Issu l'évolution temporelle du glutamate Dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de Transporteur ASTROCYTIQUES

Summary

Nous décrivons une méthode analytique pour estimer la durée de vie de glutamate au niveau des membranes astrocytes à partir d'enregistrements électrophysiologiques des courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes.

Abstract

La plus forte densité de transporteurs du glutamate dans le cerveau se trouve dans les astrocytes. Le glutamate en couple de transporteurs le mouvement du glutamate à travers la membrane avec le co-transport de Na ⁺ et 3 1 H ⁺ et le contre-transport de K ⁺ 1. Le courant stoechiométrique généré par le processus de transport peut être contrôlée au moyen d'enregistrements de patch-clamp de cellules entières provenant astrocytes. L'évolution dans le temps du courant enregistré est façonné par l'évolution temporelle du profil de concentration de glutamate qui astrocytes sont exposées, la cinétique de transporteurs du glutamate, et les propriétés des membranes passives électrotoniques astrocytiques. Nous décrivons ici les méthodes expérimentales et analytiques qui peuvent être utilisés pour enregistrer les courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes et isoler le cours du temps de jeu glutamate de tous les autres facteurs qui façonnent la forme d'onde des courants de transporteurs astrocytaires. Les méthodes décrites ici peuvent être utilisées pour estimer la durée de vie of flash-Uncaged et synaptiquement-glutamate libéré à membranes astrocytaires dans n'importe quelle région du système nerveux central pendant la santé et la maladie.

Introduction

Les astrocytes sont l'un des types cellulaires les plus abondants dans le cerveau avec une morphologie en forme d'étoile et des protubérances membranaires fines qui s'étendent tout au long de la neuropile et atteignent voisins contacts synaptiques ^1,2. La membrane de la cellule Les astrocytes de forte densité est emballé avec des molécules d'transporteur du glutamate ^3. Dans les conditions physiologiques, transporteurs du glutamate se lient rapidement glutamate sur le côté extracellulaire de la membrane et le transférer dans le cytoplasme de la cellule. Ce faisant, les transporteurs maintiennent bas la concentration basale de glu....

Protocol

1. Slice Préparation

1. Préparer 500 ml tranchage solution / de stockage contenant (en mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 _CaCl2, 1,3 _MgSO4 · 7H ₂ O, 4 _MgCl2, 26,2 _NaHCO3, une NaH ₂ PO _4, et 22, du glucose, 320 mOsm, pH 7,4
2. Utilisez un bécher de 250 ml pour préparer une chambre submersion pour les tranches, remplissez-le avec 200 ml de tranchage solution / de stockage, le réchauffer dans un bain d'eau à 34 ° C et la bulle avec 95% d'O _2, 5% de CO _2.
3. Maintenir la solution restante de tranchage / de stockage dans une bouteille en verre à 4 ° C.

Results

Le succès de l'approche analytique décrite ici dépend de façon critique sur l'obtention des enregistrements électrophysiologiques haute qualité des courants de transporteur de astrocytes dans n'importe quelle région du système nerveux central. Dans des coupes d'hippocampe de souris aiguës, les astrocytes peuvent être facilement identifiés sous Dodt éclairage ou IR-DIC en raison de leur corps à petites cellules (Ø = 10 um) et le noyau de premier plan (Figure 1). Leur morphologie en forme d'étoile distinc.......

Discussion

Nous décrivons ici une approche expérimentale pour obtenir des enregistrements électrophysiologiques des astrocytes, un protocole d'analyse pour isoler les courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes et une méthode mathématique pour calculer le cours du temps de jeu glutamate à partir des courants de transporteurs astrocytaires.

Le succès de l'analyse repose sur la capacité à obtenir des enregistrements de patch clamp haute qualité à partir des astrocytes et de la préci.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	Tocris	1246
(R,S)-CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 sel disodique	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX sel disodique	Tocris	1044
D,L-TBOA	Tocis	1223
Picrotoxine	Sigma	P1675
MNI-L-glutamate	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438
Électrodes matricielles	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
Capillaires en verre borosilicaté	World Precision Instruments	PG10165-4
Extracteur de micro-pipettes en verre à deux étages	Narishige	PC-10
Loctite 404 adhésif instantané	Ted Pella	46551
Lampe Xe	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics