Un protocole pour Phage Display et Affinity sélection en utilisant appâts protéine recombinante

Summary

La présentation de phage est une technique puissante pour capturer des protéines ou des fragments protéiques qui interagissent avec une molécule d'intérêt immobilisé. Une fois la décision du type de banque d'ADNc de phage pour créer et écran a été fait, le protocole décrit ici permet la sélection d'affinité efficace menant à l'identification des interacteurs.

Abstract

Utilisation de phage recombinant comme un échafaudage pour présenter différentes parties de protéines codées par une bibliothèque d'ADNc cloné de manière directionnelle à des molécules immobilisées d'appât est un moyen efficace pour découvrir des interactions. La technique a été largement utilisée pour découvrir les interactions protéine-protéine, mais la molécule d'appât pour être contestée ne doit pas être limité à des protéines. Le protocole présenté ici a été optimisée pour permettre à un petit nombre d'appâts à cribler dans les répétitions de maximiser l'identification de clones indépendants présentant la même protéine. Cela permet une plus grande confiance que les protéines en interaction sont identifiés interacteurs légitimes de la molécule d'appât. Le suivi du titre de phages après chaque sélection d'affinité fournit des informations sur la façon rond la sélection par affinité progresse ainsi que sur l'efficacité des contrôles négatifs. Un moyen de titrage du phage, et comment et quoi préparer à l'avance pour permettre à ce processus de progresser le plus efficacementpossible, est présenté. Attributs de amplicons récupérées après l'isolement de la plaque indépendant sont mis en évidence qui peut être utilisé pour déterminer la façon dont la sélection d'affinité a progressé. Techniques de tournage pour minimiser les faux positifs ou de contourner la persistance récupéré phage difficulté sont expliqués. Moyens de réduire la contamination virale embrasement sont discutés.

Introduction

Pourquoi utiliser phage display et la sélection d'affinité à la place des autres techniques innombrables disponibles pour découvrir et étudier les interactions des protéines avec d'autres molécules? La présentation de phage peut réclamer des avantages uniques par rapport aux autres méthodes de détection des interactions protéine-ligand ^1-3, y compris ce qui suit:

Très vaste répertoire de molécules d'appâts

La première raison est dans la diversité des molécules capables d'agir comme appât dans une sélection par affinité ^4. La présentation de phage est un moyen très puissant de....

Protocol

Une représentation graphique de la procédure décrite ci-après (figure 1) met en évidence les deux composantes principales pour une sélection par affinité en utilisant une bibliothèque de phage display: A) une banque d'ADNc de phage display susceptibles de coder pour des protéines ayant une affinité pour l'appât et, B) un appât recombinante purifiée protéine. La production de l'appât (protéine recombinante) a été largement examiné et littérature décrivant les meilleures pratiques pour assurer soluble protéine recombinante active, de E. coli ^12-13, levure eucaryote ^14, insecte ^{15-16, 17-18} usine, ou....

Results

Être capable de nuire à la capacité de l'appât à interagir avec des protéines de phage (empoisonnement métaboliquement l'appât) fournit un contrôle négatif puissant pour cette technique. Il est également souhaitable pour déterminer si l'amorce, lorsqu'il est lié à la plaque de microtitrage, conserve sa fonction. Ces deux contrôles augmentera la confiance que l'interaction, des protéines de phage récupérés par l'appât nonpoisoned sont légitimes.

Échantillonnage trois triple de chaque puits au.......

Discussion

En exécutant l'expérience dans trois puits répliqués, phage de la même liaison à l'amorce protéique acquise de façon indépendante peuvent être distingués, même si elles sont du même clone (c'est à dire pas de différence dans la séquence nucléotidique de la région de la CDS qui a été acquise, mais ceux-ci ont été récupéré à partir des puits indépendants). Sinon, le seul moyen de faire la distinction entre un phage codant pour la même liaison à la protéine appât est s'ils sont indépendamment inver.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	Becton Dickinson Co.
levure	Becton Dickinson	212750
Agar	Becton Dickinson	214010
Chlorure de sodium	Fisher Scientific	BP358-10
Agarose	Research Products International	A20090
Réactif	de blocage EMD Chemicals Inc.	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	BP359-212
Dodécylsulfate de sodium	Fisher Scientific	BP166-500
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Chloroforme	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	Génotype : F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicilline, Sodium Salt	Research Products International	A40040
Bromure d’éthidium	Fisher Scientific	BP102-1
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
Anticorps primaire Penta-HIS	Qiagen Inc.	34660
Conjugué phosphatise alcaline anti-souris de chèvre	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-Nitrophénylphosphate	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
Amorce T7-UP	EMD Chemicals Inc.		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN
amorce	EMD Chemicals Inc.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick
Kit de purification PCR	Qiagen Inc.	28104
Qiaquick Kit d’extraction de gel	Qiagen Inc.	28706
Big Dye Terminator v3.1 Kit de séquençage de cycle	Invitrogen Life Technologies	4336917
bloc chauffant	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
Plaques de culture cellulaire à 96 puits	Corning	Costar 3590
Four d’incubation Isotemp Fisher	Scientific	516D
Pasteur Pipettes, 5 ¾ ; in	Fisher Scientific	13-678-20A
Transilluminateur ChromaView	UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
Gants, Nitrile	Fisher Scientific	19-170-010C
Tubes stériles de 1,5 ml	USA Scientific Inc	1615-5500
Pipettes borosilicatées 10 ml	Fisher Scientific	13-678-25E
Tubes de culture borosilicaté	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, lecteur de plaques ELISA	Labsystem et Flow Laboratories, Helsinki, Finlande	Type 362