Procédure à suivre pour le développement de la multi-profondeur circulaire transversale endothélialisées microcanaux-on-a-chip

Summary

Une plate-forme microcanaux-on-a-chip a été développé par la combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et la microfluidique. La plate-forme de micro-canaux endothélialisée imite la géométrie en trois dimensions (3D) des microvaisseaux in vivo, fonctionne sous débit de perfusion continue contrôlée, permet l'imagerie de haute qualité et en temps réel et peut être appliqué pour la recherche microvasculaire.

Abstract

Des efforts ont été concentrés sur le développement des essais in vitro pour l'étude des micro-vaisseaux parce que in vivo les études animales sont plus chronophage, coûteux, et l'observation et la quantification sont très difficiles. Cependant, classique dans des essais in vitro microvaisseaux ont des limites lorsqu'il s'agit de représenter in vivo microvaisseaux par rapport à la géométrie en trois dimensions (3D) et fournir un flux continu de fluide. En utilisant une combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et microfluidique, nous avons développé une multi-profondeur endothélialisées transversales circulaires microcanaux-on-a-chip, qui imite la géométrie 3D in vivo microvaisseaux et fonctionne sous perfusion continue contrôlée écoulement. Une résine photosensible refusionnable positif a été utilisé pour fabriquer un moule maître à un réseau de microcanaux de section transversale semi-circulaire. Par l'alignement et le collage des deux (PDMS) microcanaux polydiméthylsiloxane replicated du moule maître, un réseau de micro-canal cylindrique a été créé. Les diamètres des microcanaux peuvent être bien contrôlés. De plus, la veine ombilicale cellules endothéliales humaines primaires (HUVEC) ensemencées à l'intérieur de la puce ont montré que les cellules alignées de la surface intérieure des micro-canaux sous perfusion contrôlée durant pendant une période de temps entre 4 jours à 2 semaines.

Introduction

Microvaisseaux, comme une partie du système de circulation, la médiation des interactions entre le sang et les tissus, soutenir les activités métaboliques, définir microenvironnement tissulaire et jouent un rôle essentiel dans de nombreuses conditions pathologiques et de santé. Récapitulation des microvaisseaux fonctionnelles in vitro pourrait fournir une plate-forme pour l'étude des phénomènes vasculaires complexes. Cependant, classique dans des essais microvaisseaux in vitro, tels que les tests endothéliales de cellules de migration, des tests de formation de tubes endothéliaux et des analyses d'anneau aortique chez le rat et la souris, sont incapables de recréer in vivo microvaisseaux par rapport à trois dimensions géométrie (3D) et le contrôle de flux continu ^1-8. Les études de microvaisseaux utilisant des modèles animaux et in vivo, comme test cornée de l'angiogenèse, essai d'angiogenèse de la membrane chorio poussin, et le dosage de Matrigel, sont plus de temps, un coût élevé, difficile en ce qui concerne l'observation et quantifications, etsoulever des questions éthiques ^{1, 9-13.}

Les progrès de la microfabrication et technologies de puces microfluidiques ont permis à une variété de points de vue en sciences biomédicales tout en réduisant les coûts d'expérimentation élevés et la complexité associés aux animaux et in vivo études ^14, tels que les conditions biologiques contrôlées facilement et solidement et des environnements fluides dynamiques, qui n'auraient pas été possible avec les techniques conventionnelles macroscopique.

Ici, nous présentons une approche pour construire un endothélialisée microcanaux-on-a-chip qui imite la géométrie 3D in vivo microvaisseaux et fonctionne sous débit de perfusion continue contrôlée en utilisant la combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et la microfluidique.

Protocol

1. Photolithographie Fabrication de Photoresist moule maître

Le protocole suivant montre le processus pour fabriquer des microcanaux avec des diamètres compris entre 30-60 um. Pour obtenir un micro-canal avec un diamètre plus faible (inférieure à 30 pm), un seul dépôt par centrifugation de résine photosensible est nécessaire.

1. Transférer la résine photosensible de refusion du réfrigérateur à 4 ° C à la salle blanche 24 heures avant de l'utiliser et de le laisser se réchauffer à température ambiante.
2. Nettoyer une plaquette de silicium et faire cuire pendant une heure à 150 ° C pour lui permettre de se déshydrater. La déshydratation va aider l'adhérence de résine photosensible sur le substrat de silicium.
3. Spin-couche de la première couche de résine photosensible en utilisant la formulation suivante:

Étape	Temps (en secondes)	Vitesse (rpm)	Accélération
1	2	300	le plus haut
2	10	0
3	3	300	le plus haut
4	60	600	le plus haut
5	10	500	le plus haut
6	10	600	le plus haut

4. Ensuite, cuire la plaquette sur une plaque chauffante à une température de 110 ° C pendant 90 sec. Après la cuisson douce de l'épaisseur de la résine photosensible sera de 20 à 30 um.
5. Spin couche une seconde couche de résine photosensible suivant la même recette utilisée pour la première couche.
6. Doux cuire la galette à nouveau en le plaçant sur une plaque de cuisson avec une température de 110 ° C pendant 90 secondes. Après cette cuisson douce de l'épaisseur de la résine photosensible sera de 40 à 60 um.
7. Générer les maîtres-modèles positifs en exposant le PhotoRESIST à la lumière UV avec une dose d'exposition de 14 500 mJ / cm ² à travers un masque de film.
8. Diluer le développeur avec déminéralisée (DI) de l'eau (1:2 (v / v)). Rincer la plaquette à plusieurs reprises dans la solution jusqu'à ce que le motif est complètement développée. Ensuite laver la plaquette avec de l'eau DI et le sécher à l'aide d'azote gazeux.
9. Refusion: La place de la plaquette sur une plaque de cuisson avec une température de 120 ° C pendant 4 min et couvrir avec une boîte de Pétri en verre pour éviter l'évaporation du solvant. Retirer la plaque de la plaque de cuisson et laisser refroidir à température ambiante. L'épaisseur de résine photosensible après refusion sera 50-60 um.

2. Doux Lithographie Fabrication de PDMS Réseau Microchannel

1. Préparer une solution de polydiméthylsiloxane (PDMS) sur le rapport en poids de 10:01 (base: agent de réticulation) et la mélanger à fond l'aide d'un malaxeur centrifuge planétaire.
2. Moulage la solution PDMS sur le moule maître de résine photosensible refondue. Placez le PDMS coulé dans un dessiccateur pendant 15 min pour dégazer. Utilisez de l'azote gazeux pour éliminer les bulles restantes si nécessaire.
3. Cuire le PDMS dans un four à une température de 60 ° C pendant 3 heures pour lui permettre de guérir. Ensuite, retirer la couche de PDMS durci du moule maître.
4. Utilisation d'un perforateur aiguisée pour créer d'entrée / sortie par les trous des trous dans le réseau de canaux de perforation. Nettoyer la surface du PDMS en utilisant de l'azote gazeux.
5. Traiter les deux couches PDMS avec un plasma d'oxygène pendant 30 secondes à l'intérieur d'un filtre à plasma à une pression de service de 4,5 x 10 ^-2 Torr et d'un débit d'oxygène de 3,5 m ³ / min. Ensuite, aligner les surfaces du PDMS manuellement sous un microscope optique. Utilisez une goutte d'eau si nécessaire pour un meilleur contrôle de l'alignement.
6. Cuire le dispositif dans un four à 60 ° C pendant 30 min pour obtenir une liaison permanente.

3. Culture HUVEC et ensemencement dans la puce

1. Culture des HUVECs avec un milieu de culture avec L-glutamine complété avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS). Pour èmee passages d'expérience entre 2 et 5 ont été utilisés.
2. Une fois que les HUVEC sont confluentes, compter les cellules et les récolter en premier rinçage des cellules avec une solution saline tamponnée HEPES (HEPES-BSS), puis traiter les cellules avec de la trypsine / EDTA et incuber pendant 2-6 min à 37 ° C. Après le traitement à la trypsine est terminée, neutraliser la trypsine / EDTA avec une solution neutralisante trypsine. Centrifugeuse et les cellules en suspension dans un milieu de culture avec 8% de dextran pour les recueillir. Le dextran est utilisé pour augmenter la viscosité du milieu pour faciliter une meilleure ensemencement des cellules et d'attachement.
3. Traiter le dispositif avec un plasma d'oxygène pendant 5 min avec une pression de service de 4,5 x 10 ^-2 Torr et d'un débit d'oxygène de 3,5 m ³ / min. Puis charger l'appareil avec de l'eau DI et de traiter avec la lumière UV pendant 8 heures dans une hotte laminaire biosécurité pour la stérilisation.
4. Un jour avant que les cellules sont prêtes, laver l'appareil avec 1x tampon phosphate salin (PBS 1x) puis les enrober avec la fibronectine (100 pg / ml, dilbué avec 1x PBS) et incuber dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant la nuit.
5. Après le revêtement fibronectine, laver l'appareil avec PBS 1x charger puis avec un milieu de culture. Incuber le dispositif à une température de 37 ° C pendant 15 min.
6. Charger les cellules HUVEC dans un milieu de culture de 8% de dextran à une concentration de cellules de 10 ⁶ cellules / ml 4.3 x. Placer une goutte de 20 pl de cellules à une entrée du dispositif et de l'incliner pour introduire les cellules dans le canal microfluidique. Après 15 à 20 minutes, les cellules commencent à se fixer sur les parois latérales des canaux. Faites pivoter l'appareil toutes les 15 minutes pour créer une distribution plus uniforme des cellules. Si nécessaire, une charge supplémentaire peut être effectuée.

4. Configuration de perfusion à long terme

Après 5-6 h de culture statique, les HUVECs attachées vont commencer à se répandre pleinement. Mettre en place une perfusion à l'aide d'un système de pompe à seringue avec télécommande et un flux constant de 10 l / h. Perfusion peut être ajustée fou une vitesse d'écoulement plus élevée, et qui peut durer pendant une période de temps entre 4 jours à 2 semaines.

5. coloration des cellules et caractérisation de microscope

1. Lorsque les cellules atteignent la confluence intérieur de l'appareil, d'une part, laver l'appareil avec 1x PBS pour éliminer complètement le milieu. Puis charger l'appareil avec un colorant rouge dilué avec le diluant (4 pi-1 ml). Chargez le colorant similaire à la procédure de chargement de la cellule. Incuber le dispositif à l'obscurité pendant 5 min à température ambiante, puis laver le dispositif à milieu de culture pour empêcher la formation de taches. Longue période d'incubation de la teinture peut provoquer une toxicité cellulaire et disadhesion.
2. Chargez l'appareil avec un colorant bleu dilué avec PBS 1x (2 gouttes par ml). Incuber dans l'obscurité pendant 5 min à température ambiante, puis lavez soigneusement l'appareil avec 1x PBS.
3. Examiner le marquage de cellules sous un microscope optique inversé. Si la coloration était bon, charger les microcanaux avec support de fixation (3,5% paraformaldéhyde dilué avec 1x PBS), puis plongezle dispositif de fixation à moyen et couvrir complètement avec du papier d'aluminium. Stocker l'appareil dans le réfrigérateur à une température de 4 ° C pour empêcher le dispositif de se dessécher et de photoblanchiment. Le dispositif fixe est maintenant prêt pour l'imagerie confocale, ce qui peut être fait par un microscope confocal à balayage laser.

Results

Notre méthode pour fabriquer le réseau de microcanaux à plusieurs profondeur imite les géométries 3D complexes in vivo des microvaisseaux, dans lequel les micro-canaux ont des sections transversales arrondies ^15. En outre, les diamètres des parents canaux de dérivation et les canaux de fille d'environ obéissent à la loi de Murray pour le maintien de l'écoulement du fluide à un niveau requis de sorte que la résistance globale du canal est faible et les vitesses d'écoulement sont plus uniformes dans to...

Discussion

1. Maître fabrication de moule

L'un des principes directeurs pour la conception et la morphométrie vasculaire est connue comme la loi de Murray ^16, qui stipule que la distribution de diamètre des vaisseaux dans tout le réseau est régi par des considérations d'énergie minimale. Il indique également que le cube des diamètres d'un vaisseau mère à une bifurcation est égale à la somme des cubes des diamètres des vaisseaux fille (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
réactif/matériau
refusion Photoresist	AZ Electronic Materials AZP4620
Developer	AZ Electronic Materials AZ	400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Milieu de culture	Invitrogen	10372-019
NacBlue Nuclei Staining	Invitrogen	H1399
PKH Red Stain	Sigma	MINI26 et PKH26GL
Fibronectin	Gibco	PHE0023
L-Glutamine	Sigma	G7513
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14040-133
HEPES Buffered Saline Solution	Lonza	CC-5024
Trypsine/EDTA	Invitrogen	25300-062
Solution neutralisante de trypsine	Lonza	CC-5002
PDMS Agent de durcissement	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Cellules endothéliales primaires de la veine ombilicale humaine	Lonza	CC-2517
Sérum de veau fœtal	Lonza	14-501F
Diluant C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, Sondes moléculaires	R37605
Dextran	Sigma	95771
Microscopie	3,5 % paraformaldéhyde	15710-S
Equipment
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/ Dessiccateur LITE
	BelArt Products	999320237
Microscope inversé	Nikon	Eclipse Ti
Système de pompe à seringue	Appareil de Harvard	PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood	Thermo Scientific	1300 Series A2
Mélangeur centrifuge planétaire	Thinky	ARE-310
Four Isotemp	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Microscope optique	Zeiss	Invertoskop 40C
Nettoyeur plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Plaque chauffante	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Microscope confocal à balayage laser	Zeiss	LSM 510