Method Article

Identification à base de microréseaux de HERV individuelle Loci Expression: Demande de Découverte de biomarqueurs dans le cancer de la prostate

DOI:

10.3791/50713

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November 2nd, 2013

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1Joint Unit Hospices de Lyon-bioMérieux, 2Medical Diagnostic Discovery Department, BioMérieux, 3Department of Pathology and Cytology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 4Medical Faculty, Lyon 1 University, 5Data and Knowledge Laboratory, BioMérieux, 6Department of Biochemistry and Molecular Biology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 7Department of Urology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon

In This Article

Summary

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Rétrovirus endogènes humains (HERV), qui occupent 8% du génome humain, conservent les capacités de codage rares mais une centaine de milliers de longues répétitions terminales (LTR). Une coutume Affymetrix microarray a été conçu pour identifier les individus expression du locus HERV et a été utilisé sur les tissus de cancer de la prostate comme une preuve de concept pour de futures études cliniques.

Abstract

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L'antigène spécifique de la prostate (PSA) est le principal biomarqueur pour le diagnostic du cancer de la prostate dans l'utilisation clinique, mais il manque de spécificité et de sensibilité, en particulier dans les valeurs à faible dosage 1. «Comment utiliser PSA" reste une question d'actualité, que ce soit pour le diagnostic comme une zone grise correspondant à une concentration dans le sérum de 2,5-10 ng / ml, ce qui ne permet pas une différenciation claire soit établie entre le cancer et non cancéreuse 2 ou pour le suivi des patients -comme l'analyse de PSA post-opératoire paramètres cinétiques peuvent poser des défis considérables pour leur application pratique 3,4. Autrement, les ARN non codantes (ARNnc) apparaissent comme des molécules clés dans le cancer humain, avec le potentiel de servir de nouveaux marqueurs de la maladie, par exemple PCA3 pour le cancer de la prostate 5,6 et de révéler des aspects non caractérisées de la biologie de la tumeur. Par ailleurs, les données du projet ENCODE publiée en 2012 a montré que les types d'ARN différentes couvrent environ 62% de la générationome. Il apparaît également que la quantité de motifs de régulation de transcription est d'au moins 4,5 x plus élevé que celui correspondant aux exons codant pour des protéines. Ainsi, les longues répétitions terminales (LTR) de retrovirus endogènes humains (HERV) constituent une vaste gamme de putative / candidats de séquences régulatrices de la transcription, comme il est de leur fonction primaire dans retrovirus infectieux. HERVs, qui sont répartis dans l'ensemble du génome humain, proviennent d'infections ancestrales et indépendantes au sein de la lignée germinale, suivis par des processus de propagation de copier-coller et menant à MultiCopy familles occupant 8% du génome humain (noter que les exons couvrent 2% de notre génome ). Certains loci HERV encore exprimer des protéines qui ont été associés à de nombreuses pathologies, dont le cancer 7-10. Nous avons conçu une puce à haute densité, en format Affymetrix, visant à caractériser de manière optimale individu expression HERV loci, afin de mieux comprendre si elles peuvent être actives, s'ils conduisent ncRNA transcription ou modulate codant l'expression du gène. Cet outil a été appliquée dans le domaine du cancer de la prostate (Figure 1).

Introduction

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Rétrovirus endogènes humains (également appelés HERVs) sont répartis tout au long de notre génome. Ils proviennent d'infections ancestrales et indépendantes au sein de la lignée germinale, suivis par des processus de propagation de copier-coller et menant à des familles à copies multiples. Aujourd'hui, ils ne sont plus infectieux mais ils occupent 8% du génome humain, comme un point de comparaison, les exons couvrent 2% du génome humain. Les données du projet ENCODE publiée en 2012 a montré que les types d'ARN différentes couvrent environ 62% du génome, dont un tiers dans les régions intergéniques. En outre, il apparaît que la quantité de motifs de régulation de transcription est d'au moins 4,5 x plus élevé que celui correspondant aux exons codant pour des protéines. HERV répétitions terminales longues (LTR) représentent une large gamme d'éléments de régulation de transcription potentiels, comme il est habituel dans leur fonction retrovirus infectieux. Historiquement, en dehors de quelques loci exprimé dans le placenta ou des testicules, il était communément admis que HERV sont silencieux du fait de epréglementation igenetic. Par conséquent, nous avons conçu une puce à haute densité, en format Affymetrix, visant à caractériser de manière optimale individu expression HERV loci, afin de mieux comprendre si elles sont actives, s'ils conduisent lncRNA transcription ou modulent l'expression des gènes codant. Cet outil baptisé HERV-V2 intègre GeneChip 23583 probesets HERV et peut discriminer 5573 éléments HERV distinctes composées de LTR solo ainsi que provirus complets et partiels (figure 2).

Diagnostic, évaluation et plan:

Le diagnostic du cancer de la prostate sont basées sur le dosage de l'antigène spécifique de la prostate (PSA), de biomarqueurs dans les laboratoires cliniques, un examen rectal numérique d'évaluer la modification morphologique de la prostate et, enfin, des biopsies de la prostate observés par le pathologiste. Le manque de spécificité et une sensibilité suffisante entre les marqueurs biologiques du cancer classiques, tels que PSA pour le cancer de la prostate, a été largement reconnu after plusieurs décennies d'implications cliniques 1. Dans un premier temps, le PSA a été proposée pour le diagnostic et le traitement de l'adénocarcinome de la prostate 11. Il était dernier a proposé pour le dépistage du cancer et le suivi de l'évolution de la maladie 12. Cependant, il reste une question qui est régulièrement posée: «Comment utiliser PSA. (I) Une zone grise correspondant à une concentration dans le sérum de 2,5-10 ng / ml ne permet pas une nette différence à faire entre le cancer et non cancéreuse 2, (ii) deux grandes études de cohorte inscrire des centaines de milliers de personnes en Europe et USA n'a pas réussi à venir à une conclusion claire sur l'utilité du dépistage en termes de mortalité spécifique de la maladie 13,14; (iii) l'analyse de PSA paramètres cinétiques post-opératoires telles que la clairance de la PSA, PSA vitesse et le temps de doublement, bien que simple en théorie, peut poser des défis considérables dans l'application pratique de 3,4. On peut s'attendre à ce que dans les prochaines années, l'application de biomarqueurscations soutiendront un choix clinique entre l'attente vigilante et plus ou traitements moins agressifs selon phénotype tumoral. En ce qui concerne le diagnostic rendu par le pathologiste, un premier facteur limitant vient d'un diagnostic de faux négatifs de 20% dans les biopsies de la prostate (de nombreux cancers sont manqués par échantillonnage). Une deuxième préoccupation porte sur la nécessité d'une procédure de biopsie supplémentaire suivant une valeur négative, ce qui peut présenter des effets indésirables.

La prostatectomie radicale est actuellement l'un des traitements standard du cancer de la prostate. Il est proposé dans les patients en bonne santé, le vieillissement de 45 à 65 ans, en particulier dans le cas de motifs agressifs (Gleason 7-10), d'une tumeur ou d'une tumeur palpable multifocale. C'est maintenant chose faite dans notre département en utilisant la chirurgie assistée par robot. En raison de l'évidence croissante que les marqueurs moléculaires auront une importance capitale dans les années à venir, nous avons décidé de proposer à tous nos patients la possibilité de participer à un programme pour la prostatebanques de tissus. Plus précisément, les programmes de recherche moléculaire expansion sur le cancer de la prostate ont donné lieu à une demande croissante pour l'accès aux tissus tumoraux frais de haute qualité à partir de pièces de prostatectomie. Cette recherche, en particulier les approches génomiques, nécessaire de larges échantillons de haute qualité de l'ADN / ARN. Tumoraux et les tissus adjacents non-tumoraux »'à partir du même patient sont nécessaires. Recommandations pour la manipulation et le traitement des prostatectomies radicales visent à préserver les caractéristiques pathologiques qui déterminent la scène et le statut des marges et ainsi le potentiel autre traitement et le pronostic. Toute méthode de prélèvement de tissus frais, par conséquent, ne devrait pas compromettre les évaluations pathologiques ultérieures afin d'être acceptable pour le diagnostic. Dissection macroscopique de la prostate est difficile et une grande attention doit être accordée aux tissus de marge et l'invasion capsulaire: une dissection de la prostate bancaire doit toujours être effectuée par un uropathologist formé selon un accordd protocole. Le comité d'éthique de la faculté de médecine et de la commission médicale de l'Etat a accepté de ces enquêtes et le consentement éclairé a été obtenu pour tous les patients inclus dans le tissus de la prostate bancaire.

Protocol

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Une. Chirurgie

Une fois enlevé par le chirurgien, garder la prostate sur la glace jusqu'à la prise en charge par un médecin.

2. Manipulation de la prostate tissus

  1. Pour respecter le délai de l'ischémie périopératoire, transférer pièces de prostatectomie radicale sur la glace au laboratoire par un personnel dévoué dans les 30 minutes après l'ablation chirurgicale. Le retard de gel devrait être inférieur à 20 à 30 min (Figure 3A).
  2. Peser et tacher la prostate selon le protocole habituel (par exemple vert sur ​​le côté droit, noir sur le côté gauche, voir les figures 3B et 3C).
  3. Effectuer une grande section transversale de la glande sur le côté postérieur (Figure 3D). Orientez la prostate et le mettre sur le côté antérieur. Effectuer une grande section transversale de la glande du côté postérieur avec un bistouri stérile.
  4. Disséquer des morceaux de tissu sur la zone de transition,sur les zones périphériques gauche et droite, en laissant intact les bords (figure 3E).
  5. Mettez les carottes de tissu dans un tube Eppendorf, snap gel et magasin dans l'azote liquide (figure 3F). Si vous ne faites pas biobanque de passer directement à l'étape 2.7.
  6. Effectuer prostate bancaire uniquement si la longueur totale du cancer sur des biopsies est supérieure à 10 mm. Utilisez un fil de suture pour fermer la prostate et d'éviter des distorsions glande et une perturbation minimale de la marge chirurgicale (figure 3G). Ensuite, fixer la pièce de prostatectomie radicale avec le formol et incorporer dans de la paraffine selon la procédure habituelle pour l'analyse histologique.
  7. Montez noyaux de tissus congelés verticalement sur un petit monticule de PTOM et faire des sections dans un cryostat. Prenez une première section congelé unique de 5 um et tacher avec le bleu de toluidine.
  8. Procéder à un examen histologique rapide d'analyser la nature du tissu (c'est à dire. Bénigne ou maligne). Pour tumoraletissu, estimer la quantité de cellules tumorales et de ne sélectionner que les noyaux avec plus de 80% des cellules tumorales.
  9. Par la suite, procéder à une nouvelle coupe congelée unique de 5 um et teindre à l'hématoxyline, éosine et Safran. Ensuite, coupez 15 sections x 30 um et le placer dans un tube sans RNAse Eppendorf.
  10. Prenez une dernière section gelée de 5 um pour hématoxyline, éosine et Safran et tacher de contrôler la quantité de cellules tumorales à la fin de la procédure.
  11. Placer le tube Eppendorf dans la glace sèche et envoyer l'échantillon au laboratoire de biologie moléculaire.

3. Extraction de l'ARN, purification et contrôle de la qualité

  1. Homogénéisation. Effectuer une homogénéisation en présence de 1 ml de Trizol/100 mg de tissu jusqu'à ce que le tissu est complètement dissous dans la solution. Ajouter solution Trizol progressivement et procéder avec précaution sur la glace à l'aide d'un broyeur à main. Une fois homogénéisée, la solution aliquoter dans des tubes Eppendorf et laisser au Trizol à température ambiante pendantCinq minutes.
  2. La séparation des phases. Ajouter 300 ul de chloroforme (ou 150 pi BCP/1.5 ml Trizol). Vortex 15 secondes puis laisser à température ambiante pendant 2-3 min. Centrifuger à 12 000 g pendant 15 min à 2-8 ° C.
  3. précipitation de l'ARN. Transférer soigneusement la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. Ajouter 750 ul isopropanol. Incuber à température ambiante pendant 10 min (agiter par inversion). Incuber 2 heures à -19 ° C/-31 ° C. Centrifuger les échantillons à 12 000 g pendant 30 min à 2-8 ° C.
  4. lavage de l'ARN et de la suspension. Après centrifugation, éliminer le surnageant. Laver culot d'ARN avec 1 ml 80% EtOH (inverser doucement les tubes). Centrifuger les échantillons à 7500 g pendant 10 min à 2-8 ° C. Retirer le surnageant à l'aide P1000 et P10. Autoriser restant EtOH sécher à l'air pendant 2-3 min. Ajouter 100 l'eau sans RNase-pi, tubes de transfert à 70 ° C bloc de feu et laisser reposer pendant 2-3 min pour dissoudre la pastille. Ensuite, mettre sur la glace. Conserver à -19 ° C/-31 stockage ° C pendant à court terme et -80 ° C pour une conservation à long terme.
  5. la purification de l'ARN. Purifier l'ARN en utilisant le kit RNeasy Mini (Qiagen). En bref, commencez par ajouter 350 ul RLT tampon de l'échantillon d'ARN de 100 pi et bien mélanger, puis suivez la procédure Qiagen. Enfin, prendre un pi 3 (sur 50 pi) aliquote du produit purifié pour les contrôles de qualité (étape 3.6). ARN de magasin à -19 ° C/-31 ° C pendant une période à court terme ou à -80 ° C pendant un stockage à long terme.
  6. QC ARN (Figure 4A). Vérifiez la qualité de l'ARN et de l'intégrité de l'ARN en utilisant une Bioanalyzer (Agilent) et un Nanodrop (Thermo), selon les instructions du fabricant. Le numéro de l'intégrité de l'ARN (RIN) est utilisé pour évaluer la qualité de l'ARN. En particulier, réussir dans la détection de 18S et 28S pics est fortement recommandé d'utiliser les échantillons à de nouvelles mesures.

4. WT-Ovation RNA Amplification

Recommandations pour effectuer les étapes d'amplification en utilisant le WT-Ovation kit d'amplification dans des conditions optimales:

  • Exécutez pas moins de huit échantillons d'amplification à la fois pour assurer la précision de pipetage. Ensuite, compte pour 1 volume de déchets lors de la préparation de mélanges maîtres qui nécessitent un fractionnement du kit en 3 lots de 8 réactions.
  • Toujours garder réactifs décongelés et tubes de réaction sur de la glace à moins d'indication contraire.
  • Utilisez uniquement une solution d'éthanol à 80% frais pour la purification.
  • Ne pas s'arrêter à n'importe quelle étape du protocole.

  1. Diluer l'ARN total pour obtenir une concentration de 25 ng / ul. Traiter 2 pl de l'échantillon dilué.
  2. Préparer la solution de Poly-A-ARN pic dans le contrôle par une dilution en série de l'ARN poly-A avec Stock Poly-A Dilution Buffer contrôle (Affymetrix), pour obtenir une dilution 1:25.000.

    Étape 1: First Strand cDNA Synthesis 4,3 à 4,8. Les réactifs mentionnés sont désignés par le fournisseur comme suit: A1 (First Strand Primer Mix), A2 (First Strand Buffer Mix), A3 (First Strand Enzyme Mix).

  3. Décongeler A1 et A2 à la température ambiante. Mélanger à l'aide d'un mélangeur à tourbillon pendant 2 secondes et de spin pendant 2 secondes. Ensuite, placer rapidement sur la glace. Placez A3 sur la glace.
  4. Ajouter 2 ul d'ARN total (50 ng) dans un tube PCR de 0,2 ml et ajouter 2 ul de A1 (volume final: 4 ul). Cap et tourner le tube pendant 2 secondes.
  5. Incuber à 65 ° C pendant 5 min, puis placer le tube sur la glace.
  6. Préparer le premier brin d'ADNc Master Mix comme suit (donné pour une seule réaction). Mélanger à la pipette et centrifuger brièvement Master Mix. Immédiatement, placer sur la glace.
    Réactif Volume
    First Strand Buffer Mix (A2) 5 pl
    Poly-A contrôle l'ARN (1:25,000) 0,5 pl
    First Strand Enzyme Mix (A3) 0,5 pl
  7. Ajouter 6 & #181; l du Master Mix à l'/ tube contenant de Primer-ARN. Mélanger en tapotant le tube, rotation pendant 2 secondes et placer rapidement sur de la glace (volume final: 10 pi).
  8. Incuber à 4 ° C pendant 1 min, puis 25 ° C pendant 10 min, puis 42 ° C pendant 10 min, puis 70 ° C pendant 15 min. Conserver à 4 ° C. Retirez le tube de réaction de cycleur thermique, centrifuger brièvement et garder sur la glace. Continuer immédiatement à l'étape Deuxième Strand cDNA Synthesis.

    Étape 2: Deuxième Strand cDNA Synthesis 4,8 à 4,12. Les réactifs mentionnés sont désignés par le fournisseur comme suit: B1 (deuxième Strand Buffer Mix) et B2 (deuxième Strand Enzyme Mix).

  9. Isoler B2 et B3 pendant 2 secondes et rapidement placer sur la glace. Décongeler B1 à température ambiante. Mélanger à l'aide d'un mélangeur à tourbillon pendant 2 secondes, rotation pendant 2 secondes et rapidement placer sur la glace.
  10. Préparer un deuxième Master mix comme suit (donné pour une seule réaction). Mélanger à la pipette et provoque l'arrêt du brie Master Mixvoler. Immédiatement, placer sur la glace.
    Réactif Volume
    Deuxième Strand Buffer Mix (B1) 9,75 pi
    Deuxième Strand Enzyme Mix (B2) 0,25 pi
  11. Ajouter 10 ul du mélange maître dans chaque tube de réaction du premier brin. Mélanger à la pipette 3x, rotation pendant 2 secondes et placer sur la glace (volume final: 20 pi).
  12. Incuber à 4 ° C pendant 1 min, puis 25 ° C pendant 10 min, puis 50 ° C pendant 30 min, puis 70 ° C pendant 5 min. Conserver à 4 ° C. Retirez le tube de réaction de cycleur thermique, centrifuger brièvement et garder sur la glace. Continuer immédiatement à l'étape post-Deuxième volet de mise en valeur.

    Étape 3: Post-Deuxième volet de mise en valeur de 4,13 à 4,15. Les réactifs mentionnés sont désignés par le fournisseur comme suit: B1 (deuxième Strand Buffer Mix), B3 (Réaction amélioration Enzyme Mix).

  13. Préparer un Master Mix en combinant B1 et B3 Mix comme suit (donné pour une seule réaction). Mélanger à la pipette et centrifuger brièvement Master Mix. Immédiatement, placer sur la glace.
    Réactif Volume
    Deuxième Strand Buffer Mix (B1) 1,9 pl
    Réaction amélioration Enzyme Mix (B3) 0,1 pl
  14. Ajouter 2 ul du mélange maître dans chaque tube de réaction deuxième brin. Mélanger à la pipette 3x, rotation pendant 2 secondes et placer sur la glace (volume final: 22 pi).
  15. Incuber à 4 ° C pendant 1 min, puis 37 ° C pendant 15 min, puis 80 ° C pendant 20 min. Conserver à 4 ° C. Retirez le tube de réaction de cycleur thermique, centrifuger brièvement et placer sur la glace. Continuer immédiatement à l'étape AISP amplification.

    Étape 4: Simple brin d'ADNc (ADNc-mc) synthèse par procédure AISP de 4.16 -4.19. Les réactifs mentionnés sont désignés par le fournisseur comme suit: C1 (AISP Primer Mix), C2 (AISP tampon Mix), C3 (AISP Enzyme Mix).

  16. Décongeler le C1 et C2 à la température ambiante. Mélanger à l'aide d'un mélangeur à tourbillon, rotation pendant 2 secondes et placer rapidement sur la glace. Décongeler C3 sur la glace. Mélanger le contenu en retournant doucement 5x. Assurez-vous de ne pas introduire de bulles d'air. Ensuite, tourner pendant 2 secondes et placer sur la glace.
  17. Préparer une AISP-Master Mix, ce qui représente un volume de 0,5 déchets, comme suit. Mélanger à la pipette et centrifuger brièvement Master Mix. Immédiatement, placer sur la glace.
    Réactif Volume
    AISP-tampon Mix (C2) 5 pl
    AISP-Primer Mix (C1) 5 pl
    AISP-Enzyme Mix (C3) 10 pl
  18. Ajouter 20 ul de la SPIA Master Mix à la Enhanced deuxième brin réaction tube. Mélanger à la pipette 6-8x, rotation et placer rapidement sur de la glace (volume final: 42 pi).
  19. Incuber à 4 ° C pendant 1 min, puis 47 ° C pendant 60 min, puis 95 ° C pendant 5 min. Conserver à 4 ° C. Retirer le tube du cycleur thermique, centrifuger brièvement et placer sur la glace.

5. ADNc-mc purification et contrôle de la qualité

  1. ADNc-mc purification. Purifier ADNc-mc en utilisant le kit de purification QIAquik PCR (Qiagen). Brièvement, commencer par l'ajout de 200 pl de tampon PB pour les 42 ul d'ADNc amplifié produit, de mélange et de la charge sur la colonne. Ensuite, suivez la procédure Qiagen. Enfin, prendre un pi 3 (sur 30 pi) aliquote du produit purifié ADNc-mc pour les contrôles de qualité (étape 5.2).
  2. ADNc-mc rendement et la vérification de la distribution de la taille (figure 4B). Vérifiez rendement ADNc-mc et la distribution de taille en utilisant un Bioanalyzer et un Nanodrop, selon les instructions du fabricant. La taille de la distribution de l'ADNc amplifiés devrait be typiquement comprise entre 100 et 1500 bases de long avec un pic autour de 600 bases.

6. ADNc-mc fragmentation

  1. Préparer 2 pg d'ADNc dans 30 ul, de régler le volume avec de l'eau exempte de nucléase.
  2. Préparer 1x One-Phor-All tampon PLUS (OPA), à partir d'un tampon 10x PLUS OPA solution.
  3. Préparer 0,2 U / pl de DNase I (dilution de 5 fois de 1 U / pl de DNase I).
  4. Préparer une fragmentation Master Mix comme suit (donné pour une seule réaction):
    Réactif Volume
    Une 10X-Phor-All tampon PLUS 3,6 pl
    DNase I (0,2 U / pl) 3 pl
  5. Ajouter 6,6 ul de fragmentation Mix à 30 pi de ADNc-mc.
  6. Spin et incuber à 37 ° C pendant 10 min, puis inactiver la DNase I à 95 ° C pendant 10 min et garder sur la glace. Aliquote de 1 &# 181; l de l'ADNc fragmentée pour la vérification de la distribution de taille en fonction Agilent.
  7. ADNc-mc vérification de la distribution de la taille (figure 4C). Vérifiez la distribution de taille en utilisant un ADNc-mc Bioanalyzer (Agilent). La distribution de la taille de l'ADNc doit être fragmenté typiquement comprise entre 35 et 200 bases.

7. Étiquetage des fragmenté ADNc-mc

  1. Diluer le DLR-1a 7,5 mM à 5 mM dans de l'eau DEPC.
  2. Préparer un Master Mix étiquetage comme suit (donné pour une seule réaction):
    Réactif Volume
    5x TdT Reaction Buffer 14 pi
    CoCl 2 (25 mM) 14 pi
    DLR-1a (5 mM) 1 pl
    Transferase terminale (400 U / pl) 4,4 pl
  3. Ajouter 33,4 pi du mélange de l'étiquetagepour chaque échantillon d'ADNc fragmenté.
  4. Mélanger en tapotant le tube, centrifuger brièvement et incuber à 37 ° C pendant 60 min, puis continuer sur la glace.

8. L'hybridation de puces à ADN pour le HERV Chip

  1. Pré-imbibé la GeneChip HERV avec 200 pi de mélange de pré-hybridation (Affymetrix) et incuber à 50 ° C, 60 rpm, pendant 10 min.
  2. Préparer le mélange d'hybridation comme suit (donné pour une seule réaction):
    Réactif Volume
    Contrôle Oligo B2 (3 nM) 3,3 pl
    20x eucaryote contrôle hybridation 10 pl
    L'hybridation 2x Mix 100 pl
    99,9% de DMSO 17,7 pi
  3. Ajouter 131 ul de mélange d'hybridation à 69 ul d'ADNc fragmenté et marqué à la température ambiante de faire une vo finalelume de 200 pi.
  4. Mélanger et dénaturer pendant 2 min à 95 ° C, puis incuber à 50 ° C pendant 5 min et centrifugation à vitesse maximale pendant 5 min.
  5. Vider le HERV GeneChip préalablement mouillée et charger la préparation de cible de 200 pi. Appliquer difficiles taches sur les deux cloisons.
  6. S'hybride à 50 ° C, 60 tours par minute, pendant 18 heures.
  7. Après 18 heures, vider le GeneChip HERV et stocker la solution d'hybridation collecté à 4 ° C. Remplir le tableau de la sonde avec 250 pi de tampon de lavage A. Si les puces ne sont pas exécutés immédiatement sur la fluidique, stockées à 4 ° C.

9. Lavage et coloration

  1. Exécutez les Fluidics de la barre de menu du SMOC. Dans la boîte de dialogue Fluidics, sélectionnez la station d'intérêt (1 - 4), puis sélectionnez Shutdown_450 pour tous les modules, puis exécutez. Plongez-les 3 fluidique lignes d'aspiration dans l'eau Milli-Q. Suivez les instructions à l'écran LCD.
  2. Appliquer le programme Prime_450 à tous les modules. Placez le tuyau pour le tampon de lavage A dansun flacon contenant 400 ml de tampon de lavage A, et l'autre pour le tampon de lavage B dans un flacon contenant 200 ml de tampon de lavage B. Puis, suivez les instructions à l'écran LCD.
  3. Soulevez les aiguilles et placer 600 pi tache cocktail 1 (SAPE Solution Mix) et 600 pi tache cocktail 2 (solution d'anticorps Mix) contenant des microtubes à des positions # 1 et # 2, et 800 tableau ul contenir une solution tampon à la position # 3 .
  4. Attribuer le droit puce à chaque module, sélectionnez le protocole FS450-004 et exécuter chaque module, en suivant les instructions à l'écran.

10. Numérisation

  1. Faire chauffer le scanner GS3000. Il est prêt à numériser lorsque le feu passe au vert.
  2. Appliquer difficiles taches sur les cloisons pour éviter les fuites, puis charger la puce dans le chargeur automatique ou bien directement dans le scanner. Lancer la numérisation.
  3. Après la numérisation de la puce. Fichiers cel sont générés. Vérifiez l'image et aligner la grille de la place pour identifier les cellules de la sonde ( Figures 4D-F).

11. Analyse des données

  1. contrôle de la qualité. Reportez-vous à la norme Affymetrix contrôles afin de vérifier que les puces HERV-V2 répondent aux critères QC. A cet effet, les représentations suivantes peuvent être utilisées: la répartition de la valeur de l'intensité du journal (parcelles de densité et boîtes à moustaches), l'écart absolu moyen (MAD) par rapport à la médiane de l'intensité (MAD-Med) parcelles, les parcelles de fond, l'erreur-type non ajustée normalisée (Nuse) parcelles et l'expression de journal relative (RLE) de parcelles.
  2. Normalisation. En outre, des données devraient être explorées pour mettre en évidence les effets de lots inattendus et de les corriger avant l'analyse statistique. Le pré-traitement de données comprend ainsi une correction d'arrière-plan (par ex. Sur la base du signal de référence de la sonde tryptophane), suivie de la normalisation et de présentation d'un résumé RMA 15.
  3. L'exploration de données et recherche de gènes différentiels exprimé. Normaliser les puces et appliquer une clusteri hiérarchiqueapproche ng pour explorer l'ensemble de données (figure 6A). Ensuite, effectuez une recherche de gènes exprimés de manière différentielle (DEG) en utilisant une analyse classique important de puces à ADN (SAM) de procédure 16 suivie par un taux de fausses découvertes (FDR) de correction 17. Notez que ces étapes sont pleinement intégrés dans certaines suites d'analyse de logiciels comme Partek GS mais peuvent également être effectuées en utilisant le logiciel de statistique R 18 avec des modules de projet Bioconductor 19. Après l'analyse statistique, filtrer l'ensemble de données pour exclure les probesets pour lesquels des valeurs d'expression sont moins de 2 6.
  4. Visualisation et l'interprétation. Interpréter les résultats de la puce HERV-V2 dans une interface dédiée à l'aide des bases de données d'annotation.

Results

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La valeur des études transcriptomiques réside principalement dans la qualité du matériel biologique de départ. Si l'extraction de l'ARN est réalisée dans des conditions optimales, le numéro de l'intégrité de l'ARN (RIN) est généralement de 7 ou plus (figure 4A). La nécessité de s'hybrider 2 pg d'ADNc sur la puce Affymetrix HERV-V2 implique l'utilisation d'un processus d'amplification. Une étape d'amplification réussie conduit à une distribution en forme de cloche (figure 4B). Ensuite, fragmentation DNAse1 est effectuée afin d'homogénéiser la distribution de la taille de l'ADNc d'environ 100 nucleotides avant l'hybridation (figure 4C). Après l'hybridation et l'analyse (figure 4D), une inspection visuelle de l'image que l'on permet de vérifier si la grille est bien aligné sur les taches (figure 4E) et si les contrôles d'hybridation sont conformes (figure 4F). Cette étape est également utile dans le but d'exclure des microréseaux dans lesquelles les bulles d'air ou des erreurs produite au cours de l'expérience.

Une fois que les puces ont passé QC (Figure 5) et après la normalisation, l'analyse statistique des 5 matches paire tumeur et les échantillons d'ARN normales de la prostate de l'Hôpital Lyon-Sud conduit à l'identification de 207 probesets HERV avec des valeurs d'expression différentielle (p.val <0,05) (Figure 6A). Pour soutenir ces dossiers et d'obtenir des informations spécifiques à la prostate, 35 échantillons match paire supplémentaire (côlon, de l'ovaire, du testicule, du sein, du poumon et de la prostate) ont été ajoutés à l'analyse et la procédure SAM-FDR (FDR = 20%) éventuellement identifié 44 prostate probesets HERV spécifiques. Parmi eux, 10 les structures de HERV les plus pertinentes sont décrites (figure 6B). D'autres études cliniques seront nécessaires pour évaluer les valeurs de la sensibilité et de la spécificité de ces biomarqueurs candidats.

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. Figure 1 le schéma de la procédure globale de la clinique (1: prostatectomie par le clinicien et de la préparation de tissu par le pathologiste) sur le banc (06.02: préparation de l'échantillon, la préparation de la cible, le traitement de puces à ADN) conduisant à l'identification de biomarqueurs candidats (7: analyse bioinformatique des puces à HERV). Acides nucléiques provenant de tissus normaux sont représentés en orange, les acides nucléiques provenant de la zone tumorale sont constitués d'un mélange de la normale (orange) et spécifique de la tumeur (noir) des acides nucléiques. Cliquez ici pour agrandir l'image .

figure-results-1
. Figure 2 Conception et contenu de la puce HERV-V2: séquences HERVrécupéré à partir du génome humain sont stockées dans une base de données appelée HERV-gDB3, alors les sondes candidates 25-mères passent à travers une procédure de modélisation d'hybridation spécifique (EDA +), avant d'être finalement synthétisé sur la matrice (les sous-régions cibles qui en résultent sont représentées pour chaque famille). Cliquez ici pour agrandir l'image .

figure-results-2
Figure 3. Manipulation de la prostate par le pathologiste. (A) frais prostatectomie radicale échantillon est transféré au laboratoire. (BC) La prostate est coloré (vert sur ​​le côté droit, noir sur le côté gauche). (D) à grande section transversale de la glande sur le côté postérieur. (E) de laisser les marges intactes, pieces de tissus sont disséqués à partir de différentes zones de la glande de la prostate. (F) Cœurs de tissu sont placés dans un tube Eppendorf. (G) fil de suture est utilisée pour fermer la prostate et d'éviter des distorsions glande et une perturbation minimale de la marge chirurgicale. Ensuite, la prostatectomie radicale échantillon est prêt pour la fixation dans le formol selon la procédure habituelle pour l'analyse histologique. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Contrôles Figure 4. Qualité de la préparation d'acide nucléique et de l'efficacité d'hybridation. (A) l'intégrité de l'ARN, (B) des cibles ADNc amplifié et (C) la fragmentation des cibles utilisées dans l'étape d'hybridation. ThESE trois contrôles de qualité ont été obtenus avec l'aide de Bioanalyzer ARN puces nano et le dosage eucaryote Nano Série II. (D) l'image globale de la HERV-V2 zone microréseau d'hybridation après la numérisation, (E) l'élargissement de l'angle gauche montrant la grille des contrôles d'alignement supérieur et (F) l'élargissement de la zone centrale montrant repérer les contrôles d'hybridation. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 5. Traitement des signaux. (A) Affymetrix polyA pic dans les contrôles d'amplification. Le polyA contrôle Dap, Thr, Phe et Lys transcriptions de B. gènes subtilis sont dopés dans l'échantillon d'ARN et servent à évaluer la réussite globale des étapes de préparation de cibles. L'intensité doit être détectée à des valeurs décroissantes entre ces contrôles en pointes pour s'assurer qu'il n'y avait pas de biais au cours de l'amplification WT-Ovation entre les gènes hautement et faiblement exprimé. (B) Affymetrix pointe dans les contrôles d'hybridation. Ces cibles isolées à partir de E. coli et bactériophage P1 sont dopés avant la procédure de labellisation. Des valeurs croissantes de bioB, bioC, bioD et cre indiquent la réussite globale de l'hybridation. (C) la distribution de l'intensité des signaux de la puce après la normalisation RMA. La plupart des probesets signaux d'exposition avec des valeurs inférieures à 2 6 (arrière-plan), indiquant une expression globale essentiellement restreint à certains HERV loci spécifiques. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 6. L'analyse des données. (A) l'analyse de classification hiérarchique des échantillons normaux et tumoraux. regroupement de partitionnement a été appliquée aux valeurs d'expression normalisées en utilisant un algorithme de fonction de la distance euclidienne, regroupant probesets en (rouge) - et vers le bas (bleu)-régulation entre les échantillons normaux et tumoraux. (B) La sélection des 10 meilleurs structures HERV identifiés comme biomarqueur candidat de cancer de la prostate. Pour chaque élément de HERV, la famille HERV connexe, les coordonnées génomiques (NCBI 36/hg18) et une brève description de la structure de HERV sont donnés. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 7. Le répertoire de HERV. (A) Le séquençage du génome humain a révélé 25 000 gènes codant pour des protéines (exons, 2%) et une énorme quantité d'éléments transposables, y compris 200 000 à long répétition terminale (LTR) rétrotransposons (HERV, 8%). (B) L'extrapolation de HERV-V2 contenu de la puce et des données d'expression associés (79 échantillons provenant de huit normale par rapport à des types de tissus tumoraux) suggèrent qu'un tiers du répertoire de HERV est transcriptionnellement actif. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 8. D'interprétation fonctionnelle des signaux de la puce. (A) l'identification du promoteur et le contrôle épigénétique: U3 signal négatif (sonde rouge, 5'LTR) Par rapport à R-U5 signal positif (sonde bleu, 5'LTR) suggèrent entraîné U3-transcription, soutenu par la méthylation CpG différente (cercles noirs solides) du contenu de U3 en peritumoral normale contre les tissus tumoraux. (B) la stratégie de épissure: putatif enveloppe de 3,1 kb codant pour l'ARNm exprimé exclusivement dans la tumeur est identifié à l'aide d'épissage SD1/SA2 jonction chevauchement sonde. * Déduits par la comparaison avec d'autres tissus non-placentaires. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Discussion

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Au cours des 10 dernières années, la plupart des tentatives de mesure de l'expression de HERV ont utilisé des techniques de RT-PCR, soit pour se concentrer sur un locus spécifique 20 à 24 ou sur la base de la conservation relative des gènes pol pour évaluer les tendances générales à l'intérieur de HERV genres 25,26 . En outre, les amplifications par PCR en utilisant des amorces dégénérées hautement couplés avec des microréseaux de basse densité destinées à détecter et quantifier l'expression de la famille HERV 27,28. Afin de retracer l'expression de locus individu au sein d'une famille, les approches basées sur l'amplification par PCR de régions conservées combinés avec le clonage et séquençage ultérieur a permis éléments distincts actifs de transcription des HML-2 29,30 ou HERV-E4.1 31 familles à être identifiés. Aussi se terminant par clonage et séquençage des étapes, la technique de contrôle de l'expression de répétition du génome visant à identifier parmi les promoteurs des répétitions identifiées HML-2 LTR solitaire humains spécifiques actives 32,33. Nous avons développé successivement deux générations de puces à haute densité dédiés à l'analyse du transcriptome de HERV, l'introduction de méthodes appropriées pour répéter la conception de la sonde de l'élément afin de minimiser les réactions croisées entre les éléments paralogues au sein d'une famille 34,35. La puce HERV-V2 qui cible 2690 provirus distinctes et 2883 LTR solo du HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2 et HERV-K HML-cinq familles, a dévoilé le expression de HERV loci 1718 (figures 7A et B) dans une large gamme de tissus 35, illustrés dans le présent document par l'identification de biomarqueurs putatifs du cancer de la prostate. En outre, l'utilisation de plusieurs probesets sur un locus donné est informative sur sa régulation transcriptionnelle. Tout d'abord, un signal négatif U3 en conjonction avec un positif d'une classe U5 du LTR en tant que promoteur, et des signaux négatifs inversement U3 et U5 positifs peut refléter un rôle de polyadénylation. Nous avons donc identified 326 LTR promotrices dans une large gamme de tissus 35 et, sur la base de cette U3-U5 informations dichotomique fourni par la matrice, nous avons proposé et confirmé expérimentalement pour certains cas sélectionnés que cette transcription autonome a été contrôlée par un processus épigénétique dépendant de la méthylation 34 (Figure 8). Deuxièmement, la détection de signaux de par exemple LTR, gag et env probesets indépendants ou émis par les sondes ciblant jonction d'épissage spécifique est instructif sur la stratégie d'épissage proviral, comme illustré par le profil d'expression de ERVWE1/Syncytin1 dans le placenta ou dans le testicule tumoral 34. Cela indique que le processus de sélection de la sonde spécifique de HERV est suffisamment robuste pour supporter l'identification d'une stratégie d'épissage tissu associée, aussi efficacement que pour des gènes classiques 36 (figure 8).

Cette méthode est la première tentative d'identifier l'expression du locus HERV individuellementen utilisant une puce personnalisée de haute densité basé sur la technologie Affymetrix. Les avantages clairement définis de la forme de puces à ADN pour déchiffrer HERV transcriptome constitué par (i) l'exploration coordonnée de plusieurs familles de HERV et (ii) l'analyse simultanée et indépendante des régions différentes pour chaque locus, par exemple. U3 et U5 domaines pour solo et LTR proviral, régions gag ou env et jonctions possibles épissage associés à des structures provirales, sans a priori sur la fonctionnalité de l'élément de HERV. Perspectives s'appuient sur une amélioration des annotations dans les outils de bioinformatique puces associées. Ceci devrait permettre une pour convertir les signaux de la puce en hypothèses biologiques tels que si HERV actives représentées voiture lncRNA modulent la transcription ou plus ou moins proximale expression du gène codant. En effet, cette hypothèse est étayée par des études récentes qui ont identifié la prostate transcriptions de ncRNA associés au cancer contenant des composants de vORF Iral de la famille HERV-K rétrovirus endogène ou parties d'une région du promoteur LTR viral 37, ainsi que deux événements de fusion de gènes savoir HERV-K22q11-ETV1 et HERV-K17-ETV 38,39. Dans l'ensemble, cette approche globale de la transcriptome combinée avec la fonction LTR et épissage identifications de stratégie peut aider à déchiffrer le marqueur par rapport aux éléments déclencheurs de l'expression des HERV dans chroniques et les maladies infectieuses 40,41 42,43.

Disclosures

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Ce travail a été soutenu par bioMérieux SA, Hospices Civils de Lyon et l'agence publique française OSEO (Avancées Diagnostiques pour de Nouvelles Approches thérapeutiques, un programme financé par le gouvernement français dédié à la médecine personnalisée). PP, VC, GO, NM, et FM sont des employés de bioMérieux SA. PP, NM et FM ont présenté des demandes de brevet couvrant les conclusions de ce document.

Acknowledgements

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Nous remercions Cécile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard et Bertrand Bonnaud pour leur contribution à l'élaboration initiale et l'optimisation du protocole HERV-V2. Nous tenons également à remercier Hader Haidous pour ses conseils sur des considérations éthiques.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
TrizolInvitrogen15596-026
ARN poly-A stock de contrôleAffymetrix900433
DNAse 1PromegaM61011 000 U (1 U/µ ; l)
Transférase terminaleRoche3333574001400 U. Y compris l’enzyme et la coenzyme (CoCl2).
DLR-1aAffymetrix900542
Hybridation contrôles internes B2 et 20x Contrôle d’hybridation eucaryoteAffymetrix900454
GeneChip Hybridation, lavage et colorationAffymetrix900720Y compris mélange de préhybridation et 2x mélange d’hybridation pour 30 réactions
10x tampon One-Phor-All PLUSComposition dans l’eau traitée au DEPC : 100 mM Tris-acétate pH 7,5 ; 100 mM d’acétate de magnésium ; 500 mM d’acétate de potassium.
RNeasy Mini kitQiagen74104Protocole de nettoyage de l’ARN
WT-Ovation Système d’amplification d’ARNNugen2210-24
QIAquik Kit de purification PCRQiagen28104
EQUIPMENT
Material Nom del’entrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nanodrop 1000Thermo Scientific
GeneChip Scanner 3000 7GAffymetrixGS30007GEn option : chargeur automatique
GeneChip Fluidics Station 450AffymetrixFS450
Hybridation GeneChip 640 FourAffymetrix640Comprend 4 supports
de réseau de sondes GeneChipStation de travail équipée du logiciel d’exploitation GeneChip (GCOS), y compris le GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch
HERV-V2AffymetrixCustom array.
Pour connaître la disponibilité des microréseaux (à des fins de recherche uniquement), veuillez contacter :
Franç ; ois Mallet
Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMé ; rieux
Département de Découverte Diagnostique Médicale
Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâ ; timent 3F
69495, Pierre Bé ; nite cedex France
Tél. : 33 (0)4 72 67 87 85
Email : francois.mallet@biomerieux.com
HERV-V2 conception
Base de données dédiée et annotations

La construction d’une base de données dédiée, regroupant les séquences génomiques de HERV appartenant à 6 familles de HERV, a été obtenue par la procédure suivante : (i) la séquence la plus complète et la plus représentative de chaque famille de VHR a été sélectionnée dans la littérature et définie comme une séquence prototype (Figure 2). (ii) Les 6 prototypes ont été annotés fonctionnellement en référence à leur LTR (U3/R/U5) et à leurs pièces internes (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 a ensuite été appliqué en utilisant ces séquences fonctionnelles comme bibliothèques d’entrée. Une recherche à l’échelle du génome de toutes les séquences apparentées a été effectuée sur le génome humain sur la base d’une homologie minimale de 80 % (NCBI 36/hg18). (iv) Enfin, les séquences fonctionnelles récupérées par ce processus ont été assemblées en loci distincts sur la base de leur localisation génomique et finalement mises en œuvre dans une base de données HERV dédiée. Cette base de données, appelée HERV-gDB3, contient 10 035 loci35.

Locus-specific srobes design
À partir de HERV-gDB3, des traces superposées de sondes candidates de 25 mères ont d’abord été générées. Chaque sonde candidate a ensuite été alignée contre le génome humain à l’aide de KASH 45 afin d’évaluer les potentialités d’hybridation croisée. Cette dernière estimation a été réalisée à l’aide d’un modèle développé spécifiquement à cet effet et appelé EDA+. En bref, le principe d’EDA+ est de prendre en compte l’instabilité apportée par les discordances et les lacunes dans un complexe d’hybridation cible/sonde de 25 mers. Les sondes candidates présentant de faibles risques d’hybridation croisée (c’est-à-dire un faible nombre de cibles génomiques non spécifiques) sont sélectionnées et enfin assemblées en sondes probesets.

Custom HERV GeneChip microarray
Le HERV GeneChip personnalisé intègre 23 583 sondes HERV et peut discriminer 5 573 éléments HERV distincts, composé de LTR solo, de provirus complets et partiels (Figure 2). Les sondes de contrôle standard d’Affymetrix pour l’amplification et l’hybridation non biaisées ont également été incluses dans la puce.

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