Imagerie des cellules vivantes d'infections virales alphaherpes permet d'analyser les événements dynamiques de transport dirigée et la propagation intercellulaire. Ici, nous présentons des méthodes qui utilisent des souches virales recombinantes exprimant des protéines de fusion fluorescentes pour faciliter la visualisation des assemblages virale lors d'une infection de neurones primaires.
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Article de méthode
Imagerie de cellules vivantes de Alphaherpes Virus Transport antérograde et la propagation
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les progrès des techniques vivantes des cellules par microscopie de fluorescence, ainsi que la construction de souches virales recombinantes exprimant des protéines de fusion fluorescentes ont permis la visualisation en temps réel du transport et de la propagation de l'infection par le virus alphaherpes des neurones. L'utilité de nouvelles protéines de fusion fluorescentes à membrane virale, tégument, et capsides, en conjonction avec l'imagerie des cellules vivantes, identifié ensembles de particules virales subissant transport à l'intérieur des axones. Des outils similaires ont été utilisées avec succès pour les analyses de cellule à cellule propagation de particules virales de quantifier le nombre et la diversité des virions transmis entre les cellules. Surtout, les techniques d'imagerie des cellules vivantes du transport antérograde et la propagation de produire une foule de renseignements, y compris des vitesses de particules de transport, de distribution de particules, et des analyses temporelles de la localisation des protéines. A côté des techniques génétiques virales classiques, ces méthodes ont fourni des renseignements cruciauxen questions mécanistiques importantes. Dans cet article, nous décrivons en détail les méthodes d'imagerie qui ont été développés pour répondre aux questions de base du transport de virus alphaherpes et la propagation.
Introduction
Infection du système nerveux périphérique (SNP) par alphaherpes virus tels que le virus de l'herpès simplex (HSV) -1, -2 et virus de la pseudo-rage (PRV) comporte plusieurs étapes complexes et fortement réglementés au long du cycle de vie du virus. Transport dans les neurones du SNP est essentiel pendant les événements des deux infection virale primaire et la suite propagation inter-hôte. Les mécanismes moléculaires qui modulent deux composantes du cycle de vie du virus, le transport dirigé des assemblées virales loin des corps cellulaires dans les axones (transport antérograde) et de la transmission ultérieure des virions aux cellules sensibles (propagation antérograde) sont importantes pour comprendre la pathogenèse herpèsvirus.
Le transport et l'évacuation des particules virales dans les neurones dépend de l'assemblage d'un 1,2 virion infectieux mature. Dosages préalablement fixés, y compris immunofluorescence (IF) et la microscopie électronique (EM), ont été utilisés pour étudier l'état de l'ensemble des particules et protinteractions ein associés au transport du virion et la propagation 3-6. Toutefois, la nature dynamique des virions transport et des artefacts expérimentaux mis en place par fixation chimique confondu l'interprétation des images fixes 7,8. Récemment, un certain nombre de protéines de fusion virale fluorescentes ont été décrits pour le HSV et PRV qui ont des répercussions négligeables sur la fonction des protéines. Green Fluorescent Protein (GFP) et des protéines fluorescentes rouges (mCherry ou mRFP) fluorophores sont souvent jumelés pour permettre l'imagerie de deux des trois composantes structurelles d'un virion maturité: capside, tégument, et la glycoprotéine 9-11. Vivez l'imagerie cellulaire du transport antérograde utilisant des virus à double marquage visualise l'état d'assemblage des particules virales durant le transport. Fluorophore similaire exprimant souches virales sont utilisés pour visualiser le nombre et la diversité des génomes viraux suivants propagation 12,13. Les propriétés des protéines fluorescentes (revue de 14,15) influent considérablement surla capacité de visualiser assemblées virales ou cellulaires. Les propriétés intrinsèques de la protéine fluorescente, y compris l'auto-interactions et la stabilité, devraient être considérés lors de la conception et de tester de nouvelles protéines de fusion pour la préservation de la fonctionnalité de type sauvage.
En conjonction avec des protéines de fusion fluorescentes, deux bien caractérisés dans les systèmes de culture cellulaire in vitro sont utilisés pour l'imagerie des cellules vivantes de l'infection par le virus de l'herpès: dissocié 16 et compartimenté 17 (figure 1A) ganglions neurones cervicaux supérieurs de rat (CTB). Dans les deux systèmes, embryonnaire SCG de sont disséqués, dissocié à des organismes unicellulaires, et plaqué par culture in vitro 18. SCG neurones font partie du système nerveux autonome et peut être facilement cultivées et différenciées par le facteur de croissance neuronal (NGF) dans un état polarisé matures ex vivo. Neurones SCG dissociées forment un réseau étendu d'axones qui permet fou la visualisation de particules virales car ils subissent le transport antérograde 6. SCG cultures compartimentées offrent une isolation fluidique du corps cellulaire des neurones (S compartiment) et terminaisons axonales distales (compartiment N) 19. Un certain nombre de protocoles détaillés pour la construction et l'utilisation des neurones compartimentées aide initiale de 20 ou modifié Campenot chambres 17 ont été publiés précédemment. Isolement fluidique permet d'infection sélective des corps cellulaires neuronaux et la détection des virions fils après le transport de la gare Termini de l'axone isolés. Placage cellules épithéliales sur les terminaisons avant l'infection fournit des cellules réceptrices de la propagation de l'infection virale.
Il ya beaucoup d'éléments essentiels importants pour tous vivent expérimentation d'imagerie cellulaire, mais le plus pertinent pour nos protocoles sont les suivants: acquisition automatique de l'image, éclairage fluorescent, la vitesse de l'imagerie et le contrôle de l'environnement. Pour toutes les expériences d'imagerie, nous utilisonsinversé, automatisé, microscope d'éclairage à épifluorescence (figure 1B). Le microscope est construit autour du Nikon Eclipse base de Ti et emploie un certain nombre de systèmes motorisés commandés par ordinateur pour reconfigurer rapidement le microscope lors de l'acquisition automatique d'images. Pour l'éclairage par fluorescence, nous utilisons un large spectre mercure lampe à arc qui peut être atténué avec des filtres de densité neutre le long de la voie d'éclairage. filtres d'excitation limiter le spectre de l'éclairage fluorescent et lorsqu'il est associé à des miroirs dichroïques multi-pass et filtres d'émission de fluorescence visualiser composés fluorescents spécifiques. Les filtres d'excitation et d'émission sont montés à commutation rapide roues indépendantes, le filtre pour permettre l'acquisition séquentielle rapide des différents canaux fluorescents. La vitesse d'acquisition des images est encore améliorée avec une caméra EM-CCD sensible et rapide, utile pour la détection des signaux de faible intensité et de courte images fois lu. Contrôle de l'environnement sur la microscOPE est réalisée avec un haut stade chauffé incubateur et un chauffage de l'objectif de maintenir les échantillons à des températures élevées pendant une atmosphère humidifiée 2 et CO enrichi est passé dans l'incubateur. Le microscope est gardé dans une pièce sombre avec une température ambiante maintenue à près de 25 ° C et la lumière extérieure réduite avec des rideaux occultants sur toutes les fenêtres. Les protocoles suivants décrivent l'utilisation de ce système pour le transport antérograde et des essais d'étalement.
Un certain nombre d'alternatives existent pour contrôler les variables d'imagerie des cellules vivantes. Le contrôle des paramètres de microscopie peut être effectuée manuellement ou par des systèmes automatisés qui dépendent de logiciels propriétaires. Éclairage par fluorescence peut être réalisé avec des sources laser halogène, LED ou. La vitesse de formation d'image est modifiée par la vitesse de commutation du filtre et le temps pour visualiser le signal dans le système de détection couplé. Contrôle de l'environnement peut être réalisé avec du matériel spécialisé sur la miétape de croscope, enceinte de tout ou partie du microscope dans une boîte chauffé et humidifié, ou en élevant la température de la pièce où microscopie sera effectuée. Chacune de ces alternatives a ses avantages et inconvénients liés aux coûts et à la performance.
Dans le protocole suivant, nous détaillons l'utilisation de l'imagerie des cellules vivantes pour étudier le transport antérograde rapide et la propagation antérograde de alphaherpes virus grâce à l'utilisation de souches virales recombinantes. Imagerie des cellules vivantes en temps réel visualise capside, tégument et / ou glycoprotéine co-localisation des structures dynamiques qui subissent le transport dans les axones 11. Imagerie timelapse nuit de cultures de neurones compartimentées visualise sortie du virion axonale et l'infection de cellules sensibles 12. Les protocoles présentés ici ont été optimisés pour une utilisation avec notre système d'imagerie en particulier, mais sont présentés en termes généraux par rapport aux quatre éléments d'imagerie des cellules vivantes. Dans la discussion que nousseront plus en détail certains de l'optimisation qui est nécessaire pour l'expérimentation réussie.
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Protocole
Section 1 - Conditions de contrôle de l'environnement pour la microscopie par fluorescence des cellules vivantes
- 30 min avant toute expérience d'imagerie connecter et commencer à chauffer le microscope étage supérieur incubateur.
- Allumez le microscope, les sources de lumière transmise et épifluorescent, et les commandes de matériels automatisés. Ouvrez le logiciel de contrôle de microscope, NIS Elements, pour se connecter au microscope et commencer à refroidir l'appareil EM-CCD.
- Fixer l'objectif plus chaud à l'objectif approprié (60X ou 100X à immersion d'huile). Remarque: Sélectionnez lentille de l'objectif en fonction du type d'expérience. Le contraste d'interférence différentiel 100X (DIC) est le mieux pour le suivi des assemblées du virion transport antérograde alors que l'objectif de phase 60X est adapté pour visualiser la propagation antérograde. Un grossissement inférieur, les objectifs d'immersion non pétrolières n'ont pas besoin d'un objectif plus chaud car ils ne sont pas en contact direct avec l'échantillon.
- Fixez étage supérieur incubateur sur la platine motorisée de mi croscope. Assurer l'insert approprié qui tient l'échantillon est en place. Fixer la conduite d'air humidifié à partir du contrôle incubateur à l'orifice d'entrée de l'étage de tête incubateur.
- Allumez contrôles chauds incubateur et l'objectif et régler les paramètres de température à des conditions spécifiques déjà vérifiés pour l'objectif et l'échantillon étant imagé (voir discussion).
- Ouvrez la vanne de régulation sur les 5% de CO 2 / réservoir atmosphérique de 95% à fournir CO 2 air complétée au stade supérieur incubateur. Le débit doit être compris entre 60 et 80 ml de gaz par minute. Rythme plus rapide se traduira par déshydratation poussée de l'échantillon en dépit de la chambre d'humidification.
- Ajouter l'huile d'objectif sur l'objectif et placer immédiatement la culture qui sera reproduite dans l'étage supérieur incubateur.
- Permettre l'équilibrage de la température dans la culture pour un minimum de 10 min. Une heure est préférable, notamment pour l'imagerie du jour au lendemain décrit dans la section 3.
- Six à huit heures avant l'imagerie, infecter un plat de 35 mm lamelle-bas matures, les neurones SCG dissociées avec 1 x unités formant 10 6 de la plaque du virus d'intérêt (voir le tableau 1, par exemple des virus) en utilisant la méthode décrite dans Taylor et al. 2012a 11. Si vous testez plus d'un virus, la vaccination off-set par 30-60 min pour permettre l'imagerie des échantillons séquentiels au même post-infection fois.
- Insérez plat dans l'étape supérieure incubateur pour un minimum de 10 minutes avant d'exécuter n'importe quelle expérience. Alors que la température s'équilibre, le plan focal se déplace et aura un impact négatif sur les expériences d'imagerie.
- Utilisation de la lumière transmise et de l'oculaire du microscope, pour un corps de cellule neuronale qui a une extension axonale clairement isolé. Vous pouvez également utiliser l'éclairage par fluorescence approprié pour trouver une cellule exprimant DETECmontants des tables de protéines fluorescentes. Il est important de limiter l'exposition de l'échantillon à l'éclairage fluorescent, à cette étape et les étapes ultérieures, en raison des dommages cellulaires induite par la lumière et le blanchiment des protéines fluorescentes.
- Atténuer l'éclairage à fluorescence à réduire l'intensité de la lumière d'excitation dans laquelle les cellules sont exposées. Engager atténuant la lumière densité neutre (ND) de filtres dans le trajet de la lumière d'éclairage par fluorescence. Pour les films d'une durée de 1 min, un minimum de ND4 doivent être utilisés pour empêcher photo-blanchiment des protéines fluorescentes et étendue photo-endommagement des axones. Structures fortement fluorescentes peuvent généralement être visualisé avec un filtre ND8 en place.
- En utilisant le logiciel de microscope (Figure 2 et complémentaire Film 1A), mettez le trajet de la lumière à la caméra EM-CCD.
- Déterminer le temps d'imagerie optimales et des conditions pour chaque canal fluorescent.
- Lancez une fenêtre d'image en direct en utilisant le bouton "Play".
- Déterminer les paramètres d'exposition de l'appareil optimal pour chaque protéine fluorescente. Ne pas dépasser 300 ms par canal comme des aberrations dynamiques sur les structures de virions mouvement rapide se produira. Utiliser le gain EM de l'appareil photo à un réglage de 300 (suggérés par le fabricant gain maximum), afin de minimiser le temps d'exposition et d'améliorer la détection des signaux faibles. Temps d'exposition correcte devrait produire une image avec une faible intensité de fond et les signaux spécifiques élevées.
- Après avoir réglé l'exposition et de trouver une région bien définie de l'axone, le logiciel doit être configuré pour effectuer l'acquisition automatique d'images. Arrêtez la fenêtre d'imagerie en temps réel pour éviter échantillon de blanchiment.
- Dans le logiciel NIS Elements, sélectionnez le 6D - Définir / Exécuter l'application de l'expérience de la "Applications" menu déroulant.
- Dans la fenêtre d'acquisition de ND, cliquez sur l'onglet Temps qui déterminera la fréquence d'acquisition d'image. Définir l'intervalle de «pas de retard» et de la durée de 5 min. Thlogiciel de e acquerra alors trames d'image à la fréquence la plus élevée possible pour la durée de 5 min.
- Sélectionnez l'onglet "Lambda", qui permet de sélectionner les configurations matérielles prédéfinies utilisées pour de multiples acquisition d'image fluorescente. Cliquez sur la première case et la baisse subséquente menu déroulant pour sélectionner une configuration matérielle appropriée. Répétez l'opération pour toutes les protéines fluorescentes à imager.
- S'assurer que les languettes pour "XY Positions", "série Z" et "Image Grand" sont de-sélectionnés.
- Au-dessus des onglets, sélectionnez la case «Save to File" pour sauvegarder automatiquement les images sur le disque dur lors de l'acquisition. Configurer l'emplacement et le nom de fichier du fichier de sortie de l'expérience. Comme les expériences successives sont effectuées, le logiciel va ajouter un numéro séquentiel à la fin du nom de fichier désigné.
- Une fois tous les onglets ont été sélectionnés. Initier l'expérience en cliquant sur le bouton "Run-Now".
- Optimiser le taux d'acquisition d'image par le biais des paramètres d'exposition et imagtaille de e. En utilisant une petite région de la zone d'image est souvent capable d'accélérer les taux d'acquisition d'images. Définir la zone d'intérêt en utilisant l'outil ROI dans NIS-Elements, en sélectionnant une zone située entre 25% et 50% de la superficie totale de l'image. Alternativement, les temps d'exposition plus courts vont augmenter les taux d'acquisition d'images, mais diminue la qualité de signal (voir la discussion).
Section 3 - Nuit imagerie time-lapse de antérograde spread Événements
- Quatre heures avant l'imagerie, infecter une culture neuronale compartimentée construit sur un 35 mm μ-Dish. Inoculez corps cellulaires neuronaux avec 1 x 10 6 unités formatrices de plages du virus d'intérêt (voir le tableau 1, par exemple des virus) en utilisant la méthode décrite dans Taylor et al. 2012b 12.
- Placez délicatement boîte de culture dans l'étage supérieur incubateur. S'assurer que la position de l'objectif est fixé sur le côté de la boîte. Porter lentement l'objectif dans le foyer, s'assurantment l'objectif ne pousse pas vers le haut dans l'échantillon. Une fois le champ de mise au point a été identifié, se déplacer lentement l'objectif dans le centre de l'assiette, près de la barrière interne démarquage du côté interne du compartiment de l'axone. Pendant le déplacement, s'assurer que la profondeur de mise au point est maintenue et éviter les poussant vers le haut dans l'échantillon. Déviation de la surface en plastique par l'objectif risque d'endommager les axones et les plastiques.
- Ajoutez environ 2 ml d'eau tiède (~ 37 ° C) tampon phosphate salin à la boîte de culture à l'extérieur de l'anneau en téflon. Ce entoure la culture des neurones d'une bague de PBS pour minimiser échantillon déshydratation et assurer une isolation thermique.
- Laisser la température s'équilibrer pendant au moins 1 heure avant de commencer l'acquisition d'image automatisé (3,8). Étapes 3.5 à 3.7 peuvent être configurés pendant ce temps.
- Restreindre l'intensité de l'éclairage au niveau le plus bas possible en engageant tous les filtres de densité neutre. Cela permettra l'acquisition d'images fréquentes over de longues périodes sans excessive photo-dommages. Réduire l'éclairage se traduira par un signal faible, ce qui nécessite de plus longues expositions (voir discussion).
- Utiliser les paramètres d'exposition historiques ou avant montage expérimental générer un plat parallèle des cellules épithéliales infectées exprimant les protéines fluorescentes cibles importantes pour établir les paramètres de l'exposition, décrite à la section 2.5.
- Après avoir réglé l'exposition pour les canaux nécessaires, il est temps de configurer le logiciel pour l'acquisition automatique d'images. Arrêtez la fenêtre d'imagerie en temps réel pour limiter échantillon de blanchiment.
- Dans le logiciel Elements (Figure 2 et le film supplémentaire 2), sélectionnez le 6D - Définir / Exécuter l'application de l'expérience de la "Applications" menu déroulant pour faire apparaître la fenêtre d'acquisition de ND.
- Dans la fenêtre d'acquisition ND, cliquez sur l'onglet Heure. Définir l'intervalle de "5 min". Réglez la durée à 20 h. Le champ des boucles est automatiquement calculée pour le nombre de répétitions du programmm sera performant.
- Sélectionnez l'onglet "Lambda". Cliquez sur la première case et la baisse subséquente le menu déroulant, sélectionnez la configuration de lambda approprié pour le contraste de phase. Répétez l'opération pour les positions suivantes, la sélection des configurations appropriées pour chaque protéine fluorescente à imager.
- Sélectionnez l'onglet "Image Large", qui détermine les paramètres de plusieurs images à combiner dans un seul champ de vision plus large. Une zone de bonne taille se compose de 5 x 2 images à l'aide de 7% chevauchement de couture. Cela permettra pour le nombre maximum de cellules par mesure d'imager sans impact sur la fréquence d'acquisition d'image. Aussi, décochez la case pour "Shutter Fermer actif pendant le mouvement de la scène". Cette option améliore la vitesse d'acquisition en ne fermant volets entre les images.
- Sélectionnez l'onglet "XY Positions", pour identifier plusieurs postes qui seront imagés séquentiellement en parallèle au cours du film du jour au lendemain. Sélectionnez positions qui définissent le centre point pour chaque grande zone d'image. Sélectionner 6-8 positions d'image de l'échantillon. Une bonne partie de l'image aura de petits amas de cellules en étroite apposition d'axones clairement définis. Les cellules ne doivent pas être empilés les uns sur les autres et axone regroupement doit être minimisé. Le point de focalisation est le noyau de la cellule. Positionner l'objectif de telle sorte qu'une enveloppe nucléaire clairement définie est considérée pour la majorité des cellules.
- Assurez-vous sur l'onglet "série Z" est décochée.
- Configurez la fonction de sauvegarde automatique tel que décrit ci-dessus à la section 2.6.5.
- Testez l'exposition et la position en cliquant sur "1 boucle temporelle". Évaluer les images qui en résultent pour l'éclairage transmis de lumière, foyer, et le cadrage. Si accent s'est déplacé, réinitialiser la mise au point pour chaque position sous l'onglet XY. Attendre 10 minutes et répéter l'opération jusqu'à ce point est stable.
- Après tous les paramètres ont été vérifiés et testés, initier l'expérience automatisé en cliquant sur le bouton "Exécuter".
Section 4 - Traitement de l'image et de l'Exportation
Data Export
- Ensembles de données obtenues lors de l'imagerie des cellules vivantes d'événements de transport ou de propagation doivent être exportés depuis le logiciel NIS Elements en types de fichiers couramment utilisés pour une utilisation ultérieure à des présentations et des publications (Supplemental Movie 3). Pour exporter des films ouvrent la première nd2 fichier approprié. Dans NIS Elements et sélectionnez la vue "split-composante" pour visualiser les canaux fluorescents souhaités. Lire le fichier à une vitesse appropriée; 5 images par seconde est un bon point de départ pour la visualisation des fast-transport.
- Inclure un horodatage pour représenter une horloge en temps réel pendant la lecture du film. Faites un clic droit sur l'image et sélectionner, ajouter ND-information. Un compteur numérique apparaîtra dans le coin supérieur gauche.
- Modifier l'horodatage pour afficher des informations. Faites un clic droit sur le comptoir et sélectionnez Modifier ND-information. Dans la fenêtre suivante pop-up, de modifier le texte pour refléter l'imaginationng paramètres qui sont importants. Modifier la police, la couleur et la taille pour plus de clarté.
- Allez dans le menu "Edition" et trouver "Créer vue instantané» ou appuyez sur la touche "x". Cette commande ouvre la vue "snapshot" fenêtre. Sélectionnez "s'appliquent à tous les cadres" pour générer un 8-bit, RGB, fichier prêt à exporter contenant les canaux fluorescents de l'ensemble du film.
- Enregistrer en tant que fichier. Avi pour une compatibilité multi-plateforme. Régler la vitesse de lecture de 200 ms par image. Les fichiers. Avi générés par NIS éléments peuvent ensuite être compressés avec d'autres logiciels de conversion dans le type de fichier souhaité.
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Résultats
Transport antérograde
L'application de ce protocole d'infections des cultures SCG dissociées avec PRV 348, une souche PRV recombinant exprimant la GFP-US9 et des protéines de fusion membranaire gM mCherry, a facilité la visualisation du transport antérograde des virions (Figure 3 et Movie supplémentaires 4). L'incorporation de ces protéines de fusion dans des particules virales résultats dans leur détection sur le transport lacrymaux, et les conditi...
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Discussion
Le but de l'imagerie des cellules vivantes est l'observation des processus biologiques tels qu'ils se présentent sans altération significative par l'acte d'observation. Cet objectif est atteint par l'optimisation de trois variables: le contrôle de l'environnement, de la vitesse de l'imagerie et l'éclairage par fluorescence. Ces variables interdépendantes doivent être équilibrées pour obtenir des conditions d'imagerie viables. Les protocoles présentés utilisent des conditions spéci...
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Déclarations de divulgation
Nous n'avons rien à révéler.
Remerciements
LWE et RK sont pris en charge par le US National Institutes of Health des subventions R37 NS033506-16 et R01-03 NS060699 nationale. MPT a été pris en charge par une société de bourse de recherche postdoctorale American Cancer (PF-10-057-01-MPC). Les conseils et les connaissances du Dr Matthew Lyman et le Dr Oren Kobiler ont joué un rôle dans la conception de la configuration du microscope et les méthodes d'imagerie des cellules vivantes. Nous remercions également pour Neal Barlow et Brian T. Kain de Nikon Instruments pour leur assistance technique dans l'acquisition, l'installation et la performance du microscope.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plat de culture à fond en verre de 35 mm | MatTek Corporation ; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C | |
| 35 mm &mu ;-Dish | Ibidi USA LLC, Vérone, WI | 81156 | |
| Corps de microscope | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti | |
| Microscope motorisé X-Y stage | Prior Scientific ; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top | |
| Roues à filtres motorisées | Prior Scientific | HF110 Roue à | |
| Source d’éclairage fluorescent | Lumen Dynamics ; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q | |
| Ensembles de filtres de fluorescence multibande | Chroma Technology Corp. ; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET | |
| EM-CCD caméra | Andor Technology USA ; South Windsor, CT | iXon3 897 | |
| Chamlide stage top incubateur environnemental | Live Cell Instruments ; Séoul, Corée du Sud | TC-L-10 | |
| Lentille chauffante | Bioptecs ; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Logiciel | |
| Nikon Instruments Inc. ; Melville, NY | NIS Elements |
Références
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Réimpressions et autorisations
