Identification des populations spécifiques des neurones sensoriels pour l'étude des canaux ioniques exprimés

Résumé

Les neurones sensoriels afférents signalent les informations sensorielles de la périphérie vers le système nerveux central. L’identification de neurones afférents spécifiques aidera à comprendre leur physiologie. Nous décrivons une méthode de marquage rétrograde pour identifier les neurones afférents et étudions les canaux ioniques voltage-dépendants dans ces neurones à l’aide de l’électrophysiologie et de l’immunocytochimie.

Résumé

Les neurones sensoriels transmettent des signaux de diverses parties du corps au système nerveux central. Le soma de ces neurones est situé dans les ganglions de la racine dorsale qui tapissent la colonne vertébrale. Comprendre les récepteurs et les canaux exprimés par ces neurones afférents sensoriels pourrait conduire à de nouvelles thérapies pour la maladie. La première étape consiste à identifier le sous-ensemble spécifique de neurones sensoriels d’intérêt. Nous décrivons ici une méthode pour identifier les neurones afférents innervant les muscles par marquage rétrograde à l'aide d'un colorant fluorescent DiI (perchlorate de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindocarbocyanine). Comprendre la contribution des canaux ioniques à l’excitation des afférences musculaires pourrait aider à mieux contrôler l’excitabilité excessive induite par certains états pathologiques tels que les maladies vasculaires périphériques ou l’insuffisance cardiaque. Nous avons utilisé deux approches pour identifier les canaux ioniques voltage-dépendants exprimés par ces neurones, l’électrophysiologie par patch clamp et l’immunocytochimie. Alors que l’électrophysiologie et les bloqueurs pharmacologiques peuvent identifier les types de canaux ioniques fonctionnels, nous avons utilisé l’immunocytochimie pour identifier les canaux pour lesquels des bloqueurs spécifiques n’étaient pas disponibles et pour mieux comprendre le modèle de distribution des canaux ioniques dans la population cellulaire. Ces techniques peuvent être appliquées à d’autres zones du système nerveux pour étudier des groupes neuronaux spécifiques.

Introduction

Les ganglions de la racine dorsale (DRG) sont composés de soma provenant de neurones afférents innervant diverses parties du corps, et des informations importantes peuvent être obtenues en étudiant des neurones sensoriels avec différentes cibles d’innervation¹. Diverses méthodes indirectes ou invasives sont utilisées pour isoler et identifier les neurones afférents, par exemple en injectant dans le nerf des marqueurs tels que le fluorogold¹, en injectant un colorant dans les muscles par la méthode chirurgicale². Parmi les différents colorants qui ont été utilisés avec succès pour marquer les neurones et les voies neuronales, les colorants fluorescents comme DiI sont largement utilisés dans les tracés neuroanatomiques en raison de leur absorption rapide par les terminaisons neuronales, de leur rétention à long terme dans les neurones et de l’absence de transfert entre les neurones³. Les neurones afférents marqués avec DiI peuvent être facilement visualisés à l’aide d’un microscope fluorescent pour une étude détaillée. Cependant, l’une des limites est que des marqueurs tels que DiI peuvent être perdus dans les cellules lors de la perméabilisation cellulaire nécessaire à l’immunocytochimie avec des épitopes intracellulaires⁴. Nous décrivons ici une méthode qui utilise le DiI injecté dans le muscle squelettique pour identifier les neurones afférents musculaires dans le DRG. Nous décrivons également une méthode de perméabilisation cellulaire qui retient DiI dans le neurone tout en permettant aux anticorps d’accéder aux épitopes intracellulaires. Nous démontrons l’utilisation de l’électrophysiologie et de l’immunocytochimie pour étudier ces neurones identifiés, et décrivons les avantages distincts de chaque technique dans l’étude des canaux ioniques qui contrôlent l’excitabilité neuronale. Enfin, nous décrivons les problèmes potentiels qui peuvent entraver l’interprétation des données électrophysiologiques. Nous avons utilisé ces méthodes pour identifier les neurones afférents musculaires et cutanés et déterminer les canaux sodiques voltage-dépendants (NaV) exprimés dans ces neurones identifiés⁸. Cependant, ces méthodes peuvent être adaptées à une variété de préparations pour l’étude de sous-ensembles identifiés de neurones innervant un tissu cible particulier ou un noyau cérébral.

Protocole

Remarque : Tous les travaux sur les animaux doivent être effectués conformément aux directives de l’établissement et aux soins aux animaux.

1. Préparation de l’animal et étiquetage

1. Anesthésie des rats : Anesthésie un rat (généralement de 150 à 400 g) à l’aide d’une injection intrapéritonéale d’un mélange de kétamine (50 mg/kg de poids corporel), de xylazine (5 mg/kg) et d’acépromazine (1 mg/kg). Vérifiez les réflexes en pinçant le pied, attendez qu’il n’y ait plus de réponse. Étant donné que la réponse anesthésique varie d’un animal à l’autre, il est préférable de déterminer l’effet des anesthésiques en testant les réflexes de douleur.
2. Solution DiI : Peser la poudre DiI et la dissoudre dans du DMSO stérile à 100 % pour obtenir une solution à 1,5 % (15 mg/ml). Conservez la solution à température ambiante dans une atmosphère sèche jusqu’à utilisation.
3. Injections DiI : rasez les poils sur la zone du mollet sur les deux jambes du rat anesthésié à l’aide d’un rasoir électrique.
   1. Remplir une seringue stérile de 1 ml (aiguille de 1 po 27 g) avec 200 μl de solution de DiI à 1,5 %. Insérez lentement l’aiguille parallèlement à l’axe long de chaque muscle gastrocnémien et injectez 100 μl de DiI dans le muscle tout en reculant lentement l’aiguille hors du muscle (~10 secondes) sans se retirer du muscle.
   2. Avant de retirer l’aiguille du muscle, tirez sur le piston de la seringue pour vous assurer que le colorant ne coule plus de la pointe, attendez 10 secondes, puis retirez l’aiguille du muscle. Cette étape empêche la fuite de DiI de l’aiguille vers la peau, ce qui pourrait étiqueter les afférences cutanées.
   3. Répétez l’opération pour l’autre jambe.
   4. Attendez 4 à 5 jours pour que le DiI soit transporté du muscle au DRG.

2. Dissection et isolement neuronal

1. Solutions:
   1. Préparez la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et la solution saline équilibrée d’Earle (EBSS) selon les instructions du fabricant, filtrez, stérilisez et conservez à 4 °C.
   2. Milieu de culture (MEM Plus) : Mélanger 89 ml de milieu essentiel minimal (MEM), 10 ml de sérum fœtal bovin (FBS), 1 ml de solution de pénicilline-streptomycine, filtrer, stériliser et conserver à 4 °C.
   3. Solution de polylysine : dissoudre la poudre de bromhydrate de poly-L-lysine (10 mg/100 ml) dans une solution de borate de sodium 0,1 M, pH 8,4, filtrer, stériliser et stocker les aliquotes à -20 °C.
2. Revêtement des lamelles
   1. Nettoyez les lamelles en verre (rond de 12 mm) avec de l’éthanol à 70 % pendant 3 à 4 heures et faites-les sécher à l’air libre dans une hotte de culture stérile.
   2. Placez les lamelles séchées dans la solution de polylysine O/N.
   3. Retirer de la solution de polylysine et laver dans de l’eau distillée stérile 2 fois pendant 5 minutes chacune pour éliminer tout excès de polylysine.
   4. Séparez les lamelles, faites-les sécher dans une hotte de culture et conservez-les à 4 ^°C.
3. Mise en place pour la dissection
   1. Placez sur de la glace un bécher avec 10 ml de HBSS, une boîte de Pétri de 35 mm et une boîte de Pétri de 100 mm.
   2. Pesez les enzymes : 7 mg de collagénase, 1 mg de DNAse et 10 mg de trypsine.
   3. Préchauffez un bain-marie à 37 ^°C et placez dans le bain un tube à centrifuger de 15 ml contenant 10 ml d’EBSS pour le réchauffer.
4. dissection:
   1. Sacrifice du rat selon un protocole approuvé par l’IACUC. C du dioxyde d’arbon a été utilisé pour euthanasier le rat.
   2. Retirez rapidement le dos en ouvrant la peau du dos, retirez le tissu conjonctif et musculaire le long de la colonne vertébrale pour une meilleure exposition et retirez la section lombaire de la colonne vertébrale (extrémité de la région thoracique à l’os iliaque ; Figure 1).
   3. Placez la colonne vertébrale isolée dans la boîte de Pétri de 100 mm et, à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, appliquez une solution HBSS réfrigérée pour maintenir la préparation humide et froide.
   4. Coupez les muscles des côtés de la colonne vertébrale. Effectuez une laminectomie dorsale, à l’aide de rongeurs ou de ciseaux, et retirez délicatement l’os entourant les évidements contenant le DRG.
   5. Appliquez à plusieurs reprises du HBSS glacé (~1 ml) pendant cette procédure.
   6. Isoler le DRG en coupant les nerfs périphériques et centraux (en laissant 1 à 2 mm de nerf pour faciliter la manipulation des ganglions)
   7. Placez le DRG isolé dans la boîte de Pétri de 35 mm contenant un tampon HBSS glacé.
   8. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les DRG L-4 et L-5 aient été isolés. Le DRG thoracique peut être isolé et traité séparément en tant que témoin négatif pour le marquage DiI.
   9. Placez la boîte avec du DRG isolé sous un microscope de dissection et retirez les nerfs et les vaisseaux sanguins en excès à l’aide de micro-ciseaux et de pinces.
   10. Ouvrez le DRG pour une meilleure exposition aux enzymes, mais ne dégainez pas le DRG.
5. Dissociation des neurones DRG :
   1. Ajoutez les enzymes dans le milieu chaud EBSS (conservé dans le bain-marie). Agiter brièvement pour dissoudre et filtrer la stérilisation.
   2. À l’aide d’une pipette Pasteur stérile, placez tout le DRG dans la solution enzymatique. Réduire au minimum le volume de HBSS ajouté avec le DRG, car le HBSS diluera le mélange d’enzymes. Gazez le ballon avec 95 % d’O2 et 5 % de CO₂ pendant 60 secondes avant de bien fermer le ballon.
   3. Incuber le ballon dans le bain-marie agitateur réglé à 37 °C pendant 60 min à 240 tr/min.
   4. A la fin de l’incubation, agiter vigoureusement le ballon 50x pour dissocier le DRG⁵.
   5. Dans des conditions stériles, ajoutez 5 ml de MEM Plus dans le ballon pour arrêter les enzymes.
   6. Transvaser le contenu de la fiole dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml et centrifuger à 16 x g pendant 6 min.
   7. Retirez et jetez le surnageant, ajoutez 5 ml de MEM Plus à l’échantillon. Triturez doucement avec une pipette pour briser la pastille.
   8. Répétez l’étape de centrifugation, retirez et jetez le surnageant et ajoutez 500 μl de MEM Plus. Triturer doucement avec une pointe de pipette de 1 ml sur une pipette pour obtenir une suspension cellulaire.
   9. Placez une lamelle en verre revêtue de polylysine dans une boîte stérile vide de 35 mm. Ajoutez une goutte (~50 μl) de la suspension de la cellule au centre de la lamelle.
   10. Répétez l’opération jusqu’à ce que la solution cellulaire soit épuisée.
   11. Placez les plats de 35 mm dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 1 heure pour permettre aux neurones d’adhérer aux lamelles.
   12. Ajoutez 2 ml de milieu supplémentaire dans chaque plat et remettez dans l’incubateur.

3. Enregistrement par patch clamp

1. Solutions d’enregistrement : ces solutions permettent d’enregistrer les courants de NaV. Des exemples de solutions de composition différente peuvent être trouvés dans ces références^5-7.
   1. Solution externe : (en mM) 45 NaCl, 100 N-méthyl-d-glucamine (NMG)•Cl, 4 MnCl₂, 10 Na•HEPES et 10 glucose, avec pH = 7,4 et osmolarité = 320 mOsm.
   2. Solution interne : (en mM) 104 NMG•Cl, 14 créatine•PO₄, 6 MgCl₂, 10 NMG•HEPES, 5 Tris•ATP, 10 NMG₂•EGTA et 0,3 Tris₂•GTP avec pH 7,4 et osmolarité = 300 mOsm.
2. Mesure des courants ioniques :
   1. Tirez des électrodes d’enregistrement de capillaires en verre sur un extracteur d’électrodes et polissez à chaud les pointes à l’aide d’une microforge. La résistance des électrodes est généralement de 2-3 MΩ
   2. Identifiez les neurones DRG marqués au DiI à l’aide d’un microscope à épifluorescence et d’un cube TRITC. DiI a une longueur d’onde d’excitation de 550 nm et une longueur d’onde d’émission de 570 nm.
   3. Remplissez l’électrode en verre avec la solution interne (limage uniquement ~ 1 cm de la pointe de l’électrode) et tapotez doucement pour éliminer les bulles piégées. Placez-le dans le porte-électrode et déplacez-le vers la cellule à l’aide d’un micromanipulateur.
   4. Une fois que l’électrode touche la cellule, appliquez une légère aspiration via le tube d’aspiration, jusqu’à ce qu’un joint étanche se forme (déterminé par l’augmentation de la résistance de l’électrode).
   5. Fixez la tension de la membrane au potentiel de maintien souhaité (généralement -60 à -120 mV).
   6. Obtenez la configuration de la pince de patch à cellules entières en appliquant une aspiration plus forte pour retirer le patch de membrane à l’extrémité de l’électrode. La transition vers la configuration à cellules entières est observée électriquement sous la forme d’une augmentation du courant capacitif^8-10.
   7. Compensez la résistance série à l’aide du circuit de compensation de l’amplificateur patch clamp (utilisez au moins 80 % de compensation)^8,10.

4. Immunocytochimie

1. Fixez les neurones sur les lamelles avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 1 heure, puis perméabilisez avec 2 % de Tween 20 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 10 min.
2. Incuber les cellules fixées O/N dans une solution bloquante (sérum normal ou albumine sérique bovine) plus l’anticorps primaire, qui est un anticorps développé pour se lier à un antigène d’intérêt spécifique.
3. Incuber un ensemble de contrôle de neurones O/N dans une solution bloquante dépourvue d’anticorps primaires.
4. Lavez les lamelles avec un tampon PBS 3x pendant 5 min, suivi de 2 lavages de 5 min chacun avec 1 % de Tween 20 pour éliminer l’anticorps primaire non lié.
5. Incuber, tester et contrôler les lamelles avec l’anticorps secondaire approprié marqué par fluorescence, qui se lie à l’anticorps primaire pour permettre la visualisation.
6. Lavez les lamelles avec du PBS 3x pendant 5 minutes pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires.
7. Montez les lamelles sur une glissière en verre propre à l’aide d’un support de montage.
8. Appliquez du vernis à ongles transparent sur le bord de la lamelle pour la fixer en place. Une fois secs, visualisez les neurones et capturez des images à l’aide du logiciel accompagnant le microscope à fluorescence.
   Remarque : Dans ce travail, un microscope Nikon a été utilisé avec le logiciel NIS-elements BR 3.2. Le temps d’exposition a été optimisé et conservé le même pour les lames de contrôle et de test.
9. Mesurez l’intensité de la fluorescence et la taille des cellules à partir de neurones individuels à l’aide d’un logiciel d’imagerie tel qu’ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

Résultats

En utilisant la méthode décrite ici, nous avons identifié les neurones afférents musculaires dans DRG et avons ensuite déterminé les canaux sodiques voltage-dépendants (NaV) exprimés par ces neurones. Les neurones afférents musculaires marqués au DiI (Figure 1C) représentaient une petite fraction de la population totale de neurones dans le DRG, avec une moyenne de 16 % des neurones (167/1047) marqués. La quantification a été effectuée en mesurant d’abord la fluorescence à l’aide d’ImageJ et en traçant de...

Discussion

Les afférences musculaires provenant des muscles triceps suraux (par exemple le gastrocnémien) ont été utilisées dans de nombreuses études pour étudier le réflexe de pression de l’effort (EPR)¹³. Compte tenu de l’intérêt suscité par l’étude des neurones sensoriels médiateurs de l’EPR, les muscles gastrocnémiens ont été sélectionnés pour l’injection de colorant. DiI a été choisi en raison de sa nature lipophile et parce qu’il n’est pas perdu du neurone par diffusion à travers la membrane plasmique inta...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NaV 1.8	Abcam	Ab93616
NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 et 1.9	Alamone Labs, Jérusalem, Israël	ASC- 001/ 009 /008 /017
Alexa Fluor anticorps secondaires	Invitrogen
			de chèvre normal
Fluoro-Gel	Microscopie électronique Sciences	17985