Un test migration cellulaire quantitative pour murins de neurones entériques progéniteurs

Résumé

Nous présentons une analyse ex vivo de la migration cellulaire qui permet une quantification précise du potentiel de la migration des cellules de la crête neurale entérique en présence de divers facteurs de croissance.

Résumé

Cellules de la crête neurale (CCN) sont une population de cellules multipotentes transitoire et qui provient du tube neural dorsal et migre intensivement dans l'ensemble du développement de l'embryon des vertébrés. En plus de fournir des cellules gliales et neurones périphériques, CCN générer mélanocytes ainsi que la plupart du squelette cranio-facial. La migration et la différenciation CCN est contrôlé par une combinaison de leur origine axiale le long du tube neural et leur exposition aux signaux extracellulaires distinctes suivant les régions. Un tel apport de ligands extracellulaires est particulièrement évident au cours de la formation du système nerveux entérique (ENS), un réseau complexe interconnecté de ganglions nerveux qui commande localement (entre autres) un mouvement intestin musculaire et la motilité intestinale. La plupart de l'ENS est dérivé d'un petit groupe initial de la CCN qui entreprennent un long voyage afin de coloniser - dans un rostre à la mode caudale - toute la longueur de l'intestin prospective. Parmi plusieurs voies de signalisation connues de l'influencer entérique colonisation CCN, le GDNF / signalisation de RET est reconnu comme le plus important. En effet, la sécrétion spatio-temporelle contrôlée du ligand GDNF RET par le mésenchyme de l'intestin est le principal responsable de l'attraction et de l'orientation de RET exprimant entérique CCN et dans l'intestin embryonnaire. Ici, nous décrivons une analyse ex vivo de la migration des cellules, ce qui rend l'utilisation d'une lignée de souris transgéniques possédant CCN marqué par fluorescence, ce qui permet une quantification précise du potentiel de migration CCN entérique en présence de divers facteurs de croissance, y compris le GDNF.

Introduction

Cellules de la crête neurale (CCN) sont un type de cellule transitoire unique de vertébrés qui forme de nombreux dérivés au cours du développement de l'embryon. Cette population de cellules se présente à la frontière de la plaque neurale, à côté de l'ectoderme neural ^non-1. Au cours de la neurulation, flexion des plaques lieux neuronaux de la CCN le long de la partie dorsale du tube neural se former. CCN subit alors une transition épithéliale-mésenchymateuse, la ségrégation et la migration à partir du tube neural. CCN coloniser différentes structures embryonnaires, y compris le tube digestif où ils forment l'ensemble du système nerveux entérique (SNE), un réseau interconnecté de ganglions nerveux intégré dans la paroi intestinale. Comme l'a récemment examiné ^2,3, de nombreux gènes ont été impliqués dans le développement de cette structure complexe.

La plupart de l'ENS est dérivé d'un petit pool de NCC provenant du tube neural vagal (soit de l'ordre de la limite rhombencéphale / moelle épinière prospective) ^4.Ces progéniteurs neuronaux atteignent l'intestin antérieur autour du jour embryonnaire (e) 9.0 chez la souris, puis migrent caudalement dans le mésenchyme de l'intestin jusqu'à environ e15.0 de coloniser l'ensemble des intestins embryonnaires. Un sous-groupe mineur de cellules progénitrices neurales du côlon est également fourni par sacral CCN, qui envahissent l'intestin postérieur dans la direction opposée jusqu'à la caecum ^4. Les deux vagal et sacrée CCN exige multiples migration, la prolifération, la survie et de signaux de différenciation promotion pour assurer la formation complète de l'ENS. À cet égard, les modèles animaux - souris en particulier génétiquement modifiés - ont joué un rôle dans l'identification de plusieurs ligands extracellulaires essentielles: GDNF (glial facteur neurotrophique dérivé des cellules), l'endothéline-3, la neurotrophine-3, (protéines morphogénétiques osseuses) MPG, Netrin , ainsi que Sonic et Indian Hedgehog (Shh et Ihh) ^5-10. Parmi ceux-ci, la signalisation par le GDNF RET de récepteur transmembranaire de la tyrosine kinase (Rearranged pendant la transfection) est reconnu comme l'ee voie la plus critique pour l'attraction et la direction de la CCN et à l'intérieur de l'intestin embryonnaire. GDNF est sécrétée par le mesenchyme de l'intestin et forme un gradient spatio-temporellement rosrrocaudal contrôlé qui est directement chimio-attractifs pour entérique CCN, qui expriment RET ^11,12.

Entre autres fonctions, l'ENS règle le mouvement dans le tube digestif par son interaction avec le muscle lisse de la paroi intestinale. Absence de ganglions nerveux dans la région terminale des résultats de l'intestin dans la maladie de Hirschsprung: contraction tonique du segment affecté conduit à un blocage, l'accumulation en amont de la matière digérée et la distension massive de l'intestin et de l'abdomen. La maladie de Hirschsprung se produit environ un sur 5000 naissances vivantes. Le motif de la migration rostro-caudale de entérique CCN est considéré comme le principal facteur contribuant à l'étiologie de la maladie de Hirschsprung. Le côlon, le plus éloigné de la source de migration NCC et dernière partie de bowel être colonisé, est le plus sensible à des défauts dans la formation ENS. Conformément à son rôle crucial dans la migration CCN entérique, la perturbation de la signalisation GDNF / RET est la principale cause génétique connue de la maladie de Hirschsprung ^13.

Pour mieux étudier la CCN et le développement de l'ENS, nous avons généré une lignée de souris transgénique - nommé Gata4p [5 kb]-GFP ¹⁴ - dans laquelle migratoire CCN sont marquées avec la protéine fluorescente verte (GFP). On a ensuite mis au point un test ex vivo de la migration cellulaire, adapté de travaux publiés par d'autres groupes ^11,12,15, qui permet une quantification précise maintenant le potentiel de migration CCN entérique en présence de divers facteurs de croissance, tels que le GDNF.

Protocole

Déclaration éthique

Des expériences sur des souris ont été effectuées après les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux pour le soin et la manipulation des animaux utilisés dans la recherche médicale. Protocoles impliquant la manipulation d'animaux ont été approuvés par le comité d'éthique institutionnels de l'Université du Québec à Montréal (Comité Institutionnel de Protection des Animaux; numéro de référence 0512-R3-650-0513).

Une. Préparation de collagène Gels

Travailler de manière stérile, sous une hotte de culture de tissus.

1. Préparer complète 5x DMEM (milieu essentiel modifié Eagle) y compris les antibiotiques standard. Dissoudre 3,37 g de poudre DMEM et 0,925 g de NaHCO ₃ dans 20 ml d'eau. Stériliser par passage à travers un filtre de 0,22 um. Ajouter 2,5 ml de 100x stérile de pénicilline / streptomycine et de 25 ml de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur stérile. Stocker à 4 ° C.
2. Sur la glace, mélanger 800 pisolution de collagène I (3,77 mg / ml dans 0,02 N d'acide acétique, stérilisée par filtration), 600 ul de DMEM complet 5x et 17 ul de 1 N NaOH. Diluer avec de l'eau stérile jusqu'à un volume final de 3 ml. Inclure des facteurs de croissance pertinentes dans le mélange. Nous utilisons généralement GDNF à 10 ng / ml pour stimuler la migration CCN entérique.
3. Dépôt d'environ 480 pi dans chaque puits d'une seule ligne dans une plaque de 24 puits. Éviter les bulles. Les lignes restantes peuvent être utilisées pour tester l'effet d'autres facteurs de croissance sur la migration cellulaire.
4. Laissez le collagène polymériser au moins 1 h dans un incubateur stérile à 37 ° C.

2. Dissection des animaux ¹⁶

1. Mettre en place des accouplements et vérifier bouchon vaginal le lendemain matin. 0,5 ME de jour étant midi le jour du bouchon vaginal est trouvé, isoler la femelle et attendre 12 jours jusqu'à ce que E12.5.
2. Anesthésier les souris enceinte avec de l'isoflurane et l'euthanasie par inhalation de CO _2.
3. Pulvériser la souris avec 70% d'éthanol. Soulevez les s abdomenparents et ouvrir la cavité de l'abdomen avec des ciseaux de dissection.
4. Retirer l'utérus dans une boîte de Pétri en verre rempli avec du PBS glacé (solution saline tamponnée au phosphate). Couper l'utérus transversalement entre gonflements deciduum individuels d'isoler chaque site d'implantation de l'embryon.
5. Les travaux sur chaque site d'implantation séparément dans une autre boîte de Pétri en verre rempli de PBS glacé. Sous un microscope de dissection, utiliser une pince fine pour enlever la couche musculaire de l'utérus.
6. Ouvrez le sac jaune viscérale et l'amnios de révéler l'embryon. Faites attention lorsque vous couper les vaisseaux sanguins se joindre à l'embryon au placenta / viscérale jaune sac, car ils sont étroitement liés avec les intestins en développement.
7. Couper la tête de l'embryon au niveau du col.
8. Insérez une pince fermés dans la cavité abdominale d'un embryon, juste au-dessus du foie de couleur rouge foncé et laisser la pince ouverte d'elle-même (cesser d'appliquer la pression) pour faire une ouverture transversale dans la cavité de l'abdomen. Tirez les pinces ouvertes vers le basl'extrémité postérieure de l'embryon pour ouvrir l'abdomen complètement.
9. Prenez le tissu conjonctif derrière le foie et tirer les tripes de l'abdomen, en faisant attention de ne pas casser les intestins (colon est attaché à l'anus).
10. Couper le côlon pour libérer les entrailles du reste de l'embryon. La coupe peut être effectué à n'importe quel endroit le long du côlon. Réserver la partie de queue de côté.
11. Démêler le tissu conjonctif du caecum, puis le reste de l'intestin. Faites attention de ne pas blesser les intestins en le faisant.
12. Couper le foie et l'estomac (à l'extrémité rostrale de l'intestin grêle), ainsi que le mésonéphros et crêtes génitales si certains sont présents.
13. Isoler l'intestin grêle. Encore une fois, attention à ne pas étouffer l'intestin. A partir de maintenant, l'orientation rosrrocaudal du tissu intestinal peut être suivi à l'aide de la forte courbure présente sur l'extrémité rostrale. Laissez l'intestin grêle dans du PBS à température ambiante pendant un temps aussi court que possible avant de luiliterie (voir l'étape 3.3).
14. Enfin, notez le numéro de la queue somites pour chaque embryon de déterminer avec précision le stade de développement embryonnaire.

3. Sectionnement de embryonnaires intestins

1. Avant de procéder à la dissection de l'embryon, faire fondre 1,5 g d'agarose dans 100 ml de PBS (solution saline tamponnée au phosphate) et maintenir à 50 ° C.
2. Verser fondu agarose dans un moule intégration (par exemple, un fermé 2 ml microtube qui a été coupé sur la longueur d'exciser environ 1/4 de la paroi du tube). Laissez refroidir l'agarose à environ 42-45 ° C, il devrait être que légèrement chaude au toucher.
3. Incluez l'intestin embryonnaire juste avant la solidification d'agarose (ce qui peut être évaluée à l'aide de forceps conseils et se fera autour de 36-38 ° C). La tenue de l'intestin avec une pince par l'extrémité rostrale pliée, le tirer très lentement à travers l'agarose long de la longueur du moule. Cela aide à garder l'intestin droite tandis que les ensembles d'agarose. Relâchez le témettre dès qu'elle commence à résister à être déplacé. Gardez une trace de l'orientation de la rostrale-caudale de l'intestin.
4. Mettez le moule au réfrigérateur 2-3 minutes, afin d'assurer la gélose a complètement réglée.
5. Sortir le agarose à partir du moule (en le faisant glisser hors du tube Eppendorf ouvert). Avec une lame, retirer l'excédent d'agarose à ses deux extrémités, des coupes perpendiculaires à l'intestin.
6. Collez l'extrémité rostrale de l'intestin / agarose bloquer sur le stade du métal d'un microtome à lame vibrante. Couper l'excédent d'agarose sur les côtés du bloc intestin / d'agarose.
7. Monter la phase métallique sur la chambre de microtome vibrant. Si nécessaire, ajuster l'angle de la scène si l'intestin est aussi vertical que possible (donc perpendiculaire à la lame). Couvrez le spécimen avec PBS glacé. Amener la lame de microtome vers le bas à quelques millimètres sous la surface du tampon.
8. Faire 200 um vibratome coupes transversales de l'intestin caudal le plus petit, veiller à ce que ehaque tranche d'agarose contient une section complète intestinale.

4. Culture de Intestinal explants

1. Déposer délicatement les tranches intestin / d'agarose fraîchement coupées à plat sur les gels de collagène avec une pince, placer une tranche vers le milieu de chaque puits.
2. Incuber 3 jours à 37 ° C, dans un environnement humide de 5% de CO _2, atmosphère, pour permettre la migration du CCN sur l'explant.
3. Prendre les tranches intestin / d'agarose le gel de collagène très doucement avec une pince. Prenez soin de ne pas endommager le gel ci-dessous.
4. Éviter de toucher le gel de collagène directement au cours de l'incubation et de lavage des étapes ultérieures, afin de s'assurer que le motif de la migration des cellules ne soit pas perturbé. Fixer avec 500 pl de 4% de PFA (paraformaldéhyde) (dans du PBS) par puits 1 heure à température ambiante.
5. Remplacer le fixateur avec 500 ul de DAPI (4 ',6-diamidino-2-phénylindole) solution (5 ug / ml dans du PBS) par puits et incuber 10 min à température ambiante.
6. Laver chaque puits 3xavec 500 ul de PBS pendant 5 min.
7. Photographier les cellules fluorescentes (canaux de GFP et DAPI) incorporés dans le gel de collagène à l'intérieur de chaque puits.

5. Analyse de l'image

Nous avons fait un usage intensif de ImageJ ¹⁷ pour traiter et quantifier les images générées après culture des explants.

1. Commencer par l'imagerie d'un coulisseau de micromètre au même grossissement que les photographies de cellules fluorescentes. Mesurer la longueur du micron en pixels (en utilisant l'outil de ligne droite).
2. Définissez l'échelle (Analyser / Set échelle, le nombre d'entrée de pixels / micron).
3. Pour chaque photographie de fluorescence de la GFP, changer le format de l'image en niveaux de gris de 8 bits (Image/Type/8-bit).
4. Réglez l'intensité du signal (image / Réglage / Luminosité / Contraste).
5. Soustraire le bruit de fond si nécessaire (processus / Soustraire fond; ajuster le rayon de roulement à billes).
6. Fixer un seuil de mettre en évidence les cellules et les amas de cellules (image / Réglage / Seuil), len appliquer un bassin versant à diviser les touffes (Process / binaire / bassins versants).
7. Analyser des particules de préciser les régions d'intérêt (ROI) et de générer des statistiques de nombre de cellules (Analyser / analyser des particules; ensemble taille minimale pour exclure les pixels restants).
8. Définir les options de mesure d'inclure le diamètre de Feret (Analyser / Mesures Set).
9. Groupe ROI et mesurer dans son ensemble pour déterminer le diamètre de la Feret, une indication de la propagation des cellules (Analyser / Outils / Gestionnaire de ROI / Plus / OU, puis Directeur ROI / Ajouter, et directeur de ROI / Mesure).

Résultats

Les résultats suivants sont représentatifs de ce qui peut être obtenu avec la technique décrite ici (figure 1). L'utilisation de facteurs de croissance (c.-à-GDNF) stimule la migration de la GFP exprimant entérique CCN rupture de l'explant intestinal et dans le gel de collagène (figure 2). Bien que certaines cellules sortent de l'explant en l'absence de facteurs de croissance, ceux-ci sont pour la plupart pas GFP-étiqueté et représentent entrée passive. Il est nécessaire d'enle...

Discussion

Nous montrons comment notre ex vivo technique de culture des explants peut être utilisé pour quantifier précisément le potentiel de migration entérique CCN en présence de GDNF. Une telle quantification précise est grandement facilitée par l'utilisation de 200 sections vibratome intestinale um d'épaisseur à la place de grands morceaux de la taille approximative, comme décrit précédemment ^11,12,15. En effet, cela nous permet de travailler avec un nombre raisonnable de cellules dans un cadre hau...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM en poudre	Wisent	219-010-XK	;
NaHCO3	Bioshop	SOB999
Système de filtration sous vide Steriflip de qualité biotechnologique (0,22 micron)	EMD Millipore	SCGP00525	;
solution de péniciline-streptomycine, 100x	Wisent	450-201-EL&	nbsp ;
Sérum fœtal bovin	Wisent	095-150	haute qualité
I	BD biosciences	354236	;
NaOH	Bioshop	SHY700	Dilué à partir de 10 N puis filtré stérilement
GDNF	Cedarlane	CLCYT305	;
Falcon 24 puits Plate	BD biosciences	353047	;
Ciseaux de dissection	Fisher Scientific	089515
Boîte de Pétri en verre	VWR	89000-306	;
PBS	Sigma	P5493	Microscope de dissection de culture cellulaire
	Leica	M125	;
Dumont #5 Pince	outils pour les sciences fines	11251-20	;
Agarose	Bioshop	AGA001	Lame chirurgicale de qualité biotechnologie
	Feather	21	;
Stylo à colle Krazy instantanée tout usage Colle	Krazy	KG824	;
HM 650V Microtome à lame vibrante	Thermo Scientific	920110	;
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148	;
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564	;
Tableau des réactifs et équipements spécifiques.