Method Article

Détermination de la structure et de la coordination de complexes peptides-métalliques à l’aide de la RMN 1D et 2D 1H

DOI:

10.3791/50747

⸱

December 16th, 2013

 ,  , 
1Department of Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem, 2Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Hebrew University of Jerusalem

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La structure en solution RMN d’un peptide modèle de métallopérone avec Cu (I) a été déterminée, et un protocole détaillé allant de la préparation de l’échantillon et de la collecte de données 1D et 2D à une structure tridimensionnelle est décrit.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La liaison du cuivre (I) par les protéines de transport des métallochaperones empêche l’oxydation du cuivre et la libération des ions toxiques qui peuvent participer aux réactions d’oxydoréduction nocives. Le complexe Cu (I) du modèle peptidique d’une protéine métallopérone de liaison Cu (I), qui comprend la séquence MTCSGCSRPG (soulignée est conservée), a été déterminé en solution dans des conditions inertes par spectroscopie RMN.

RMN est une technique largement acceptée pour la détermination des structures de solution des protéines et des peptides. En raison de la difficulté de cristallisation à fournir des monocristaux adaptés à la cristallographie aux rayons X, la technique RMN est extrêmement précieuse, d’autant plus qu’elle fournit des informations sur l’état de solution plutôt que sur l’état solide. Nous décrivons ici toutes les étapes requises pour la détermination d’une structure tridimensionnelle complète par RMN. Le protocole comprend la préparation d’échantillons dans un tube RMN, la collecte et le traitement de données 1D et 2D, l’attribution et l’intégration de pics, les calculs de mécanique moléculaire et l’analyse de structure. Il est important de noter que l’analyse a d’abord été menée sans aucune liaison métal-ligand prédéfinie, afin d’assurer une détermination fiable de la structure de manière impartiale.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les peptides sont largement utilisés comme modèles de protéines, potentiels de médicaments et agents thérapeutiques à part entière. Cependant, leur petite taille et leur grande flexibilité empêchent souvent la détermination de la structure par rayons X en raison des difficultés de cristallisation.

La résonance magnétique nucléaire (RMN) peut être utilisée pour déterminer les structures et les interactions peptidiques. La méthode peut fournir des informations sur la structure locale et globale, la liaison et les interactions de faible affinité, et est applicable aux échantillons difficiles car elle peut être réalisée à l’état de solution.

Le transport du cuivre dans les systèmes biologiques est réalisé par des protéines métallopérones de cuivre intracellulaires qui se lient spécifiquement aux ions Cu (I) et les livrent à leurs protéines cibles par le biais d’une série d’interactions protéine-protéine, afin de protéger les ions de l’oxydation et d’empêcher la libération de cuivretoxique 2-5. Le site de liaison est caractérisé par la séquence conservée, MXH/TCXanyXanyC, dont la RMN et la cristallographie ont montré qu’elle se lie au Cu (I) par les ligands thiolato mous des deux résidus de cystéine, bien qu’un ligand externe supplémentaire ait également été proposé6-8. La relation structure-fonction de ces protéines a fait l’objet de recherches intensives9.

Dans l’étude présentée ici, un modèle peptidique incluant la séquence conservée des métallopérones de cuivre a été synthétisé et a réagi avec Cu (I) dans un environnement inerte. Le protocole présenté décrit les étapes de la détermination de la structure par RMN, y compris la préparation des échantillons, la collecte des données, le traitement des données, la génération de la structure et l’analyse structurelle. L’analyse s’est faite en deux étapes : tout d’abord, les structures ont été générées sans aucune information concernant le mode de liaison du peptide à l’ion cuivre. Une fois que le mode de liaison a été établi empiriquement, ces contraintes ont été introduites pour fournir une structure à haute résolution. Le mode de liaison est le point essentiel du modèle et a donc été déterminé de manière impartiale.

La détermination structurale RMN des peptides modèles est une technique extrêmement précieuse qui est souvent utilisée par les chimistes et les biologistes. Il peut être appliqué relativement facilement à différents peptides dans différentes conditions, et peut donc faire la lumière sur les mécanismes pertinents10. Comprendre le processus d’élucidation des structures permet de mieux comprendre les forces et les faiblesses des structures proposées.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation des échantillons

  1. Apo-échantillon : Dissoudre environ 1 à 2 mg du peptide dans 450 à 500 μl de solvant RMN deutéré (les solutions préférables pour les échantillons biologiques sont 10 % de D2O dans l’eau ou de d6-DMSO 11-12 si l’échantillon ne se dissout pas dans l’eau ou réagit avec celle-ci).
  2. Échantillon ayant réagi au cuivre : Dissoudre environ 1 à 2 mg du peptide avec une quantité équimolaire de sel métallique dans 450 à 500 μl de solvant RMN.
  3. Filtrer la solution à l’aide d’un verre fritté, d’un papier filtrant ou de toute autre technique qui convient aux composés étudiés et ne les adsorbe pas. Ceci est essentiel pour éliminer toutes les particules métalliques, qui affecteront l’homogénéité.
  4. Transférez la solution dans un tube RMN et fermez-le. Assurez-vous que la qualité du tube correspond à la force de l’aimant utilisé (pour plus de détails, voir le tableau de l’équipement).
  5. Si l’échantillon est sensible à l’oxygène, ces étapes doivent être effectuées dans un environnement inerte et le tube scellé pour éviter l’oxydation.

2. Collecte et traitement des données RMN13

  1. Enregistrer les spectres 1D 1H des échantillons ayant réagi en apo- et en cuivre et comparer. Le spectre peptidique contenant du cuivre devrait montrer un changement significatif de changement chimique dans la région des amides et les pics se sont résolus puisque l’apopeptide est flexible et présente une moyenne de conformations, mais en réagissant avec le cuivre, les amides peptidiques liés ont une structure unique (Figure 2).
    1. Si le spectre est inchangé, on suppose que la réaction a échoué.
    2. Si l’échantillon devient vert, le cuivre se sera oxydé dans l’atmosphère, ce qui peut modifier ses propriétés de liaison.
    3. Dans les deux cas, l’échantillon devra être refait.
  2. Trouver des conditions de température optimales pour les mesures RMN qui permettent un chevauchement minimal des résidus d’amide avec des largeurs de raie étroites.
  3. Mettre en place des expériences RMN COSY14, TOCSY15 et NOESY16 ou ROESY17 dans des conditions identiques (température, pH, etc.) et les exécuter en séquence.
    1. Les expériences COSY (figure 3) et TOCSY (figure 4) détecteront respectivement les interactions par liaison entre protons et protons adjacents et à plus longue portée. Le spectre COSY donne des informations sur les corrélations HN-Hα tandis que le spectre TOCSY donne, en plus des informations sur HN et d’autres protons hiphatiques de résidus corrélés.
      2. Les
    2. expériences NOESY et ROESY (figure 5) détectent la proximité à travers l’espace sans dépendre des liaisons pour fournir des informations structurelles. Le choix entre les deux se fait en fonction de la taille effective du composé et de l’intensité du champ. Certaines de ces combinaisons donnent des signaux théoriques zéro (figure 6) et une expérience ROESY devra être exécutée pour détecter les interactions NOE10,18.
    3. Si l’échantillon est dans l’eau, les expériences doivent comporter un élément de suppression de l’eau. Ceci est accompli le plus efficacement en utilisant des pentes19. Dans ce cas, il est avantageux de refaire l’échantillon, une fois attribué, en D2O pur pour obtenir des interactions avec et parmi les hydrogènes Hα.
    4. Optimisez la durée des temps de mélange TOCSY et NOESY ou ROESY en exécutant un certain nombre d’expériences courtes pour trouver une accumulation maximale du signal avec une perte minimale à la diffusion de spin. Assurez-vous qu’il s’agit de la région linéaire de la courbe d’accumulation. Les valeurs courantes pour les peptides dans les champs de 600 MHz comprennent des temps de mélange d’environ 100 ms pour les expériences TOCSY et de 150 msec pour les expériences NOESY ou ROESY.
    5. Exécutez des expériences 1D entre chaque expérience pour vous assurer que la composition de l’échantillon reste constante tout au long de l’acquisition des données (Figure 7).
  4. Traitez les spectres à l’aide de fonctions d’apodisation appropriées pour obtenir une résolution maximale avec une perte minimale d’intensité du signal, en ajoutant un remplissage zéro dans la dimension t1.
    1. Corrigez ensuite la ligne de base dans la dimension F2 puis F1 avec une fonction polynomiale quadratique.
    2. Calibrez soigneusement le décalage chimique des spectres en fonction de l’eau résiduelle ou des pics de DMSO dans les solvants respectifs en fonction de leur décalage par rapport aux étalons connus (TMSP ou TMS, respectivement).

3. Attribution et intégration des pics à l’aide de SPARKY20

  1. Préparez un ensemble de spectres COSY et TOCSY superposés sur le spectre NOESY ou ROESY (Figure 8).
  2. Attribuez tous les pics NOE dans le spectre selon la méthodologie d’assignation séquentielle développée par Wüthrich21.
    1. Commencez par attribuer des pics qui chevauchent les signaux TOCSY dans la région d’empreinte, car cela facilitera les entrées ultérieures d’assignation de pics avec le programme SPARKY (Figure 9). Enregistrez le décalage chimique d’affectation (Figure 10) et les valeurs 3JHNHα (Figure 11).
  3. Traduisez les pics en contraintes de distance et les valeurs 3JHNHα en angles dièdres.
    1. Cela peut être fait en intégrant les pics à partir du programme et en les traduisant en contraintes de distance en utilisant une interaction de distance connue (comme la distance entre deux protons du groupe méthylène ou des atomes d’hydrogène aromatique d’un acide aminé aromatique).
    2. Si les pics se chevauchent et que les méthodes d’intégration ne peuvent pas être utilisées, ils peuvent être étiquetés comme fort-moyen-faible-très faible par estimation visuelle, et ces désignations peuvent être traduites en distances allant jusqu’à 2,5, 3,5, 4,5 et 5,5 Å, respectivement. Ceci pour être le plus efficace dans le travail avec des peptides.
    3. Les valeurs 3JHNHα sont indicatives des angles dièdres selon l’équation de Karplus où la plupart des valeurs de couplage données peuvent résulter de plus d’un angle dièdre. Ceux-ci peuvent être indicatifs d’une structure secondaire (hélices ou feuilles), de bobines aléatoires ou de moyennes conformationnelles de celles-ci. Par conséquent, il est important d’utiliser les contraintes avec précaution ou de les utiliser comme confirmation des résultats conformationnels.

4. Calculs de mécanique moléculaire pour générer un ensemble de structures à l’aide de XPLOR22

  1. Importez les contraintes de distance et les angles dièdres avec le format correct pour XPLOR. (Figure 12, contraintes interrésiduelles uniquement). XPLOR recherchera dans l’espace conformationnel pour trouver des structures qui adhèrent aux contraintes chimiques géométriques canoniques, telles que les longueurs de liaison, les angles, la chiralité, etc., en plus des contraintes de distance trouvées expérimentalement, pour générer un ensemble dans lequel aucun des paramètres ci-dessus n’est violé. Celui-ci constituera l’ensemble de départ.
  2. La première détermination de la structure se fera sans utiliser de contraintes sur le métal. Cela montrera quels résidus participent à la liaison du métal sans aucun biais. Passez à l’étape 4.4.
  3. En plus des contraintes de distance dérivées de la RMN, ajoutez des contraintes de liaison métallique aux résidus déterminés.
    1. Ajoutez les paramètres appropriés pour décrire l’ion métallique et sa topologie.
    2. Les informations physiques appropriées (masse, longueurs de liaison avec d’autres atomes, angles et paramètres de répulsion non liants) doivent être saisies dans le fichier de paramètres.
    3. Ajoutez les informations de liaison au fichier de topologie : quelles liaisons sont formées et rompues et quelles charges formelles sont modifiées à la suite de la liaison.
  4. Créez un petit ensemble de 10 membres.
    1. Introduisez les contraintes progressivement, en commençant par les interactions de dorsale à dorsale, puis de dorsale à sidechain, puis d’interactions sidechain à sidechain, et en passant d’interactions intra-résiduelles, séquentielles à des interactions de plus en plus longues. Cela facilite l’identification des erreurs dans l’affectation.
    2. Introduire l’énergie NOE sous la forme d’un potentiel de puits carré avec une constante de force constante de 50 kcal/mol•Å2. Le recuit simulé doit être effectué avec 1 500 pas de 3 fsec à 1 500 K et 3 000 pas de 1 fsec pendant le refroidissement à 500 K. Enfin, minimisez les structures à l’aide de la minimisation de l’énergie du gradient conjugué pour 4 000 itérations ; il s’agit de variables qui peuvent être modifiées dans XPLOR.
  5. Créez un ensemble final de 50 membres. Effectuez les pas de l’étape 4.4 sur l’ensemble entier.
    1. Indiquez le nombre de chaque type d’interaction NOE qui a été trouvé, comme le montre la figure 13.
  6. Créez un ensemble de structures qui adhèrent à la géométrie chimique canonique et aux contraintes empiriques dérivées de la RMN.
    1. Indiquez le nombre total de conformations, le nombre de celles qui ont des violations des contraintes dérivées de la RMN et le RMSD de l’ensemble entier, à la fois du squelette et de toutes les valeurs RMSD des atomes lourds.

5. Analyse de la structure

  1. L’ensemble résolu représente l’espace conformationnel adopté par le peptide lors de la mesure RMN. La flexibilité locale peut changer dans différentes régions de la molécule et cela peut être attribué à des raisons structurelles ou fonctionnelles (le but de l’analyse structurelle est de déterminer la base structurelle de la stabilité et du mécanisme d’action).
    1. Importez toutes les conformations de la structure dans le programme MolMol23 pour créer un ensemble de départ (Figure 14).
  2. Examinez l’ensemble pour déterminer la stabilité locale de la molécule.
    1. Déterminez les valeurs RMSD du squelette et de la chaîne latérale en sélectionnant les régions suivantes à quatre résidus le long de la séquence et en demandant au programme de calculer la RMSD à la structure d’énergie la plus basse ou à la moyenne.
    2. Déterminez quelles régions de la molécule présentent une stabilité locale (Figure 15) en traçant le RMSD local en fonction de la séquence.
    3. Superposez l’ensemble le long de cette région de la molécule et utilisez cet ensemble pour une analyse plus approfondie (Figure 16).
  3. Choisissez des conformations de basse énergie qui adhèrent aux contraintes dérivées de la RMN (non violées). Ceux-ci formeront « l’ensemble basse énergie ».
    1. Indiquez le nombre de conformations dans l’ensemble, les critères de sélection et les valeurs RMSD définies à l’étape 4.6.1.
    2. Si le mode de reliure métallique a déjà été déterminé, passez à l’étape suivante. Sinon : Analysez l’ensemble de basse énergie et déterminez quelles chaînes latérales de résidus sont à proximité correcte les unes des autres pour pouvoir lier l’ion métallique. Une fois ceux-ci déterminés, revenez à l’étape 3.3 et refaites l’analyse en incluant les données de liaison au cuivre (Figure 17 pour l’ensemble et Figure 18 pour le conformateur de basse énergie).
  4. Examinez l’ensemble et déterminez la structure secondaire locale au sein de la molécule à l’aide des paramètres de recherche par défaut du programme MolMol. Les structures secondaires sont maintenues par la liaison hydrogène et indiquent des régions stables de la molécule.
    1. Déterminez la structure secondaire de chaque conformateur (Figure 19).
      1. Créez un tableau du pourcentage de conformistes de l’ensemble qui montrent chaque structure secondaire.
      2. Déterminez si les régions de structure secondaire chevauchent les régions qui ont été déterminées comme étant les régions stables par la RMSD locale. C’est souvent le cas.
  5. Déterminez les distances et les liaisons hydrogène à l’intérieur de la molécule.
    1. Importez l’ensemble dans Chimera24.
    2. Utilisez Chimera pour déterminer les distances intramoléculaires entre les atomes soupçonnés de liaison métallique. Calculez les distances moyennes dans l’ensemble.
    3. Utilisez Chimera pour déterminer les liaisons hydrogène intramoléculaires dans chaque conformateur de l’ensemble (Figure 20), en utilisant les paramètres par défaut de liaison hydrogène relâchés (de 20 %) du programme.
    4. Créez un tableau du pourcentage de conformeurs de l’ensemble qui montrent chaque liaison hydrogène. Les liaisons hydrogène qui se répètent dans la majorité des conformations indiquent une liaison stable qui ajoute à la stabilité de la structure.
  6. Déterminer les interactions électrostatiques au sein de la molécule.
    1. Identifiez les interactions entre les sidechains chargés.
    2. Créez un tableau du pourcentage de conformeurs de l’ensemble qui montrent chaque interaction électrostatique.
  7. Calculez la distribution du potentiel électrostatique à l’aide du champ de force Amber25 dans le programme Delphi26.
    1. Choisissez une seule conformation représentative de l’ensemble sur laquelle effectuer les calculs de potentiel électrostatique.
    2. Dérivez le potentiel électrostatique à l’aide de l’équation de Poisson-Boltzman et d’un calcul coulombien complet. Les paramètres requis comprennent la force ionique de la solution, les valeurs diélectriques de la solution (80 pour l’eau ; 40 pour le DMSO) ; le peptide interne (généralement autour de 5,0) ; la taille de la grille (généralement 65'65'65 points) ; et la distance minimale entre le peptide et le bord de la grille (10 Å). Les résultats sont généralement assez robustes par rapport à ces valeurs, car le résultat principal est régi par le peptide lui-même (Figure 21).
    3. Examinez le potentiel électrostatique cartographié sur la surface de Van der Waals du peptide (Figure 22).
    4. Examinez les iso-surfaces de potentiel électrostatique, qui décrivent des positions ayant le même potentiel. Trouvez des iso-surfaces qui suggèrent une pertinence biologique, telles que des surfaces positives ou négatives étendues qui pourraient attirer ou repousser d’autres protéines ou ligands, ou des distributions qui indiquent une signification, telles que la distribution amphipathique ou des taches de propriétés différentes (Figure 23).
  8. Résumez toutes les constatations structurelles pour voir comment elles se renforcent mutuellement.
  9. Répétez les étapes 4.3 à 5.7.4 le cas échéant.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans le cadre d’une étude en cours de modèles de protéines de liaison au cuivre, la structure de la séquence conservée MT/HCXXC au sein du peptide linéaire MTCSGCSRPG a été déterminée par RMN à l’état de solution. Le peptide a réagi avec du CuCl dans un environnement inerte et le pH a été mesuré à ~3,0 par un bâtonnet universel. La région amide du peptide a montré une expansion lors de la réaction avec le cuivre, de 6,7-8,5 à 6,6-9,0 ppm (Figure 2). L’élargissement de la ligne dû à une légère oxydation d...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La contribution de l’information structurelle à la compréhension des mécanismes de liaison est bien acceptée. Les peptides sont utiles comme modèles pour la liaison et les interactions protéiques ; cependant, ils ne se prêtent pas à la méthode principale de détermination de la structure, la cristallographie aux rayons X. La RMN est particulièrement utile pour ces systèmes, car les structures peuvent être facilement résolues en solution. C’est particulièrement le cas des métallopérons-mimétiques qui nécessitent en outre l...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Human Frontier Science Program (Bourse pour jeunes chercheurs (RGY)0068-2006) pour son soutien financier.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Avance DMX 600 MHz SpectromètreBruker
Tubes d’échantillonnage RMN²Wilmad535-PP
Boîte à gantsMBraunLM05-019
Lyophilizer  ;   ;VirTisbenchtopK
PeptideBioChemiaSur mesure>95 %
de pureté Chlorure de cuivre (1)Aldrich224332
Acide chlorhydriqueBioLab231-595-7
Hydroxyde de sodiumGadot1310-73-2
d6-DimethylsulfoxideAldrich236926
Oxyde de deutériumAldrich151882

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robinson, J. A. Protein epitope mimetics as anti-infectives. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 379-386 (2011).
  2. Huffman, D. L., Function O'Halloran, T. V. structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annu. Rev. Biochem. 70, 677-701 (2001).
  3. Tapiero, H., Townsend, D. M., Tew, K. D. Trace elements in human physiology and pathology. Copper. Biomed., & Pharmacotherapy. 57, 386-398 (2003).
  4. Boal, A. K., Rosenzweig, A. C. Structural Biology of Copper Trafficking. Chem. Rev. 109, 4760-4779 (2009).
  5. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. J. Inorg. Biochem. 107, 129-143 (2012).
  6. Wernimont, A. K., Huffman, D. L., Lamb, A. L., O'Halloran, T. V., Rosenzweig, A. C. Structural basis for copper transfer by the metallochaperone for the Menkes/Wilson disease proteins. Nat. Struct. Biol. 7, 766-771 (2000).
  7. Singleton, C., Hearnshaw, S., Zhou, L., Le Brun, N. E., Hemmings, A. M. Mechanistic insights into Cu(I) cluster transfer between the chaperone CopZ and its cognate Cu(I)-transporting P-type ATPase, CopA. Biochem. J. 424, 347-356 (2009).
  8. Hearnshaw, S., et al. A Tetranuclear Cu(I) Cluster in the Metallochaperone Protein CopZ. Biochem. 48, 9324-9326 (2009).
  9. Shoshan, M. S., Tshuva, E. Y. The MXCXXC class of metallochaperone proteins: model studies. Chem. Soc. Rev. 40, 5282-5292 (2011).
  10. Shoshan, M. S., et al. NMR characterization of a Cu(I)-bound peptide model of copper metallochaperones: Insights on the role of methionine. Chem. Comm. 47, 6407-6409 (2011).
  11. Schmitt, W., Zanotti, G., Wieland, T., Kessler, H. Conformation of different S-deoxo-Xaa(3)-amaninamide analogues in DMSO solution as determined by NMR spectroscopy. Strong CD effects induced by beta I, beta II conformational change. J. Am. Chem. Soc. 118 (3), 4380-4387 (1996).
  12. Behrens, S., Matha, B., Bitan, G., Gilon, C., Kessler, H. Structure-activity relationship of the ring portion in backbone-cyclic C-terminal hexapeptide analogs of substance P - NMR and molecular dynamics. Int. J. Peptide and Protein Res. 48, 569-579 (1996).
  13. Overview TopSpin NMR - Software for NMR Data Analysis and NMR Spectra Data Procession | Bruker Corporation [Internet]. , Bruker Corporation. Available from: http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin (2013).
  14. Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. 2-Dimensionsl spectroscopy- application to nuclear magnetic resonance. J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1976).
  15. Bax, A., Davis, D. G. MLEV-17-based two-dimensional homonuclear magnetization transfer spectroscopy. J. Magn. Reson. 65, 355-360 (1985).
  16. Kumar, A., Ernst, R. R., Wüthrich, K. A two-dimensional nuclear overhauser enhancement (2D NO) experiment for the elucidation of complete proton-proton cross-relaxation networks in biological macromolecules. Biochem. Biophys. Res. Comm. 95, 1-6 (1980).
  17. Bax, A., Davis, D. G. Practical aspects of two-dimensional transverse NOE spectroscopy. J. Magn. Reson. 63, 207-213 (1985).
  18. Williamson, M. P. Chapter 3 Applications of the NOE in Molecular Biology. Annu. Reports on NMR Spectroscopy. 65, 77-109 (2009).
  19. Piotto, M., Saudek, V., Sklenar, V. Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR-spectroscopy of aqueous solutions. J. Biomol. NMR. 2, 661-665 (1992).
  20. Sparky - NMR Assignment Program. , Available from: http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky (2008).
  21. Wüthrich, K. NMR of proteins and nucleic acids. , J. Wiley & Sons Inc. (1986).
  22. Nilges, M., Kuszewski, J., Brünger, A. T. Comp. aspects study biol. macromol. by NMR. , Plenum Press. (1991).
  23. Koradi, R., Billeter, M., Wüthrich, K. MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures. J. Molecular Graphics. 14, 51(1996).
  24. Pettersen, E. F., et al. UCSF chimera - A visualization system for exploratory research and analysis. J. Computational Chem. 25, 1605-1612 (2004).
  25. Pearlmen, D. A., et al. AMBER, a package of computer programs for applying molecular mechanics, normal mode analysis, molecular dynamics and free energy calculations to simulate the structural and energetic properties of molecules. Comp. Phys. 91, 1-41 (1995).
  26. Honig, B., Sharp, K., Yang, A. S. Macroscopic models of aqueous solutions- biological and chemical applications. J. Phys. Chem. 97, 1101-1109 (1993).

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