La chaleur induite par un antigène de récupération: une méthode efficace pour détecter et identifier les types de cellules progénitrices adultes au cours de l'hippocampe neurogenèse

Résumé

Au cours de la neurogenèse de l’hippocampe adulte, un ensemble distinct de marqueurs génétiques est exprimé lorsqu’une cellule souche neurale quiescente progresse séquentiellement et se développe en un neurone fonctionnellement intégré dans le circuit. En utilisant la récupération d’antigènes induite par la chaleur, les types de cellules progénitrices qui sont autrement difficiles à détecter sont identifiés avec une efficacité accrue.

Résumé

Les méthodes traditionnelles de l'immunohistochimie (IHC) suivantes fixation du tissu permettent de visualiser différents types de cellules. Ceux-ci se déroulent généralement avec l'application de l'anticorps à lier des antigènes et identifier les cellules dont les caractéristiques sont fonction de la biologie et de développement inhérente. Neurogenèse hippocampique adulte est un processus séquentiel, dans lequel une cellule souche neurale de repos peut être activée et de passer par les étapes de prolifération, la différenciation, la maturation et l'intégration fonctionnelle. Chaque phase se distingue avec une morphologie caractéristique et la régulation positive des gènes. L'identification de ces phases est important de comprendre les mécanismes de régulation en jeu et toute modification dans ce processus qui sous-tendent la physiopathologie des troubles débilitants. Notre approche d'extraction de l'antigène induit par la chaleur permet d'améliorer l'intensité du signal qui est détecté et permet une identification correcte du type de cellules progénitrices. Comme on le verra dans cepapier, il permet surtout de nous de contourner les problèmes actuels dans la détection de certains types de cellules souches.

Introduction

Neurogenèse, la génération de nouveaux neurones à partir de cellules souches neurales, est maintenant connu pour se produire en permanence à l'âge adulte dans deux régions spécialisées dans le cerveau. Il s'agit notamment de la zone sous-ventriculaire (SVZ) du bulbe olfactif et la zone sous-granulaire (SGZ) du gyrus denté de l'hippocampe. Au cours de la dernière décennie, le domaine de la neurogenèse hippocampique adulte a vu d'importants travaux. La région a suscité beaucoup d'intérêt depuis les nouveaux neurones dans le SGZ contribuent à une meilleure plasticité neuronale qui peut maintenir les fonctions spécifiques du cerveau ^1-5. Adulte neurogenèse hippocampique a été impliqué à jouer un rôle important dans la régulation de l'humeur, la régénération et l'apprentissage et la mémoire. Ainsi, il ya eu un effort concerté pour comprendre le développement et la régulation des neurones dans cette riche niche neurogène.

Un aspect inévitable et important d'étudier la neurogenèse hippocampique adulte est l'identification de station séparéeges qu'une cellule souche neurale activé traverse sur son chemin pour devenir un neurone entièrement fonctionnel. Dans ce procédé, la cellule souche neurale de repos est activé et passe à travers une série de types de cellules progénitrices précoces actives actif et à la fin (Figure 1). Ces populations distinctes de cellules progénitrices neurales peuvent être identifiés par la morphologie et de leur expression de marqueurs moléculaires tels que MCM2, la nestine, TBR2 et Doublecortin (DCX) et NeuN qui guident la conversion de RGLs dans leurs types de cellules précurseurs respectifs. La nestine est une protéine de filament intermédiaire qui est exprimée dans les cellules gliales en forme radiales et certains types de cellules progénitrices précoces. Un autre marqueur est TBR2 qui est spécifiquement exprimé dans les cellules progénitrices amplification. L'expression du transgène TBR2 est initialement désactivée dans les cellules de type 1 (radiale gliales comme), activé à travers les type 2a, progéniteurs de type-2ab et Type-2b et éteint parmi les plus différenciée de type 3 et immatureneurones (Figure 1). DCX est un marqueur de la migration neuronale qui est exprimé dans le type 2ab, Type-2b et de type 3 progéniteurs neuronaux. En utilisant cette combinaison de trois marqueurs, nous pouvons étiqueter sous-types distincts de cellules progénitrices neurales. Il s'agit notamment du type 1 (MCM2 + nestine + TBR2-), de type 2a (MCM2 + nestine + TBR2 +), Type-2ab (MCM2 partielle + nestine-TBR2 + et partielle MCM2 + TBR2 + DCX-), Type-2b ( MCM2 + TBR2 + + DCX) et de type 3 (MCM2 + TBR2-DCX +). Cellules post-mitotiques tels que les neurones immatures et fonctionnellement intégrés peuvent être identifiés par l'utilisation de DCX et le marqueur neuronal mature, NeuN.

Les méthodes traditionnelles d'IHC utilisent des anticorps pour identifier des antigènes de types de cellules spécifiques sur la base de leur expression des gènes. Après visualisation grâce à des techniques d'imagerie à haute résolution telle que la microscopie confocale peut être utilisée pour leur identification. Toutefois, actuellement, il ya des problèmes qui existent avec ces méthodes qui ne permettent pas l'identification efficace desles cellules gliales comme radiaux et progénitrices début types de cellules. Il est difficile d'identifier ces différents types cellulaires particuliers, car l'anticorps n'est pas appliqué capable de pénétrer et de se lier de manière efficace la protéine nestine. La nestine est la protéine de filament intermédiaire qui comprend les processus radiales produites par la cellule de cellules gliales en forme radiale. La liaison inefficace d'un anticorps à l'antigène peut être le résultat de nombreux facteurs, y compris le temps de fixation, de la température et de la technique utilisée ^7.6. Pour aider à résoudre ces problèmes, nous avons développé une réaction antigène-extraction, ou de méthode "d'ébullition". En plus de la nestine, ce procédé de récupération d'antigène permet également d'améliorer la coloration pour les autres marqueurs tels que Ki67, BrdU, la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), TBR2 et MCM2. Notre méthode combine ensemble des approches chimiques et physiques. Elle implique la fixation chimique du tissu dans du paraformaldéhyde et ultérieur à haute température d'ébullition de minces sections coronales de l'hippocampe dans un tampon d'un dénaturant et chaotroptraitement ic. Cela améliore l'accessibilité de l'antigène à l'anticorps, permet d'améliorer la spécificité des anticorps et permet une meilleure identification des types de cellules progénitrices. Notre approche est simple à utiliser nécessitant des outils et des réactifs pour la plupart déjà disponibles dans le laboratoire. Nous avons utilisé intensivement pour étudier le développement des cellules souches neurales et leur régulation par des facteurs environnementaux génétiques ou extrinsèques intrinsèques ^8.

Protocole

1. Pré-immunohistochimie : perfusion et histologie

1. Perfuser des souris selon un protocole transcardique général adapté aux souris et extraire le cerveau en paraformaldéhyde (PFA) à 4 %.
2. Laissez les cerveaux dans le PFA pendant une nuit à 4 °C (par exemple un tube conique de 10 ml rempli de PFA). Conserver dans le PFA pendant au moins 12 à 24 heures, pas plus de 36 heures pour une fixation complète. Après une fixation nocturne, videz le PFA du tube conique mais laissez les cerveaux à l’intérieur. Versez 30 % de saccharose dans le tube et lavez les cerveaux pendant 5 secondes pour éliminer tout PFA résiduel. Enfin, remplissez à nouveau le tube contenant des cerveaux avec 30 % de saccharose. Conservez les cerveaux dans du saccharose à 4 °C jusqu’à ce qu’ils coulent au fond du tube.
3. Coupez des sections de cerveau de 40 μm sur un microtome. Consultez un atlas cérébral de souris pour commencer à collecter des sections du début du gyrus denté jusqu’à sa fin. Conservez les sections dans une solution antigel (une recette simple est de 300 g de saccharose dans 500 ml de PBS 0,1 M et 300 ml d’éthylène glycol) jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’immunohistochimie.
4. Montez le tissu coupé sur des lames de microscope spécialement conçues pour adhérer fortement au tissu. Ces lames offrent une forte adhérence aux tissus pendant la phase d’ébullition. Après avoir monté le mouchoir, veuillez laisser sécher la lame pendant 10 minutes ou jusqu’à ce qu’elle soit complètement sèche. Le séchage peut être accéléré si la diapositive est posée contre une surface verticale avec le bord inférieur de la diapositive sur une serviette en papier. Si plus d’une diapositive est montée, les autres diapositives peuvent être laissées sèches pendant cette période (1 à 2 heures suffisent) jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à passer à l’étape suivante.
5. Une fois la lame sèche, laver avec du PBS trois fois pendant 5 minutes chacune et sécher à nouveau (tampon PBS = 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0119 M Na₂PO₄). Cela permet de s'assurer que tout produit chimique antérieur (tel que le glycérol provenant de la solution de stockage antigel) est suffisamment éliminé et ne peut pas nuire à l'adhérence du tissu à la lame.

2. Préparation des réactifs et des équipements mineurs

1. Préparez la solution A (0,1 M ou 19,21 g/l d’acide citrique) et la solution B (0,1 M ou 24,9 g/l de citrate trisodique) dans lesquelles des sections de tissu seront bouillies.
2. Dans un cylindre gradué, mélanger 9 ml de la solution A et 41 ml de la solution B. Ajouter 450 ml de ddH₂O à ce mélange.
3. Versez ce mélange dans un récipient vide (par exemple, une boîte d’embouts de pipette vide) qui va au micro-ondes.

3. Récupération d’antigènes induite par la chaleur

1. Faire bouillir la solution préparée à l’étape 2 pendant 5 min à réglage standard dans un micro-ondes standard. La solution commencera à bouillir à 100 °C ou plus.
2. Une fois l’ébullition terminée, retirez soigneusement le récipient du micro-ondes et placez-y des lames séchées, en vous assurant que la face de la diapositive avec des sections d’hippocampe est tournée vers le bas et entièrement exposée au liquide. Si possible, placez les diapositives en biais contre les parois de la boîte et empilez d’autres diapositives autour d’elles. Assurez-vous que leur « ajustement » à l’intérieur de la boîte est bien ajusté afin que les glissières n’aient pas d’espace pour se déplacer les unes sur les autres.
3. Faites bouillir ce mélange avec des lames pendant 7 min au micro-ondes avec les réglages standard. La solution bouillira pendant ce temps à 100 °C ou plus.
4. Pendant cette étape d’ébullition, remplissez deux seaux à glace à moitié avec de la glace.
5. Une fois l’ébullition terminée à l’étape 3.3, retirez le récipient du micro-ondes et placez-le dans l’un des seaux à glace. Versez le reste de la glace de l’autre seau tout autour du récipient et couvrez-le complètement. Laissez reposer pendant 1 heure.

4. Coloration primaire et secondaire des anticorps

1. À la fin de la période d’attente de 1 heure, retirez les lames du récipient et lavez-les avec le tampon TBS-T 3x pendant 5 minutes chacune. N’importe quel appareil peut être utilisé pour effectuer ces lavages de base. (Tampon TBS = 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, TBS-T = 0,05 % de tampon Triton X-100 TBS, TBS-TT = 4 % de sérum d’âne TBS-T tampon).
2. Après le lavage, laissez sécher les diapositives dans un endroit sombre (par exemple à l’intérieur d’un tiroir de banc, placez une serviette en papier à l’intérieur du tiroir et inclinez la glissière contre celui-ci) pendant 5 à 10 minutes ou jusqu’à ce que la diapositive soit complètement sèche. Pendant cette période, préparez une chambre pour la coloration primaire des anticorps pendant la nuit. Une chambre de coloration simple peut inclure un récipient avec une grande surface remplie de ddH₂O et une platine à l’intérieur du récipient, sur laquelle la lame peut être posée au-dessus du ddH₂O.
3. Une fois la lame sèche, tracez un contour autour des sections de tissu à l’aide d’un stylo hydrofuge. Au cours de l’étape 4.5, ce contour agit comme une barrière empêchant le mélange d’anticorps de s’écouler.
4. Préparez le mélange d’anticorps primaires dans le TBS-TT. Au moins 500 μl sont nécessaires pour couvrir une lame entière, par exemple, si le stock d’anticorps est à une concentration de 1:500, ajoutez 1 μl d’anticorps particulier à 500 μl de TBS-TT). Utilisez les anticorps primaires mentionnés dans le tableau des réactifs.
5. Placez la lame séchée sur le dessus de la platine dans la chambre de coloration. Ajoutez lentement 500 μl d’anticorps primaires et couvrez toute la surface. Couvrez tout l’appareil et enveloppez-le dans du papier d’aluminium pour bloquer la lumière externe. Laissez-le reposer toute la nuit à température ambiante.
6. Le lendemain, lavez la lame trois fois pendant 5 minutes chacune avec un tampon TBS-T. Laissez-le sécher dans un endroit sombre comme décrit à l’étape 4.2.
7. Préparez un mélange d’anticorps secondaires similaire à l’étape 4.4. Reportez-vous au tableau des réactifs pour les anticorps secondaires.
8. Placez la lame séchée dans la chambre de coloration comme décrit aux étapes 4.2 et 4.5. Ajoutez lentement 500 μl d’anticorps secondaires et couvrez toute la surface. Enveloppez la chambre de coloration dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière extérieure. Laissez-le reposer couvert et à l’abri de la lumière extérieure pendant au moins 2 heures à température ambiante.
9. Une fois la coloration secondaire terminée, lavez la lame trois fois pendant 5 minutes chacune avec un tampon TBS-T. Laissez sécher la diapositive dans un endroit sombre. Après séchage, mettez la solution de montage et couvrez la diapositive avec une lamelle de recouvrement en empêchant soigneusement toute introduction de bulles. Laissez la lame reposer dans un endroit sombre pendant au moins 2 heures avant l’analyse ultérieure.
10. Effectuez une analyse en accéléré ou confocale sur le tissu coloré.

Résultats

La neurogenèse hippocampique adulte est un processus séquentiel au cours duquel le type cellulaire représentatif de chaque stade peut être identifié à l'aide d'une combinaison de marqueurs. Une fixation chimique soigneuse et une récupération des antigènes améliorent l'efficacité et la détection des marqueurs qui seraient autrement difficiles à observer. L'un d'entre eux est la néstine, exprimée parmi les cellules souches neurales de type glie radiaire et certains types précoces de cellules progénitrices actives. La nésti...

Discussion

Les étapes les plus critiques pour la réussite de la récupération et de la coloration des antigènes des types de cellules progénitrices sont les suivantes : 1) utiliser des tissus bien perfusés et fixés de l’épaisseur coronale optimale ; 2) laisser suffisamment de temps pour l’ébullition et le refroidissement ultérieur pendant la récupération de l’antigène ; 3) la dextérité manuelle dans le montage de sections coronales fixes et la prévention de leurs endommagements.

Il est essentiel dans l’IH...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SuperFrost Plus Slide	Fisherbrand	12-550-15	Fournit une forte adhérence au tissu de l’hippocampe pendant l’ébullition
PVA/DABCO Milieu de montage	Sigma Aldrich	10981-100 ml
Nestin (poulet)	Aves Lab	NES	Marqueur de cellules souches neurales
GFAP (lapin)	Dako North America	Z033401-2	Marqueur de cellules souches astrocytaires et neurales
MCM2 (souris)	BD Transduction Laboratory	610701	Marqueur de prolifération
DCX (chèvre)	Santa Cruz Biotechnology	SC8066	Marqueur de neurone immature
Tbr2 (lapin)	Abcam	Ab23345	Marqueur progéniteur amplificateur
NeuN (souris)	Millipore	MAB377	Marqueur de neurone mature
Cy2 (anti-lapin)	Jackson Immunoresearch	111-226-047
Cy2 (anti-poulet)	Jackson Immunoresearch	303-165-006
Cy5 (anti-souris)	Jackson Immunoresearch	315-175-047
Cy5 (anti-chèvre)	Jackson Immunoresearch	305-165-047
DAPI	Life Technologies Corporation	D1306
Dako Pen	S2002	Dako	Stylo hydrofuge