Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d'étudier l'intégration synaptique

Résumé

Dans cet article, nous introduisons rapide micro-iontophorèse de neurotransmetteurs comme une technique pour étudier l'intégration des signaux post-synaptiques avec une grande précision spatiale et temporelle.

Résumé

L'un des intérêts fondamentaux en neurosciences est de comprendre l'intégration d'entrées excitateurs et inhibiteurs long de la structure très complexe de l'arbre dendritique, ce qui conduit finalement à la sortie neuronale de potentiels d'action à l'axone. L'influence de divers paramètres spatiaux et temporels de l'entrée synaptique spécifique sur la production neuronale est actuellement à l'étude, par exemple, l'atténuation dépendante de la distance d'entrées dendritiques, l'interaction dépendant de la localisation des entrées spatialement distincts, l'influence de l'inhibition GABAergig sur l'intégration d'excitation, linéaire et modes d'intégration non-linéaires, et beaucoup plus.

Avec rapide micro-iontophorèse de glutamate et le GABA, il est possible d'étudier précisément l'intégration spatiale et temporelle de l'excitation et l'inhibition GABAergique glutamatergique. Exigences techniques critiques sont soit une lampe fluorescente déclenché, la diode électroluminescente (LED), ou une à deux photons scanning microscope pour visualiser branches dendritiques sans introduire significative photo-dommages des tissus. En outre, il est très important d'avoir un amplificateur micro-iontophorèse qui permet de compensation de capacité rapide de pipettes à haute résistance. Un autre point crucial est que aucun émetteur est involontairement libéré par la pipette pendant l'expérience.

Une fois établie, cette technique va donner des signaux fiables et reproductibles avec une grande neurotransmetteur et l'emplacement spécificité. Par rapport au glutamate et le GABA uncaging, ionophorèse rapide permet d'utiliser deux émetteurs en même temps, mais à des endroits très éloignés sans limitation dans le champ de vue. Il ya aussi des avantages par rapport à une stimulation électrique des axones focale: avec micro-iontophorèse l'emplacement du site d'entrée est définitivement connus et il est sûr que seul le neurotransmetteur d'intérêt est publié. Cependant, il doit être considéré que la micro-iontophorèse seulement l'postsynapse est activé et aspects présynaptique de la libération de neurotransmetteurs ne sont pas résolus. Dans cet article, nous montrons comment mettre en place des micro-iontophorèse dans des expériences de tranches de cerveau.

Introduction

Neurones dans le système nerveux central reçoivent une variété d'entrées synaptiques sur leurs processus dendritiques fines et ramifiées ^1. Là-bas, la majorité des entrées dendritiques excitateurs sont médiés par des synapses glutamatergiques. Ces synapses peuvent être activés de façon répartie dans l'espace, ce qui entraîne l'intégration linéaire post-synaptique des potentiels post-synaptiques excitateurs (EPSP). Si les synapses sont activées simultanément et à proximité spatiale sur la dendrites, ces entrées excitatrices peuvent être intégrés supra-linéaire et génèrent des pointes dendritique ^2-5.

De pl....

Protocole

1. Configuration requise

1. Système de microscope: Bonne visualisation de la Dendrite est crucial. Si possible, utilisez un système de microscope à balayage laser à deux photons. Dans nos expériences, nous avons utilisé une portée TRIM II, LaVision Biotec, Bielefeld, en Allemagne ou un système Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin équipé d'un Ti: saphir laser ultrarapide pulsé (Chameleon Ultra II, Coherent) et un objectif élevé NA (60X, 0,9 NA, Olympus) pour visualiser les dendrites que nous avions remplis avec un colorant fluorescent via la pipette de patch. Bien que photo-dommages est pensé pour être moins sévère en utilisant un balayage....

Résultats

Une approche simple pour déterminer la propagation spatiale de l'iontophorèse est de retirer la pipette iontophorèse par étapes à partir de la dendrite, tout en maintenant constant le glutamate éjecté. Nous avons constaté que l'étendue spatiale d'une stimulation micro-iontophorèse avait un diamètre d'environ 12 um (figure 1 montrant rayon). Quelle profondeur dans le tissu de la ionophorèse peut être utilisé dépend de la rigidité de la pipette. Cependant, les pipettes iontophorétiques néc.......

Discussion

Nous expliquons ici comment appliquer rapidement des micro-iontophorèse de neurotransmetteurs pour enquêter sur l'intégration synaptique sur dendrites. Cette technique a été utilisée avec succès pour étudier la transmission synaptique glutamatergique et GABAergique dans différentes régions du cerveau in vitro et in vivo ^9,20-22. Micro-iontophorèse a été utilisé pendant plus de 60 ans, mais dans les premières années, il a été principalement utilisé pour appliquer localement neurotransmetteurs et d.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
;			Material
Microscope à balayage laser à deux photons (TRIM Scope II), et Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)	LaVision Biotec, Bielefeld, Allemagne		;
Microscope à balayage laser à deux photons Ultima IV Prairie	Technologies, Middleton, Wisconsin, États-Unis		.
Ti :Sapphire laser à impulsions ultrarapides	Chameleon Ultra II, cohérent		;
Objectif 60X, NA 0,9	Olympus		;
Microscope droit Zeiss Axioskop 2 FS	TILLPhotonics, Grä ; felfing, Allemagne		;
Monochromateur	TILLPhotonics, Grä ; felfing, Allemagne		;
Système de micro-ionophorèse MVCS-02	NPI Electronics, Tamm, Allemagne		;
Extracteur de sutter P-97	Sutter Instrument Company, Novato, CA		;
Filaments de verre (150 GB F 8P)	Science Products, Hofheim, Allemagne		;
;			réactif
Alexa Fluor 488 hydrazide	Sondes moléculaires technologies de vie	A-10436	;
Alexa Fluor 594	Sondes moléculaires technologies de la vie	A-10438	;
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	;
KCl	Sigma Aldrich	P9333	² ;
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S8282	;
NaHCO3	Sigma Aldrich	S6297	;
Saccharose	Sigma Aldrich	S7903	;
CaCl2	Sigma Aldrich	C5080	;
MgCl2	Sigma Aldrich	M2670	;
Glucose	Sigma Aldrich	G7528	;
K-gluconate	Sigma Aldrich	G4500	² ;
HEPES-acide	Sigma Aldrich	H4034	;
Phosphocréatine	Sigma Aldrich	P7936	;
EGTA	Sigma Aldrich	E3889	° ;
Acide glutamique	Sigma Aldrich	G8415	;
GABA	Sigma Aldrich	A5835	² ;
NaOH	Merck	1.09137.1000	;
HCl	Merck	1.09108.1000	;