Les cellules souches de programmation pour angiogenèse thérapeutique utilisant polymère biodégradable nanoparticules

Summary

Nous décrivons la méthode des cellules souches de programmation pour surexprimer des facteurs thérapeutiques pour l'angiogenèse en utilisant des nanoparticules polymériques biodégradables. Les procédés décrits comprennent la synthèse du polymère, la transfection de cellules souches du tissu adipeux in vitro, et de valider l'efficacité des cellules souches programmées pour favoriser l'angiogenèse dans un modèle d'ischémie des membres postérieurs de souris.

Abstract

La croissance vasculaire contrôlée, est critique pour la régénération des tissus et la cicatrisation des plaies avec succès, ainsi que pour le traitement de maladies ischémiques telles que l'accident vasculaire cérébral, infarctus du myocarde ou les maladies artérielles périphériques. La livraison directe des facteurs de croissance angiogéniques a le potentiel de stimuler la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins, mais est souvent associée à des limitations telles que le manque de ciblage et la courte demi-vie in vivo. La thérapie génique offre une approche alternative par la délivrance de gènes codant pour des facteurs angiogéniques, mais nécessite souvent l'aide de virus, et est limitée par des préoccupations de sécurité. Nous décrivons ici une stratégie récemment mis au point pour la stimulation de la croissance vasculaire par les cellules souches de programmation pour surexprimer des facteurs angiogéniques in situ en utilisant des nanoparticules polymériques biodégradables. Plus précisément notre stratégie utilisée cellules souches comme des véhicules de délivrance, en profitant de leur capacité à migrer vers les tissus ischémiques in vivo. En utilisant les vecteurs polymères optimisés, adipeux dérivésLes cellules souches ont été modifiées pour surexprimer un gène codant pour le facteur angiogénique de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Nous avons décrit les procédés pour la synthèse du polymère, la formation des nanoparticules, la transfection de cellules souches in vitro, ainsi que des procédés pour la validation de l'efficacité des cellules souches exprimant VEGF pour la promotion de l'angiogenèse dans un modèle d'ischémie des membres postérieurs de souris.

Introduction

L'objectif global de cette technique est de promouvoir l'angiogenèse thérapeutique utilisant des cellules souches non-virale programmées surexprimant facteurs thérapeutiques au site de l'ischémie. Les cellules souches ont été modifiées ex vivo en utilisant d'abord des nanoparticules biodégradables synthétisés dans le laboratoire, et ensuite transplantées dans un modèle murin de la patte arrière ischémie pour valider leur potentiel de développement de l'angiogenèse et de sauvetage de tissu.

La croissance vasculaire contrôlée, est un composant important de la régénération des tissus succès, ainsi que pour le traitement de diverses maladies ischémiques telles que l'accident vasculaire cérébral, une ischémie des membres, et l'infarctus du myocarde. Plusieurs stratégies ont été développées pour favoriser la croissance vasculaire, y compris la fourniture d'un facteur de croissance et de la thérapie à base de cellules. ^Une Malgré l'efficacité observée dans les modèles de maladies animales, ces procédés font toujours face à des limitations telles que la nécessité de doses supra-physiologiques pour la livraison d'un facteur de croissance, ou insuffisante paracrinelibérer de cellules seules. Une stratégie possible pour surmonter les limitations ci-dessus est de combiner la thérapie des cellules souches et la thérapie génique, par laquelle les cellules souches sont programmés génétiquement ex vivo avant la transplantation de surexprimer facteurs thérapeutiques souhaitables. Cette approche a été démontrée dans divers modèles de maladies, y compris des membres postérieurs ischémie ^2, les maladies du cœur ^3, la cicatrisation osseuse ⁴ et ⁵ lésion neurologique, etc. Cependant, la plupart des techniques de thérapie génique s'appuient sur des vecteurs viraux, qui sont associés à des problèmes de sécurité tels que l'immunogénicité potentielle et la mutagenèse insertionnelle. Biomatériaux médiation livraison de gène non viral peuvent surmonter ces limitations, mais souffrent souvent de faible efficacité de la transfection. Pour accélérer la découverte de nouveaux biomatériaux pour la livraison de gène non viral efficace, des études récentes ont utilisé la chimie combinatoire et de l'approche de criblage à haut débit. Bibliothèques de polymères biodégradables tels que le poly (es β-aminotres) (PBAE) ont été développés et masquées, ce qui a conduit à la découverte des principaux polymères avec nettement amélioré l'efficacité de la transfection par rapport aux produits traditionnels de vecteurs polymères. ^6-7

Nous décrivons ici la synthèse de PBAE et la vérification de leur aptitude à transfecter des cellules souches du tissu adipeux (ADSC) in vitro, suivie d'une greffe ultérieure de ADSC génétiquement modifiées surexprimant le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) dans un modèle murin de membre postérieur ischémie . Les résultats ont été évalués par le suivi le destin des cellules en utilisant l'imagerie par bioluminescence, l'évaluation de la reperfusion tissulaire en utilisant laser Doppler imagerie de perfusion (LDPI), et la détermination de l'angiogenèse et de tissus de récupération par l'histologie.

Protocol

Une. Polymer Synthesis

1. Dans une hotte, peser 3,523 mg de diacrylate de butanediol (C) et de les transférer dans un flacon à scintillation en verre contenant un barreau d'agitation.
2. Préchauffer le 5-amino-1-pentanol (32) à 90 ° C pour solubiliser le sel, puis dans une hotte de laboratoire, peser 1,533 mg 32 et l'ajouter dans le flacon de scintillation contenant C. Cette méthode se traduira par un rapport molaire C: 32 = 1:1,2.
3. Placer immédiatement la fiole contenant à la fois des solutions sur une plaque d'agitation. Réglez la vitesse d'agitation à 600 tours par minute.
4. Transférer le flacon à scintillation à un four réglé à 90 ° C. Réglez la vitesse d'agitation à 1000 rpm pendant 4 heures. Si la barre d'agitation se coince, réduire la vitesse. Après 4 h, la vitesse inférieure à 300 tours par minute et maintenir à 90 ° C pendant 12 à 16 une autre heure.
5. Ajouter 5 g de C32 à 10 ml de tétrahydrofuranne (THF) anhydre dans un flacon à scintillation en verre contenant un barreau d'agitation. Envelopper dans du papier d'aluminium et vortex en haut jusqu'à dissolution complète.
6. Dans un flacon en verre scintillation conta séparéeining une barre d'agitation, ajouter 10 mM de Tetraethyleneglycoldiamine (122). Ajouter 40 ml de THF.
7. Placer les deux flacons (C32 et 122) sur une plaque d'agitation pendant 5 min, puis combinent ensemble. Couvrir d'une feuille et laisser à température ambiante sous agitation à 400 tours par minute pendant 24 heures. Le produit final est appelé C32-122.
8. Peser 5 x 50 ml tubes Falcon pour chaque lot de 5 g C32-122. Noter la masse de chaque tube dans un cahier.
9. Transférer 30 ml d'éther diéthylique anhydre à chaque tube Falcon de 50 ml.
10. Transférer 10 ml de C32-122 à chaque tube Falcon de 50 ml.
11. Tubes Vortex Falcon vigoureusement puis centrifuger à 2500 rpm pendant 2 min. Remarque: Le polymère extrait recueillera, à la base du tube.
12. Jeter la solution supérieure et répétez les étapes 1.9 et 1.11 deux fois de plus.
13. Placer les tubes ouverts contenant le C32-122 extrait dans le dessiccateur et vide pendant une nuit. S'assurer que tous les tubes sont protégés de la lumière.
14. Peser tous les tubes contenant du C32-122 pour déterminer la masse finale de l'polymère extrait.
15. Dissoudre le polymère extrait dans du DMSO anhydre à une concentration de 100 mg / ml.
16. Rangez le polymère dissous à -20 ° C à l'abri de la lumière et de l'humidité.

2. Cellule de semis

1. Pré-couche de la base d'un ballon de culture de tissu T-150 à 0,1% (poids / volume) de gélatine. La gélatine doit rester dans la fiole pendant 30 à 45 min. Le revêtement de la gélatine permet l'adhérence de ADSC.
2. Aspirer la gélatine du flacon T-150 pré-enduit.
3. Ajouter 4 x 10 ⁶ ADSC (≤ 3), passage dans le ballon dans 20 ml de DMEM contenant 10% de FBS, 1% de pénicilline / streptomycine et 10 ng / ml de bFGF.
4. Placer la fiole T-150 dans l'incubateur à 37 ° C, 5% _de CO2 pendant une nuit.
5. Début de la procédure de transfection, le jour suivant.

3. Préparation de nanoparticules et transfection

1. La procédure suivante concerne la préparation de nanoparticules contenant de l'ADN de plasmide de 16,1 ug par1,0 x 10 ⁶ cellules à un polymère de plasmide rapport en poids de 30:1.
2. Diluer l'ADN plasmidique (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) à une concentration finale de 120 pg / ml dans de l'acétate de sodium (25 mM) dans un tube Falcon de 15 ml.
3. Diluer C32-122 (100 mg / ml) jusqu'à une concentration finale de 3,6 mg / ml dans de l'acétate de sodium (25 mM) dans 15 ml d'un deuxième tube Falcon.
4. Mélanger le contenu de chaque tube Falcon dans un seul tube de 15 ml de faucon et vortex immédiatement en haut pendant 10 secondes.
5. Laissez le tube reposer à température ambiante pendant 10 min pour la formation des nanoparticules à se produire.
6. Alors que l'incubation, remplacer moyenne flacon de culture tissulaire avec du DMEM 7,8 ml entièrement complété par 1,0 x 10 ⁶ cellules transfectées.
7. Transférer la solution de nanoparticules dans le flacon de culture de tissus et basculer vers l'avant et vers l'arrière pour répartir uniformément.
8. Placer le ballon de culture tissulaire dans l'incubateur à 37 ° C, 5% CO ₂ pendant 4 heures.
9. Après 2 h, remplacer le nanoparticle contenant médias avec du DMEM.
10. Après une nouvelle incubation de 2 h à 37 ° C, 5% _CO2, les cellules sont prêtes pour l'injection in vivo.

4. Des membres postérieurs procédure ischémie

1. Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec les soins et l'utilisation des animaux Directives du Comité de l'Université de Stanford et protocoles APLAC approuvés. Générer le modèle murin de la patte arrière ischémie est réalisée comme décrit précédemment. ⁸ S'il vous plaît se référer à la référence pour des instructions détaillées. Une brève description est fournie ci-dessous.
2. Placer la souris sous anesthésie avec 1-3% d'isoflurane dosage par inhalation et le débit d'oxygène de 1 L / min. Assurer profondeur de l'anesthésie par pincement de l'orteil, la réduction de la fréquence respiratoire, et la léthargie.
3. Enlever les poils de la région abdominale et les deux zones de la patte arrière de la souris avec de la crème à raser.
4. Faire une incision au centre de la médiane de la cuisse vers la ligne médiane, puis couper à travers recouvrant coussinet adipeux à l'exposer l'artère fémorale.
5. Ligaturer l'artère à deux sites: le site distale (près du genou) et le site proximal (juste en aval du ligament inguinal).
6. Pour créer les ligatures, séparer l'artère de la veine et enfiler une suture en soie 5-0 autour de l'artère. Nouez l'artère avec deux noeuds de faire la ligature.
7. Retirer l'artère entre les deux points de ligature.
8. Laver la zone chirurgicale avec de la PBS, puis suturer l'incision fermée.
9. L'anesthésie peut être retiré. Garder au chaud de la souris jusqu'à ce que re-réveil. Pour les soins post-opératoires, 2-4 mg / kg de lidocaïne peut être injecté par voie sous cutanée au site d'incision avant de re-réveil. Gestion plus de la douleur peut inclure administration sous-cutanée de 0,05-0,1 mg / kg buprénorphine à 12 et 24 h. Surveillance de l'état de santé des souris une fois par jour pendant sept jours en observant les changements dans le modèle de la respiration, de la douleur ou de détresse manifeste, et la couleur de la peau.
10. Confirmez membres postérieurs ischémie par laser Doppler imagerie de perfusion.

5. Les injections de cellules

1. Lorsque les cellules transfectées et les souris sont prêts, laver les cellules transfectées avec PBS, trypsiniser, centrifugeuse, puis compter.
2. Remettre en suspension les cellules à une densité de 10 x 10 ⁶ cellules par ml dans du PBS.
3. Les suspensions cellulaires doivent être séparés dans des tubes Eppendorf distinctes en un volume de 110 ul. Cela permettra d'assurer que chaque souris reçoit une quantité égale de cellules.
4. Placer chaque souris sous anesthésie (isoflurane à 2,5%, débit de 1 L / min d'oxygène).
5. Nettoyez le site d'injection avec des lingettes alcoolisées.
6. L'utilisation d'une seringue à tuberculine de 27 G, tirer les cellules vers le haut et vers le bas dans la seringue pour assurer une suspension homogène. Dresser 100 ul de volume de suspension de cellules dans la seringue.
7. Injecter la moitié de la suspension cellulaire dans la région du muscle adducteur, puis injecter l'autre moitié dans la région des muscles du mollet. Après l'injection, laissez la seringue en place pendant au moins 15-30 secondes pourempêcher la fuite de la suspension de cellules.
8. Des contrôles appropriés pour l'étude des animaux comprennent: 1) des cellules transfectées avec un plasmide non codante (par exemple, plasmide sans aucune activité biologique), 2) les cellules seules, et 3) PBS.
9. Quand injections sont terminées, retirez la souris de l'anesthésie et garder au chaud jusqu'à ce que les re-se réveille de souris.

6. Bioluminescence Imaging

1. Pour débuter l'imagerie par bioluminescence (BLI), anesthésier les souris comme décrit ci-dessus.
2. Nettoyez le site d'injection avec des lingettes alcoolisées.
3. En utilisant une seringue à insuline, charge de 100 ul de 15 mg / ml D-luciférine (substrat pour la luciférase de luciole). Gardez substrat abri de la lumière.
4. Pour effectuer des injections intra-péritonéales, maintenez la souris par la peau du dos pour tirer leur peau tendue antérieure. Insérez l'aiguille par voie intrapéritonéale dans la région abdominale et injecter 100 ul de substrat.
5. Placer la souris dans la chambre d'imagerie IVIS de la luciférase sous anesthésie.
6. l'image de la souris avec un temps d'exposition de 1,0 min. Lorsque les paramètres sont définis, de commencer à acquérir des images.
7. Lorsque l'image est acquise, marquer la zone d'intérêt de mesurer le signal de la luciférase. Dans ce cas, marquer le membre ischémique au site cellulaire injection.
8. Continuer à mesurer le signal de la luciférase chaque 3-5 min jusqu'à ce que le signal atteint un pic et commence à décliner. C'est la valeur utilisée pour la comparaison entre les souris et sur plusieurs points dans le temps.
9. Lorsque vous avez terminé, retirez les souris de la chambre et de l'anesthésie. Gardez la souris chaude jusqu'à ce que re-réveil.

7. Perfusion Laser Doppler Imaging

1. Laser Doppler imagerie de perfusion est réalisée comme décrit précédemment. ⁸ La procédure est décrite brièvement ici.
2. Avant imagerie Doppler de la souris doit être rasé dans les zones recouvrant les deux membres postérieurs et la région abdominale pour éviter artefact dû à cheveux.
3. Lorsqu'il est préparé à l'image Doppler, le mousoi doit être anesthésiée comme décrit ci-dessus.
4. Réchauffer la souris à 36 ° C sur une plaque chauffante tout en surveillant la température du corps par un thermomètre rectal.
5. Placez la souris sur une surface noire non réfléchissante et garder anesthésié par cône. La souris doit être placée sur la face dorsale de ses membres exposés uniformément.
6. Positionner le détecteur laser Doppler à environ 15 cm au-dessus de la souris et de diriger le pointeur laser du capteur vers la région de l'aine de la souris.
7. Lorsque la souris et le capteur de Doppler sont en position, les images peuvent être prises en utilisant le logiciel LDPIwin en appuyant sur le bouton Démarrer.
8. Mesures de perfusion relatifs pourraient être prises par les deux membres postérieurs indiquant (ischémiques et non ischémiques) comme région d'intérêts (ROI). Le rapport de perfusion moyenne du membre postérieur ischémique de la non-ischémique indiquera perfusion relative.

8. Tissu procédure de récolte

1. Lorsqu'il est préparé à tis récolte de la sourispoursuivre pour l'histologie et / ou la transformation biochimique, la souris devrait être euthanasié. Ici, la souris est euthanasié en exposant à 5% d'isoflurane pendant 3-5 min, puis euthanasier la souris par dislocation cervicale.
2. Coupez la peau recouvrant entourant la circonférence des membres postérieurs à la région abdominale distale et proximale de la patte arrière. La peau est découpé à partir de la face ventrale de la surface dorsale, de sorte que la peau peut être tiré vers l'arrière au-dessus de la patte arrière pour le pied.
3. Sur tirant la peau du dos, la branche pourrait être amputé en utilisant des ciseaux de dissection à couper à l'articulation pelvienne et du fémur.
4. Deux principaux tissus sont prélevés pour analyse: les muscles adducteurs médianes et les muscles jumeaux.
5. Pour l'histologie, incorporer un ou deux tissus de la température de coupe optimale (OCT) pour cryosectioning.
6. Pour l'analyse biochimique, recueillir une ou des deux tissus dans un Eppendorf de 1,5 ml et immerger dans un bain d'azote liquide pendant au moins 2 min. Les échantillons peuvent êtrestockés à -80 ° C pour traitement ultérieur.

Results

Lors du mélange ensemble, le polymère chargé positivement (C32-122) et de l'ADN plasmide s'auto-assemble chargés négativement dans des nanoparticules. la formation de nanoparticules peut être confirmée par analyse par électrophorèse dire la complexation entre C32-122 et l'ADN plasmidique permettra d'éviter la mobilisation de l'ADN lors de l'électrophorèse. Le polymère sert de réactif de transfection pour faciliter l'absorption accrue de l'ADN dans les cellules cibles et l'expression subséquente de protéines de ...

Discussion

Nous rapportons ici une méthode pour programmer des cellules souches adultes pour surexprimer facteurs thérapeutiques utilisant non viraux, des nanoparticules biodégradables. Cette plate-forme est particulièrement utile pour le traitement de maladies où les cellules souches peuvent naturellement à la maison, tels que l'ischémie et du cancer. ^10.9 En outre, le non-viral plate-forme de délivrance de gène permet la surexpression transitoire de facteurs thérapeutiques, ce qui convient pour la plupart la régén...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Sérum de veau fœtal	Invitrogen	10082
Pénicilline/Streptomycine	Invitrogen	15070
Facteur de croissance des fibroblastes basiques	Peprotech	100-18B
Diacrylate de 1,4-butanediol (90 %)	Sigma Aldrich	411744	Acronyme : C
5- amino-1-pentanol (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Acronyme : 32
Tétraéthylèneglycoldiamine > 99 %)	Molecular Biosciences	17774	Acronyme : 122
Acétate de sodium	G-Biosciences	R010
Phosphate salin tamponné	Invitrogen	14190-144
Tétrahyofurane anhydre (> 99,9 %)	Sigma Aldrich	401757
éther diéthylique anhydre (> 99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO Anhydre (> 99.9 %)	Sigma Aldrich	276855
Gélatine	Sigma Aldrich	G9391
Trypsine-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciférine	GoldBio
Température Optimale de Coupe (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rat anti-Souris CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 anti-rat IgG	Invitrogen	A11007