Identification des bactéries métaboliquement actif dans l'intestin du généraliste Spodoptera littoralis Par ADN isotopes stables de palpage Utilisation 13 C-Glucose

Résumé

La communauté bactérienne active associée à l'intestin de Spodoptera, a été déterminée par des isotopes stables-sondage (SIP) couplé à pyroséquençage. En utilisant cette méthodologie, l'identification des espèces de bactéries métaboliquement actives au sein de la communauté a été fait avec une haute résolution et de précision.

Résumé

Entrailles de la plupart des insectes sont habitées par des communautés complexes de bactéries non pathogènes symbiotiques. Dans ces communautés microbiennes, il est possible d'identifier les espèces de bactéries commensales ou mutualistes. Ces derniers chers, ont été observées pour servir plusieurs fonctions à l'insecte, à savoir aider à ^une reproduction des insectes, en stimulant la réponse immunitaire ^2, la production de phéromone ^3, ainsi que la nutrition, y compris la synthèse des acides aminés essentiels ^4, entre autres.

En raison de l'importance de ces associations, de nombreux efforts ont été réalisés pour caractériser les communautés vers le bas pour les membres individuels. Cependant, la plupart de ces efforts ont été soit basées sur des méthodes de culture ou invoqué la génération de fragments de gènes ARNr 16S qui ont été séquences pour l'identification finale. Malheureusement, ces approches ne identifié les espèces bactériennes présentes dans l'intestin et n'ont fourni aucune informations sur l'activité métabolique des micro-organismes.

Afin de caractériser l'espèce bactérienne métaboliquement actives dans l'intestin d'un insecte, on a utilisé des isotopes stables de palpage (SIP) in vivo employant ¹³ C-glucose comme substrat universel. Il s'agit d'une technique de culture libre-prometteuse qui permet la liaison de la phylogénie microbiennes à leur activité métabolique particulier. Cela est possible en suivant, isotopes stables marqué atomes de substrats en biomarqueurs microbiens, tels que l'ADN et de l'ARN ^5. L'incorporation d'isotopes ¹³ C dans l'ADN augmente la densité de l'ADN marqué par rapport à la non marqué ⁽¹² C) une. En fin de compte, l'ADN marqué au ¹³ C ou de l'ARN est séparé par ultracentrifugation en gradient de densité à partir de la ^C-12 non marqué similaire une ^6. Analyse moléculaire ultérieure des isotopomères d'acides nucléiques séparés assure la liaison entre l'activité métabolique et de l'identité de l'espèce.

Ici, nous présentons le protocole utilisé pour caractériser les bactéries métaboliquement actives dans l'intestin d'un insecte généraliste (notre système de modèle), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). L'analyse phylogénétique de l'ADN a été effectuée à l'aide pyroséquençage, ce qui a permis une haute résolution et une précision dans l'identification de la communauté bactérienne de l'intestin des insectes. Comme substrat principal, ¹³ C-glucose marqué a été utilisé dans les expériences. Le substrat a été introduit dans les insectes en utilisant un régime artificiel.

Introduction

Associations symbiotiques insectes bactériennes sont connus pour un grand nombre d'espèces d'insectes ^7. Dans ces associations symbiotiques, les micro-organismes jouent un rôle important dans la croissance et le développement des insectes. Les microbes ont été montrés pour contribuer à ^une reproduction des insectes, des phéromones biosynthèse ^3, de la nutrition, y compris la synthèse des acides aminés essentiels ^4, et la digestion de la nourriture inaccessible à l'hôte. En dépit de la grande variété des associations intestinale bactérienne, on sait beaucoup moins sur le rôle fonctionnel qu'ils jouent en fave....

Protocole

Une. Élevage des insectes

1. Acheter ou obtenir des œufs griffes de Spodoptera littoralis partir de votre propre élevage. Les maintenir dans des plats de Pétri à température ambiante (TA) jusqu'à l'éclosion.
2. Préparer l'alimentation artificielle pour les insectes d'élevage comme suit:
   1. Faire tremper 500 g de haricots blancs au sol pendant la nuit dans 100 ml d'eau.
   2. Ajouter 9,0 g d'acide ascorbique et 75 g d'agar à 1 000 ml d'eau distillée H ₂ O et ensuite la faire bouillir.
   3. Laisser le mélange refroidir et il se solidifie quand (à un mélange solide cireux blanc) stocker à ....

Résultats

Pour réaliser un étiquetage adéquat des bactéries métaboliquement actives présentes dans l'intestin d'insecte, l'insecte doit être exposée sur le substrat ¹³ de C-riche pendant une période préalablement optimisé suffisante pour permettre la séparation de la fraction plus lourde marqué facilement à partir de l'allumeur non marqué une. Dans notre cas, ¹³ C-glucose a été complétée dans le régime alimentaire artificiel à une concentration finale de 10 mM pendant 1 jour (Figure 1A). La .......

Discussion

L'intestin de la plupart des insectes abrite une communauté microbienne riche et complexe; généralement 10 ⁷ -10 ⁹ cellules procaryotes déposer là, plus nombreux que les propres cellules de l'hôte dans la plupart des cas. Ainsi, l'intestin de l'insecte est un "point chaud" pour les activités microbiennes différentes, représentant de multiples aspects des relations microbiennes, de la pathogenèse d'obliger mutualisme ^27. Bien que de nombreuses études ont décr.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dumont #5 Pince à finition miroir	Outils scientifiques fins	11251-23	;
Ciseaux à ressort Vannas	Outils scientifiques fins	15000-00	;
Concentrateur de vide de vitesse 5301	Eppendorf Allemagne	5305 000.304	;
Pilon en plastique	Carl Roth GmbH Co. Allemagne	P986.1	;
Spectrophotomètre NanoVue	GE HealthCare, Royaume-Uni	28-9569-58	;
Mastercycler pro/thermocycleur	Eppendorf Allemagne	6321 000.515	;
Chambre d’électrophorèse horizontale sur gel Agagel Standard	Biometra	Discontinué&	nbsp ;
Ultracentrifugeuse (Optima L-90K)	Beckman	A20684	;
Rotor d’ultracentrifugeuse (NVT 90)	Beckman	362752	;
Pompe HPLC	Agilent	1100	;
Quick-Seal, tube polyallomère	Beckman	342412	;
Transilluminateur UVstar 15  ;	Biometra		;