter différentes parties de protéines codées par une bibliothèque d'ADNc cloné de manière directionnelle à des molécules immobilisées d'appât est un moyen efficace pour découvrir des interactions. La technique a été largement utilisée pour découvrir les interactions protéine-protéine, mais la molécule d'appât pour être contestée ne doit pas être limité à des protéines. Le protocole présenté ici a été optimisée pour permettre à un petit nombre d'appâts à cribler dans les répétitions de maximiser l'identification de clones indépendants présentant la même protéine. Cela permet une plus grande confiance que les protéines en interaction sont identifiés interacteurs légitimes de la molécule d'appât. Le suivi du titre de phages après chaque sélection d'affinité fournit des informations sur la façon rond la sélection par affinité progresse ainsi que sur l'efficacité des contrôles négatifs. Un moyen de titrage du phage, et comment et quoi préparer à l'avance pour permettre à ce processus de progresser le plus efficacementpossible, est présenté. Attributs de amplicons récupérées après l'isolement de la plaque indépendant sont mis en évidence qui peut être utilisé pour déterminer la façon dont la sélection d'affinité a progressé. Techniques de tournage pour minimiser les faux positifs ou de contourner la persistance récupéré phage difficulté sont expliqués. Moyens de réduire la contamination virale embrasement sont discutés.

Introduction

Pourquoi utiliser phage display et la sélection d'affinité à la place des autres techniques innombrables disponibles pour découvrir et étudier les interactions des protéines avec d'autres molécules? La présentation de phage peut réclamer des avantages uniques par rapport aux autres méthodes de détection des interactions protéine-ligand ^1-3, y compris ce qui suit:

Très vaste répertoire de molécules d'appâts

La première raison est dans la diversité des molécules capables d'agir comme appât dans une sélection par affinité ^4. La présentation de phage est un moyen très puissant de l'isolement des fragments de protéines qui interagissent avec d'autres protéines, des nucléotides, des hydrates de carbone, etc ⁵ Essentiellement, si un polymère / molécule peut être fixé à un support récupérable, elle peut être criblée pour l'affinité avec les protéines affichées de phage. En outre, la molécule d'appât peut être accédé pour déterminer si elle conserve une activité biologique quand elle est immobilisée ^6, si les conditions utilisées pour réduire / éliminer son activité sont efficaces ou ^6, d'apporter des modifications post-traductionnelles à l'appât avant la sélection d'affinité.

résistance aux phages à des facteurs externes

Une seconde raison pour utiliser la présentation du phage, est qu'il est possible que certains appâts peuvent nécessiter un stress environnemental (chaleur, des concentrations élevées d'osmolyte, cofacteurs spécifiques, etc.) Pour capturer les protéines interagissantes, ou peut-être besoin d'être quelque peu modifié les protéines affichées phagiques avant la sélection d'affinité. Le premier facteur est étudié l'interaction entre la protéine appât et, pas à la condition qui permet l'interaction se produise ou, si elle est létale pour l'organisme d'essai. Le phage T7 est particulièrement bien adapté à de telles études, car il peut résister à des conditions expérimentales difficiles à la fois intact et viables (par exemple le maximum thermique publié pour T7 viabilité est ~ 60 ° C ^7). A titre d'exemple de modification phage affiché proprotéines, lors de l'examen du protéome des graines d'Arabidopsis thaliana pour les substrats protéiques de l'enzyme de réparation, protéines isoaspartyl méthyle Transferease (PIMT), le virus utilisé dans ces études avaient été «vieilli» pendant une semaine, avant chaque sélection par affinité ronde, afin d'encourager l'introduction de isoaspartate (isoAsp) résidus dans les protéines sensibles ⁶ qui n'est pas possible dans les organismes qui peuvent reconnaître et réparer / métaboliser ces anomalies.

Métaboliquement inerte

En outre, le phage sont généralement résistants aux poisons métaboliques et interférant petites molécules qui, au moins, se traduire par des effets pléiotropiques sur les organismes d'essai métaboliquement actives. Après les lavages de stringence, le poison est retirée avant une grande quantité de bactéries, on introduit de l'infection de sorte que le poison est dilué à une gamme inoffensif pour les bactéries ou la réplication du phage ultérieure. Alors qu'il enquêtait sur des cibles de protéines de la réparation de PIMTenzyme, S-adénosyl méthionine (AdoMet) a été utilisé pour activer l'enzyme micro-titre-plaque-bien immobilisé pour permettre protéine capture de cible tout en s'appuyant sur la S-adénosyl homocystéine (AdoHcy) pour inactiver l'enzyme et fournir un contrôle négatif utiles en sécurité dans sachant que le virus ne serait pas influencé négativement par l'une ou AdoMet AdoHcy ^6. En outre, les membres de certaines embryogenèse tardive familles abondante (LEA) de protéines, étudiés dans ce laboratoire, sont connus pour modifier leur forme en présence d'additifs tels que le saccharose ^8, qui peut atteindre des concentrations aussi élevées que 200 mm de graines de soja au point de maturité physiologique ^9. Le virus n'est pas prévu d'être influencé par addition de saccharose 200 mM à chaque tour de sélection d'affinité, peut-être nécessaire pour certaines interactions entre protéines LEA-client, ce qui n'est pas le cas pour les organismes viables autonome d'essai ^10.

Ce laboratoire a mis l'accent sur DÉCOUVERTEg interactions protéine-protéine dans les graines en germination ou déshydratés matures qui sous-tendent le mécanisme de protection du protéome stockée pendant la déshydratation ¹¹ ou la réparation des composants du protéome stockée qui sont sensibles à la formation isoAsp une fois que les semences ont bu ^6. Ainsi, la production et la purification des protéines recombinantes nécessaires comme appât dans un état actif, et veiller à ce qu'ils le restent, avant et après ils sont immobilisées, bien que souvent difficiles, est une pierre angulaire de notre travail. Cependant, comme chaque scénario de production de protéines recombinantes est différente, les conditions pour l'optimisation de la production de protéines recombinantes ne seront pas abordées ici. Les utilisateurs sont invités à tenter, autant que possible, afin de déterminer si la protéine immobilisée est encore fonctionnel (par exemple, s'il s'agit d'une enzyme, faire une analyse de l'enzyme dans les puits de plaques de microtitration). Cela fournira une certaine confiance que l'appât est biologiquement active et, par conséquent, que les interactions sont découvertspeu plus susceptibles d'avoir une pertinence biologique.

Protocol

Une représentation graphique de la procédure décrite ci-après (figure 1) met en évidence les deux composantes principales pour une sélection par affinité en utilisant une bibliothèque de phage display: A) une banque d'ADNc de phage display susceptibles de coder pour des protéines ayant une affinité pour l'appât et, B) un appât recombinante purifiée protéine. La production de l'appât (protéine recombinante) a été largement examiné et littérature décrivant les meilleures pratiques pour assurer soluble protéine recombinante active, de E. coli ^12-13, levure eucaryote ^14, insecte ^{15-16, 17-18} usine, ou des cellules de mammifères ^19-20 abondent.

Dans le protocole suivant, une protéine recombinante étiquetée hexahistidyl a été utilisé comme appât. Cela permet de vérifier que les protéines appâts restent dans les puits après incubation et de lavage des étapes d'une nuit.

Une. ELISA pour la conservation de la protéine recombinante dans les puits des plaques de microtitration

1. Marquer unmicroplaque à l'encre indélébile, et désigné qui contiennent puits qui concentrations de protéines. Effectuez cette en 3 répétitions des puits. Incluez 3 répétitions d'une série de concentrations de contrôle négatif (protéine non-hexahistidyl marqués; BSA fonctionne bien que cette vérification des antécédents).
2. Laver la plaque abondamment avec de l'eau et éliminer l'eau par claquer la plaque à l'envers sur 4 couches de serviettes en papier entre les lavages.
3. Immobiliser, dans les 3 premiers puits, dans 100 pl de Tris, pH 7,5, (tampon ou de choix) la concentration la plus élevée de la protéine recombinante (10 ng / ml). Ajouter aux trois puits à la protéine recombinante (1,0 pg / ml), etc, jusqu'à 1,0 ng / ml. Faites de même avec la série de concentrations de BSA.
4. Couvrir d'une pellicule plastique plats et laisser une nuit à 4 ° C.
5. Le lendemain matin, enlever les protéines par claquer la plaque à l'envers sur une serviette en papier 4-5 couches.
6. Laver 5 fois les puits avec 200 pi 1x SCT à chaque fois, en laissant le tampondans les puits pendant ~ 1 min à chaque fois et à éliminer le tampon de lavage en faisant claquer la plaque à l'envers sur des serviettes en papier après chaque lavage.
7. Bloquer la plaque ELISA dans un agitateur rotatif à l'aide de 200 pi de 5% (p / v) de BSA ou 200 ul de 5% (p / v) de réactif de blocage dans du TBS à température ambiante pendant 2 heures (ou assis pendant une nuit stationnaire à 4 ° C si commode ) enveloppé dans une pellicule plastique.
8. Retirer la solution de blocage par excès de claquer la plaque à l'envers sur les serviettes en papier. Laver 4x 1 min à chaque fois avec 200 pi de TBS 1x, enlever la solution de lavage par claquer la plaque à l'envers.
9. Diluer penta-SA anticorps primaire 1/2, 000 dans un tampon bloquant et livrer 100 pi dans chaque puits. Incuber 1-2 heures à la température ambiante, à l'arrêt de la plaque.
10. Retirer l'anticorps primaire par claquer la plaque à l'envers sur les serviettes en papier. Laver 4x 1 min à chaque fois avec 200 ul de 1 x TBST. Retirez chaque lavage par claquer la plaque à l'envers.
11. Diluer l'anticorps secondaire(Chèvre anti-souris conjugué à la phosphatase alcaline), dans du tampon de blocage et incuber 100 ul dans chaque puits pendant 1 heure à température ambiante avec la plaque stationnaire.
12. Retirer l'anticorps secondaire par claquer la plaque à l'envers sur les serviettes en papier. Laver 4x 1 min à chaque fois avec 200 ul de 1 x TBST. Retirez chaque lavage par claquer la plaque à l'envers.
13. Placez 200 pi de paranitrophénylphosphate (pNPP) solution de substrat dans chaque puits. Le substrat est un solide à -20 ° C pour faire aliquotes et récupérer le nombre requis d'aliquotes nécessaires à la détection du congélateur bien à l'avance afin qu'il soit complètement dégelé à ce stade.
14. A 30 min arrêter la réaction en ajoutant 50 pi de NaOH 3 M dans chaque puits.
15. Lire l'absorbance à 405 nm immédiatement sur le lecteur de plaque ELISA.

Remarque: Si la protéine recombinante d'intérêt ne se fixe pas aux puits, il est possible de modifier èmeComposition de e / pH du tampon considérablement (tampon carbonate de pH 10,0) ou ajouter chaotropes (urée) à tenter d'aider à la fixation des protéines dans les puits de plaques de microtitration. Cependant, le rétablissement que la protéine recombinante: 1) reste lié aux puits de plaques de microtitration dans les conditions pour la sélection d'affinité et 2) conserve son activité biologique après l'enlèvement du pH élevé / chaotrope est recommandé.

2. Grandir hôte bactérienne (BLT5403) pour Titrage

1. Autoclave (figure 2A) dix flacons de 250 ml Erlenmeyer et 3 tubes de culture. Assurez-liquide LB et LB agar pour verser des plaques de milieu solide. Agar LB Refroidir à 50 ° C et ajouter de l'ampicilline à 100 ug / ml de coulée avant de manière aseptique dans des boîtes de Pétri dans une hotte à flux (Figure 2B).
2. Toujours dans une hotte à flux (figure 2B) de série un LB, 100 pg / ml d'ampicilline (LB ^AMP100) plaque de gélose de colonies isolées de BLT5403 en stock conservé dans 15% (v / v)glycerol à -80 ° C (Figure 2C). Placer la plaque à l'envers à 37 ° C pendant une nuit dans un incubateur pour la croissance (figure 2D).
3. Dans la matinée, inoculer 50 ml de LB ^AMP100 dans une fiole Erlenmeyer de 250 ml avec une seule colonie ramassé de la plaque. Incuber à 37 ° C, 200 rpm dans un agitateur horizontal (figures 2E et 2F), et utiliser un spectrophotomètre pour surveiller la densité des cellules à DO ₆₀₀ = de 0,5 à 0,6 (figure 2H).
4. Verser les cellules dans un tube Falcon de 50 ml ou similaire, et conserve à 4 ° C jusqu'à utilisation (figure 2G). Les cellules sont généralement rester viables pendant environ 1 semaine.
5. Faire 500 ml de LB, placez-le dans un flacon Fernbach perplexe et il l'autoclave. Une fois qu'il est stérile, placer le ballon à 4 ° C (figure 2G) ou de la température ambiante jusqu'à ce que la nuit du «premier jour» ci-dessous.

Remarque: Les cellules hôtes bactériennesBLT5403, exprimant une source de la T7 protéine de capside native sans lequel la mi-T7, et vecteurs faible nombre de copies ne peut pas répliquer avec succès porté par un plasmide, sont extrêmement sensibles au virus. Il est impératif d'éviter la contamination. Contamination finira par se produire à ce moment-là toutes les surfaces en contact avec les bactéries de virus / infectés doivent être essuyés avec 70% (v / v) d'éthanol ou lavés avec un détergent (figure 2I). Si cela est inefficace, une décontamination complète de toutes les surfaces qui peuvent résister Envirocide (Figure 2J) est nécessaire. Lancer BLT5403 cellules du congélateur actions chaque nouveau cycle de sélection par affinité pour aider à atténuer la contamination du stock en 4 ° C, et de veiller à cellules vigoureuses sont utilisés dans le protocole. Embouts de pipette filtre de barrière sont essentiels.

3. Sélection d'affinité

PREMIER JOUR

1. Marquer une microplaque à l'encre indélébile, et désigné qui contiennent puits qui proteins / modifications. (En raison de problèmes de contamination, les plaques sont jamais réutilisés). Effectuez cette en 3 répétitions des puits pour chaque protéine et le traitement.
2. Laver la plaque abondamment avec de l'eau et éliminer l'eau par claquer la plaque à l'envers sur 4 couches de serviettes en papier entre les lavages. Immobiliser, dans 100 ul de Tris, pH 7,5, (ou un tampon de choix) la protéine recombinée (10 pg / ml) dans six puits, ou BSA (10 pg / ml) dans trois puits, pour un total de 9 puits du premier ronde de sélection par affinité. Couvrir le plat d'une pellicule plastique et laisser une nuit à 4 ° C (figure 2G).
3. Assurez-vous que il ya 9 x 250 ml des flacons Erlenmeyer (voir 2.1 ci-dessus) nettoyés, autoclave, et correctement étiquetés (codage avec un ruban de couleur fonctionne bien, figure 2F).
4. Calculer le volume de lysat de phage à utiliser pour chaque puits sur la base du titre de la banque utilisée et le nombre de phages à être projeté.
5. Veiller à ce que les cellules BLT5403 frais sont prêts à utiliserpour le titrage de cette sélection par affinité autour de demain (figure 3A).
6. Assurer suffisante 1x TBS (150 mM de NaCl, 50 mM Tris Base, pH 7,6) et 1 x TTBS (TBS 1x + 0,05% (v / v) de Tween 20) sont disponibles pour effectuer 10 x 200 lavages ul pour le nombre de puits étant utilisés . En outre, la pré-incuber TTBS à la température de sélection par affinité. Faire en sorte que d'une sauvegarde, avec étanchéité, 50 ml tube Falcon de 1x TTBS existe à la température de la sélection par affinité suffisante avec 1x TTBS.
7. Préparez 3 traitements x 3 x 3 réplications triple de tubes de 1,5 ml Eppendorf (27 au total) avec 990 pi de LB ^{100 AMP} et étiqueter chaque appropriée (par exemple 10 ^-2). Ce sont des bactéries infectées récupérés dans les puits de plaques de microtitration demain. Marquer la dilution d'un côté du tube (10 ^-2) et un numéro d'ordre croissant de l'autre côté («1»). Pour chaque tube Eppendorf, étiqueter aussi un tube de borosilicate et un LB ¹⁰⁰ plaque ^AMP. Dans ce way, des plaques et des tubes à essai de borosilicate sont numérotés 1, 2, 3, 4, 5, etc. faire titrage aller plus vite. Ensuite le nombre simple peut être adaptée à la dilution et le traitement sur ​​le tube Eppendorf (par exemple, le n ° 12 le tube était le troisième triple de la première réplication du contrôle BSA pour la dilution 10 ^-5). Magasin tubes Eppendorf et LB ¹⁰⁰ plaques ^AMP nuit à 4 ° C (figures 2G et 3B).

Par exemple: Lancer étiquetage tubes de 1,5 ml Eppendorf pendant trois 10 ^-2 dilutions de phage de la réplication de BSA un bien comme 1, 2, et 3 (trois lectures en triple de phage titre pour une réplication), puis marquer des tubes à essai de borosilicate 1, 2, et 3, dans lequel les bactéries infectées seront mélangés avec des bactéries non infectées et haut agarose avant de verser sur LB agar ^{100 AMP} plaques (figure 3C).

8. Pour la série dilutions, étiquette des tubes Eppendorf et, à chaque, ajouter 900 ul de LB ^{100 AMP.} Une fois les dilutions initiales (10 ^-2) des bactéries infectées sont faites pour chaque protéine / traitement, la réplication et trois exemplaires, demain, ils seront bien mélangés et 100 pi prises d'eux et ajoutés au tube Eppendorf contenant 900 ul approprié LB ^{100 AMP} pour les 10 ^-3 dilution (tubes 4, 5, et 6 pour la réplication un contrôle de BSA). Ceux-ci seront bien mélangés à leur tour et les 10 ^-3 dilutions seront utilisés pour préparer les dilutions 10 ^-4 (7, 8, 9). Utiliser les dilutions 10 ^-4 à 10 ^-5 les dilutions (10, 11, 12), etc. pour obtenir le titre de la première des trois répétitions de la BSA (puits).
9. Le sera de même pour la réplication de BSA deux (bien deux), la réplication BSA trois (bien 3), les trois répétitions de l'appât empoisonné, et enfin les trois répétitions des puits d'appâts. A la fin, il devrait y avoir des tubes étiquetés from 1-135 (135 est le dernier trois exemplaires de la dernière réplication de l'appât à la dilution maximale de 10 ^-6). Stocker ces tubes Eppendorf pendant une nuit à 4 ° C (figure 3C montre la Eppendorf et des tubes de borosilicate de toutes les dilutions des triplicats des trois répétitions (les trois puits) de BSA.
10. Lancer 2 ou 3 tubes de culture de cellules BLT5403 (cueillis dans des colonies isolées à partir d'une nuit plaque LB ^AMP100 fraîchement striée; l'étape 2.2 ci-dessus) qui poussent dans le shaker incubation (figures 2E et 2F) comme une culture de nuit. Pour les 500 ml de LB (point 2.5 ci-dessus), ajouter l'ampicilline à 100 ug / ml et placer le ballon Fernbach dans la pince dans l'incubateur secouant il sera à 37 ° C et aéré le matin suivant (figure 2F).

Remarque: Autour de trois et quatre peuvent nécessiter des dilutions approximatives de jusqu'à 10 ^-10 volume de pHage au volume de LB ^AMP100.

DEUXIÈME JOURNÉE

11. Le lendemain matin, placer les vides, 9 x 250 ml des flacons Erlenmeyer autoclave (un pour chaque plaque de microtitration) dans les pinces dans le shaker incubation. Inoculer 500 ml de LB ^{100 AMP} avec 500 pi de l'une des cultures d'une nuit de BLT5403 cellules ont commencé la nuit dernière (voir l'étape 3.8 ci-dessus), refermer et le lancer de croissance (37 ° C, 220 rpm). Mettez le spectrophotomètre (figure 2H) et le mettre à l'absorbance à 600 nm.
12. Retirer la microplaque de 4 ° C, retirer le film plastique, et éliminer toute protéine non liée de la plaque par lavage 10x avec 200 pi à chaque fois de 1x TBS pH 7,5 et claquer la plaque à l'envers sur la serviette de papier entre les lavages. Bloquer avec 200 pi 5% (p / v) de BSA ou 200 pi 5% (p / v) de réactif de blocage dans du TBS pendant 1 heure (ou toute la nuit si pratique) avec la plaque enveloppée dans une pellicule plastique.
13. Laver le blocage deolution 10x avec 200 pi à chaque fois de 1x TBST, claquements de la plaque à l'envers sur 4 couches de serviette de papier entre les lavages. Il est possible de remplir les puits avec 200 pi d'eau à ce stade, les couvrir d'une pellicule plastique et les mettre à 4 ° C pour stocker pour un maximum de 1 semaine.

Remarque: Commencez la culture assez vite que, au moment où le phage infecté-BLT5403 de l'achèvement de la sélection d'affinité sont prêts à ajouter, les cellules dans les 500 ml sont entre 0,6 et 1,0 OD _600. Si elles poussent bien au-delà de 1,0, la lyse peut pas se produire en raison des restrictions budgétaires que les cellules approchent phase stationnaire. Si les cellules ne permettent pas d'atteindre une DO ₆₀₀ de 0,6 au moins avant l'introduction du phage, la multiplicité d'infection peut être trop élevée, en tuant les cellules rapidement, ce qui peut influencer la représentation du lysat. Si les cellules ne sont pas encore approchent une DO ₆₀₀ de 0,6 par l'achèvement de la sélection par affinité, l'inoculationuler le ballon avec plus BLT5403 partir de la deuxième (ou même à la fois de la deuxième et de la troisième) des tubes à essai sous agitation à 37 ° C (Figure 2F). Si une DO ₆₀₀ de 1,0 s'approche trop vite, éteindre le chauffage et le shaker et ouvrir le couvercle pour refroidir la culture et affamer les bactéries en oxygène. Recommencer chauffage / secouant une fois que le phage ont été ajoutés.

De là utiliser conseils filtre de barrière pour éviter la contamination croisée phage.

14. Une fois que la fiole est ensemencée, mettre la bibliothèque de phages (100 ul) dans les protéines, sceller la plaque avec un film plastique et incuber à température ambiante pendant 1 heure.
15. À 55 min, enregistrer la DO ₆₀₀ des cellules. Le temps de doublement est à peu près toutes les 20 minutes. Loi en conséquence (voir "Note" ci-dessus).
16. Au bout d'une heure enlever la pellicule de plastique de la plaque et laver immédiatement en secouant le phage dans les déchets transformés et en ajoutant ensuite rapidement 200 pi de la tuberculose 1xST. (Utilisez un multipipettor avec une tête 1 = 100 pi et la pipette réglée sur 2 [c.-à-offre 200 dépression pl / plongeur] pour cela et il va vite). Réglez une minuterie pour 1 min. Après 1 min, secouer tampon dans les déchets transformés, plaque claque à l'envers sur une serviette en papier et remettez sur le banc (25 ° C plaque). Répétez les étapes de lavage 10x.
17. Après la 10 ^ème lavage, 200 ul de prendre BLT5403 cellules du tube Falcon de 50 ml à 4 ° C et les placer dans le fond du puits à partir de laquelle le dernier lavage du TTBS a été éliminée. Envelopper les plaques dans une pellicule plastique et mettre à 37 ° C pendant 20 min pour obtenir une phage toujours collé à l'appât pour infecter les bactéries (voir la note en discussion concernant phage persistante récupéré et / ou bruit de fond élevé de phage indistinctement liaison).
18. A la fin de 20 min, déballer les plaques et prendre 10 bactéries ul de BSA à 25 ° C une réplication bien et le mettre dans les 990 pi de LB ^{100 AMP} marquées"1". Répéter deux fois de plus pour que les puits (tubes 2 et 3), résultant en trois triples exemplaires de 1/100 dilutions du phage à partir de ce puits. C'est BSA réplication un échantillon trois fois. Ces dilutions seront utilisés pour estimer le titre moyen ± SEM pour que la réplication de BSA.
19. Faites de même pour la réplication 2 et 3 de la BSA (trois échantillons triple de 10 pi de chacun), pour les trois puits répliqués de la protéine appât empoisonné, et pour la protéine appât. Définissez ces 27 tubes Eppendorf de côté et d'obtenir les 170 pi restants des bactéries infectées dans les puits de plus en plus vers la lyse.
20. Si les bactéries dans le ballon est à DO ₆₀₀ = 0,6 à 1,0, décanter de 50 ml des cellules provenant de la fiole Fernbach dans chacun des neuf flacons Erlenmeyer de 250 ml. Prenez les 170 pi restants infectées par le phage BLT5403 bactéries dans la réplication BSA 1 et ainsi l'ajouter à 50 ml de cellules marquées "BSA représentant 1" (Ruban jaune). Faites cela pour tous les neuf puits et mettre les secouant dans l'incubateur ( Figure 2F).
21. Surveiller les cellules dans un agitateur à 37 ° C en incubant de temps en temps de lyse (environ 3 heures à partir du moment de l'inoculation). Faire les dilutions des 27 dilutions initiales (10 ^-2) dans les cas échéant, des tubes Eppendorf marqués pendant ce temps.
22. Pour effectuer ces dilutions des premières 27 dilutions de 3.12 ci-dessus, prendre 100 pi de la LB avec des bactéries du tube Eppendorf 1 (BSA réplication un, d'abord des échantillons triple de ce dilution 1/100 de ce bien) et l'ajouter à la 900 pi de LB en tube Eppendorf 4 (1 x 10 ^-4 dilution de la réplication de BSA un, d'abord des échantillons triple du bien).
23. Jeter la pointe filtre d'arrêt pour une nouvelle avant d'obtenir 100 pi de la LB avec des bactéries du tube Eppendorf 4 à ajouter aux 900 pi de LB Eppendorf tube 7 (1 x 10 ^-5 dilution de BSA une réplication, d'abord de la triple échantillons de ce bien). Continuer les dilutions (dpropre à 1 x 10 ^-6) pour tous les triplicats de toutes les réplications de toutes les protéines et les traitements tubes (135 au total).
24. Une fois que les cellules ont lysées, apporter la culture à 0,5 M de NaCl en ajoutant 5 ml d'un M de NaCl stock 5 et transférer dans une bouteille de centrifugeuse étiqueté.
25. Centrifuger à 8000 g pendant 10 min à 4 ° C. Décanter le surnageant (virus) dans un stérile de 50 ml tube propre, de Falcon.
26. Ajouter quelques gouttes de chloroforme au surnageant décanté dans le tube Falcon.
27. Conserver à 4 ° C pour la prochaine ronde de sélection par affinité.

4. Troisième jour

1. Autoclave ou blanchir tout le matériel de laboratoire qui a été utilisé pour générer cette sélection d'affinité ronde pour se préparer à la prochaine ronde.

5. Titrage

1. Nombre autant de solides LB ¹⁰⁰ plaques ^d'AMP comme il ya des dilutions dans l'ordre croissant (il devrait maintenant être une plaque pour chaque tube de borosilicate et tube Eppendorf, chacun avec le même numéro). Put les plaques dans le 37 ° C incubateur (figure 3D).
2. Faire fondre le top agarose (1,0 g bactotryptone, Extrait de 0,5 g de levure, 0,5 g de NaCl, 0,6 g d'agarose, compléter à 100 ml, autoclave) en dévissant le capuchon de la bouteille agarose et micro-ondes alternativement la bouteille et tourbillonnant à mélanger jusqu'à ce que le haut agarose soit complètement fondu. Placer le flacon dans un bain d'eau pour refroidir à 50 ° C (Figure 3E).
3. Prendre une pipette borosilicate 10 ml d'une pompe de pipette attaché. Allumer un brûleur Bunsen. Mettez un porte-tube Falcon de styromousse ou couvercle de la glacière à l'envers sur le banc et placez dessus les plaques LB100 AMP 1 à 6 (frais sur la incubateur à 37 ° C), la plaque supérieure 1 (figure 4A). Le polystyrène maintient les plaques chaud.
4. Mettre 250 ul de cellules BLT5403 4 ° C dans chacun des tubes à essai numérotés de borosilicate préparées au jour un au-dessus (section 3.7 et les figures 4B et 4C). Arvarier les tubes de borosilicate numérotés de la même série ascendante comme les dilutions dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml (Figure 4A).
5. Mettre 100 ul de la dilution en tube Eppendorf de 1 à 250 ul de cellules dans un tube à essai de borosilicate 1 (figures 4D et 4E). Chauffer les 5 premiers dans de la pipette sur la flamme un peu (pas trop! ~ 3 balayages, figure 4F) et plonger dans l'agarose fondu dessus. Tirez 3 ml et livrer rapidement dans le tube à essai au-dessus de la cellules / phages (figure 4G).
6. Mélanger en tapotant avec un doigt tout en maintenant le tube de l'autre main (Figure 4H) et verser le contenu sur la plaque (figure 4E). Inclinez la plaque et d'utiliser le tube à essai pour chasser les bulles et les taches sèches jusqu'à la plaque entière est couverte par l'agarose haut. Mettre de côté, debout sur le banc à refroidir.
7. Jeter le tube de borosilicate, éjecter la pointe filtre de barrière, obtenir unun frais et continuer jusqu'à ce que toutes les dilutions ont été plaqué. Récupérer LB ¹⁰⁰ plaques ^d'AMP de l'incubateur car ils sont épuisés, mais pas plus de 6 à un moment ou ils se refroidissent et l'agarose haut solidifie trop rapidement.
8. Une fois l'agarose haut est solide, tourner les plaques à l'envers (il est important de le faire). Dans le cas contraire, la gélose / agarose "pleure", se condense sur le couvercle, descend sur la partie supérieure d'agarose et court au-dessus, en prenant le phage avec ce qui rend impossible le titre de précision) et soit: 1) placer les plaques dans les 37 ° C incubateur [de retour 4 heures plus tard à compter du titre que T7 est agressif] OU: 2) Laissez-les à l'envers sur le banc et ils sont prêts le lendemain matin à compter titre.
9. Prendre toutes les précautions nécessaires pour se protéger contre le bris de verre, ou des blessures si c'est le cas, mettre le capuchon de la bouteille agarose dos lâche et micro-ondes de l'agarose haut jusqu'à ébullition. Faire deux fois ce. Laisser refroidir, serrer lachapeau et de le ranger. Tournez le bain d'eau à sa température habituelle ou l'éteindre. Mettez les dilutions dans le 4 ° C réfrigérateur. Ils seront nécessaires pour interpréter les titres et / ou refaire une partie du titrage.

6. Déterminer et calculer Titer

1. Examiner la plaque formée sur les plaques et jetez ceux qui confluent lyse (figure 5A par exemple dilution 10 ^-2). Déterminer lequel des dilutions en série restants ont produit suffisamment peu plaque pour permettre un décompte précis (figures 5A un e 5B). Notez le numéro de la plaque à partir de ces plaques (Tableau 1; figure 5B).
2. Multiplier le nombre de plaque par la dilution et ensuite de multiplier ce nombre par 100 pour obtenir le nombre de plaque unités formant par ml de bactéries infectées prises dans les puits (c'est à dire que 10 pi de bactéries infectées ont été prises pour chacun des trois exemplaires et so ce doit être multiplié par 100 pour obtenir les chiffres par ml). La moyenne du nombre d'unités formant plaque (UFP) par millilitre, (UFP / ml de bactéries infectées non dilués prises sur la plaque de microtitration), dans les trois triple tirés de ce bien.
3. Former un Grand moyenne des pointages des trois puits réplicats et calculer l'erreur-type de cette moyenne (tableau 1). C'est ce qui sera enregistré dans le chiffre de l'augmentation de phage titre pour chaque affinité ronde et de traitement (figure 5C) sélection.

7. Isolation plaque, PCR, séquençage et

1. A la fin de l'affinité tour de sélection 4, sélectionnez 18 individu, bien défini, les colonies de la plaque et, en utilisant une pipette Pasteur stérile, cure-dents, embout de pipette jaune ou un appareil similaire, le noyau de ces plaques des plaques de titrage. Si l'on utilise des tubes ou des pointes, d'abord à l'intérieur de la mouiller avec le Tris-HCl, pH 8,5 dans le tube Eppendorf (Figure 5D).
2. Si vous utilisez des tubes, assurez-vous que le tube de borosilicate ne détient pas de gouttes en excès de Tris, appuyez sur l'ampoule et, avec elle encore comprimé, pousser la pointe borosilicate de pipette par une plaque bien isolée droit à la plastique boîte de Pétri ci-dessous (figure 5E). Relâchez l'ampoule avec la pointe encore dans la gélose agar / haut pipette et aspirer le noyau (Figure 5F, voir flèche).
3. Expulser le noyau dans 100 pi de Tris-HCl, pH 8,5 dans le tube approprié (figure 5G) et vortex brièvement.
4. Chauffer 20 ul de ce volume à 65 ° C pendant 10 min.
5. Centrifuger le volume chauffé à 13 000 x g dans une centrifugeuse de paillasse à température ambiante pendant 10 min. Prendre 3 ul du surnageant de cette aliquote à être utilisé dans des réactions de PCR avec T7-HAUT et BAS amorces T7-.
6. Pour chacune de la plaque d'isolement 18, des solutions chauffées, font une réaction de PCR de 50 pi en utilisant une température d'hybridation de 58 ° C et 35 cycles.
7. Exécutez 20 pi de each sur une réaction à 1% (p / v) contenant du gel d'agarose à 0,015% (v / v) de bromure d'éthidium. Visualiser avec un transilluminateur utilisant des lunettes de protection et des gants en nitrile de laboratoire. (ATTENTION: le bromure d'éthidium est un mutagène puissant.) Photographier le gel et éliminer les matériaux contaminés correctement (figures 6A et 6B).
8. Si les amplicons sont des produits simples, et pas de vecteur vide (produit fonctionne près de 100 pb sur un 1% (poids) gel d'agarose / TAE; figures 6A et 6B flèches), nettoyer les 30 pl restants pour une utilisation comme matrice de séquençage. Si ce n'est pas un produit unique sur le gel (Figure 6B, la plaque 15), découper la bande (s) plus en avant à partir du gel et l'ADN extrait à partir du gel en utilisant un kit.
9. Séquence des amplicons qui ne sont pas des vecteurs vides à l'aide de l'amorce T7-UP.
10. Examiner chaque séquence pour les bras de liaison et, à partir de ces informations, déterminer l'emplacement du début de l'insert est située. Utilisez le Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; National Library of Medicine) afin de déterminer l'identité de l'ADNc codé, si l'insert est dans le cadre et, le cas échéant, quelle partie de la protéine de séquence codante (CDS) a été affiché et capturé par le appât.

Results

Être capable de nuire à la capacité de l'appât à interagir avec des protéines de phage (empoisonnement métaboliquement l'appât) fournit un contrôle négatif puissant pour cette technique. Il est également souhaitable pour déterminer si l'amorce, lorsqu'il est lié à la plaque de microtitrage, conserve sa fonction. Ces deux contrôles augmentera la confiance que l'interaction, des protéines de phage récupérés par l'appât nonpoisoned sont légitimes.

Échantillonnage trois triple de chaque puits au...

Discussion

En exécutant l'expérience dans trois puits répliqués, phage de la même liaison à l'amorce protéique acquise de façon indépendante peuvent être distingués, même si elles sont du même clone (c'est à dire pas de différence dans la séquence nucléotidique de la région de la CDS qui a été acquise, mais ceux-ci ont été récupéré à partir des puits indépendants). Sinon, le seul moyen de faire la distinction entre un phage codant pour la même liaison à la protéine appât est s'ils sont indépendamment inver...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	Becton Dickinson Co.
levure	Becton Dickinson	212750
Agar	Becton Dickinson	214010
Chlorure de sodium	Fisher Scientific	BP358-10
Agarose	Research Products International	A20090
Réactif	de blocage EMD Chemicals Inc.	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	BP359-212
Dodécylsulfate de sodium	Fisher Scientific	BP166-500
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Chloroforme	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	Génotype : F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicilline, Sodium Salt	Research Products International	A40040
Bromure d’éthidium	Fisher Scientific	BP102-1
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
Anticorps primaire Penta-HIS	Qiagen Inc.	34660
Conjugué phosphatise alcaline anti-souris de chèvre	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-Nitrophénylphosphate	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
Amorce T7-UP	EMD Chemicals Inc.		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN
amorce	EMD Chemicals Inc.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick
Kit de purification PCR	Qiagen Inc.	28104
Qiaquick Kit d’extraction de gel	Qiagen Inc.	28706
Big Dye Terminator v3.1 Kit de séquençage de cycle	Invitrogen Life Technologies	4336917
bloc chauffant	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
Plaques de culture cellulaire à 96 puits	Corning	Costar 3590
Four d’incubation Isotemp Fisher	Scientific	516D
Pasteur Pipettes, 5 ¾ ; in	Fisher Scientific	13-678-20A
Transilluminateur ChromaView	UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
Gants, Nitrile	Fisher Scientific	19-170-010C
Tubes stériles de 1,5 ml	USA Scientific Inc	1615-5500
Pipettes borosilicatées 10 ml	Fisher Scientific	13-678-25E
Tubes de culture borosilicaté	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, lecteur de plaques ELISA	Labsystem et Flow Laboratories, Helsinki, Finlande	Type 362