Identification des populations spécifiques des neurones sensoriels pour l'étude des canaux ioniques exprimés

Résumé

Les neurones sensoriels afférents signalent les informations sensorielles de la périphérie vers le système nerveux central. L’identification de neurones afférents spécifiques aidera à comprendre leur physiologie. Nous décrivons une méthode de marquage rétrograde pour identifier les neurones afférents et étudions les canaux ioniques voltage-dépendants dans ces neurones à l’aide de l’électrophysiologie et de l’immunocytochimie.

Résumé

Les neurones sensoriels transmettent des signaux de diverses parties du corps au système nerveux central. Le soma de ces neurones est situé dans les ganglions de la racine dorsale qui tapissent la colonne vertébrale. Comprendre les récepteurs et les canaux exprimés par ces neurones afférents sensoriels pourrait conduire à de nouvelles thérapies pour la maladie. La première étape consiste à identifier le sous-ensemble spécifique de neurones sensoriels d’intérêt. Nous décrivons ici une méthode pour identifier les neurones afférents innervant les muscles par marquage rétrograde à l'aide d'un colorant fluorescent DiI (perchlorate de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindocarbocyanine). Comprendre la contribution des canaux ioniques à l’excitation des afférences musculaires pourrait aider à mieux contrôler l’excitabilité excessive induite par certains états pathologiques tels que les maladies vasculaires périphériques ou l’insuffisance cardiaque. Nous avons utilisé deux approches pour identifier les canaux ioniques voltage-dépendants exprimés par ces neurones, l’électrophysiologie par patch clamp et l’immunocytochimie. Alors que l’électrophysiologie et les bloqueurs pharmacologiques peuvent identifier les types de canaux ioniques fonctionnels, nous avons utilisé l’immunocytochimie pour identifier les canaux pour lesquels des bloqueurs spécifiques n’étaient pas disponibles et pour mieux comprendre le modèle de distribution des canaux ioniques dans la population cellulaire. Ces techniques peuvent être appliquées à d’autres zones du système nerveux pour étudier des groupes neuronaux spécifiques.

Introduction

Les ganglions de la racine dorsale (DRG) sont composés de soma provenant de neurones afférents innervant diverses parties du corps, et des informations importantes peuvent être obtenues en étudiant des neurones sensoriels avec différentes cibles d’innervation¹. Diverses méthodes indirectes ou invasives sont utilisées pour isoler et identifier les neurones afférents, par exemple en injectant dans le nerf des marqueurs tels que le fluorogold¹, en injectant un colorant dans les muscles par la méthode chirurgicale². Parmi les différents colorants qui ont été utilisés avec succès pour marquer les neurones et les voies neuronales, l....

Protocole

Remarque : Tous les travaux sur les animaux doivent être effectués conformément aux directives de l’établissement et aux soins aux animaux.

1. Préparation de l’animal et étiquetage

1. Anesthésie des rats : Anesthésie un rat (généralement de 150 à 400 g) à l’aide d’une injection intrapéritonéale d’un mélange de kétamine (50 mg/kg de poids corporel), de xylazine (5 mg/kg) et d’acépromazine (1 mg/kg). Vérifiez les réflexes en pinçant le pied, attendez qu’il n’y ait plus de réponse. Étant donné que la réponse anesthésique varie d’un animal à l’autre, il est préférable de déterminer l’effet des anesthésiques en testant les réflexes de d....

Résultats

En utilisant la méthode décrite ici, nous avons identifié les neurones afférents musculaires dans les ganglions rachidiens (DRG) et déterminé ensuite les canaux sodiques voltage-dépendants (NaV) exprimés par ces neurones. Les neurones afférents musculaires marqués au DiI (Figure 1C) représentaient une petite fraction de l'ensemble des neurones du DRG, avec une moyenne de 16 % des neurones (167/1047) marqués. La quantification a été réalisée en mesurant d'abord la fluorescence à l'aide d'ImageJ, puis en t.......

Discussion

Les afférences musculaires provenant des muscles triceps suraux (par exemple le gastrocnémien) ont été utilisées dans de nombreuses études pour étudier le réflexe de pression de l’effort (EPR)¹³. Compte tenu de l’intérêt suscité par l’étude des neurones sensoriels médiateurs de l’EPR, les muscles gastrocnémiens ont été sélectionnés pour l’injection de colorant. DiI a été choisi en raison de sa nature lipophile et parce qu’il n’est pas perdu du neurone par diffusion à travers la membrane plasmique inta.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NaV 1.8	Abcam	Ab93616
NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 et 1.9	Alamone Labs, Jérusalem, Israël	ASC- 001/ 009 /008 /017
Alexa Fluor anticorps secondaires	Invitrogen
			de chèvre normal
Fluoro-Gel	Microscopie électronique Sciences	17985

Sérum