Les cellules souches de programmation pour angiogenèse thérapeutique utilisant polymère biodégradable nanoparticules

Summary

Nous décrivons la méthode des cellules souches de programmation pour surexprimer des facteurs thérapeutiques pour l'angiogenèse en utilisant des nanoparticules polymériques biodégradables. Les procédés décrits comprennent la synthèse du polymère, la transfection de cellules souches du tissu adipeux in vitro, et de valider l'efficacité des cellules souches programmées pour favoriser l'angiogenèse dans un modèle d'ischémie des membres postérieurs de souris.

Abstract

La croissance vasculaire contrôlée, est critique pour la régénération des tissus et la cicatrisation des plaies avec succès, ainsi que pour le traitement de maladies ischémiques telles que l'accident vasculaire cérébral, infarctus du myocarde ou les maladies artérielles périphériques. La livraison directe des facteurs de croissance angiogéniques a le potentiel de stimuler la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins, mais est souvent associée à des limitations telles que le manque de ciblage et la courte demi-vie in vivo. La thérapie génique offre une approche alternative par la délivrance de gènes codant pour des facteurs angiogéniques, mais nécessite souvent l'aide de virus, et est limitée par des préoccupations de sécurité. Nous décrivons ici une stratégie récemment mis au point pour la stimulation de la croissance vasculaire par les cellules souches de programmation pour surexprimer des facteurs angiogéniques in situ en utilisant des nanoparticules polymériques biodégradables. Plus précisément notre stratégie utilisée cellules souches comme des véhicules de délivrance, en profitant de leur capacité à migrer vers les tissus ischémiques in vivo. En utilisant les vecteurs polymères optimisés, adipeux dérivésLes cellules souches ont été modifiées pour surexprimer un gène codant pour le facteur angiogénique de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Nous avons décrit les procédés pour la synthèse du polymère, la formation des nanoparticules, la transfection de cellules souches in vitro, ainsi que des procédés pour la validation de l'efficacité des cellules souches exprimant VEGF pour la promotion de l'angiogenèse dans un modèle d'ischémie des membres postérieurs de souris.

Introduction

L'objectif global de cette technique est de promouvoir l'angiogenèse thérapeutique utilisant des cellules souches non-virale programmées surexprimant facteurs thérapeutiques au site de l'ischémie. Les cellules souches ont été modifiées ex vivo en utilisant d'abord des nanoparticules biodégradables synthétisés dans le laboratoire, et ensuite transplantées dans un modèle murin de la patte arrière ischémie pour valider leur potentiel de développement de l'angiogenèse et de sauvetage de tissu.

La croissance vasculaire contrôlée, est un composant important de la régénération des tissus succès, ainsi que pour le tra....

Protocol

Une. Polymer Synthesis

1. Dans une hotte, peser 3,523 mg de diacrylate de butanediol (C) et de les transférer dans un flacon à scintillation en verre contenant un barreau d'agitation.
2. Préchauffer le 5-amino-1-pentanol (32) à 90 ° C pour solubiliser le sel, puis dans une hotte de laboratoire, peser 1,533 mg 32 et l'ajouter dans le flacon de scintillation contenant C. Cette méthode se traduira par un rapport molaire C: 32 = 1:1,2.
3. Placer immédiatement la fiole contenant à la fois des solutions sur une plaque d'agitation. Réglez la vitesse d'agitation à 600 tours par minute.
4. Transférer le flacon à scintillation à un ....

Results

Lors du mélange ensemble, le polymère chargé positivement (C32-122) et de l'ADN plasmide s'auto-assemble chargés négativement dans des nanoparticules. la formation de nanoparticules peut être confirmée par analyse par électrophorèse dire la complexation entre C32-122 et l'ADN plasmidique permettra d'éviter la mobilisation de l'ADN lors de l'électrophorèse. Le polymère sert de réactif de transfection pour faciliter l'absorption accrue de l'ADN dans les cellules cibles et l'expression subséquente de protéines de .......

Discussion

Nous rapportons ici une méthode pour programmer des cellules souches adultes pour surexprimer facteurs thérapeutiques utilisant non viraux, des nanoparticules biodégradables. Cette plate-forme est particulièrement utile pour le traitement de maladies où les cellules souches peuvent naturellement à la maison, tels que l'ischémie et du cancer. ^10.9 En outre, le non-viral plate-forme de délivrance de gène permet la surexpression transitoire de facteurs thérapeutiques, ce qui convient pour la plupart la régén.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Sérum de veau fœtal	Invitrogen	10082
Pénicilline/Streptomycine	Invitrogen	15070
Facteur de croissance des fibroblastes basiques	Peprotech	100-18B
Diacrylate de 1,4-butanediol (90 %)	Sigma Aldrich	411744	Acronyme : C
5- amino-1-pentanol (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Acronyme : 32
Tétraéthylèneglycoldiamine > 99 %)	Molecular Biosciences	17774	Acronyme : 122
Acétate de sodium	G-Biosciences	R010
Phosphate salin tamponné	Invitrogen	14190-144
Tétrahyofurane anhydre (> 99,9 %)	Sigma Aldrich	401757
éther diéthylique anhydre (> 99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO Anhydre (> 99.9 %)	Sigma Aldrich	276855
Gélatine	Sigma Aldrich	G9391
Trypsine-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciférine	GoldBio
Température Optimale de Coupe (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rat anti-Souris CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 anti-rat IgG	Invitrogen	A11007