Method Article

Préparation de neurones primaires pour visualiser Neurites à l'état congelé-hydraté utilisant microscopie cryo-électronique

DOI:

10.3791/50783

⸱

February 12th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, University of California at San Diego, 4National Center for Macromolecular Imaging, Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

In This Article

Summary

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Afin de préserver les processus neuronaux pour l'analyse ultrastructurale, nous décrivons un protocole pour le placage de neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivies par la congélation instantanée, ce qui donne des échantillons en suspension dans une couche de glace vitreuse. Ces échantillons peuvent être examinés avec un microscope cryo-électronique pour visualiser les structures à l'échelle nanométrique.

Abstract

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Neurites, les dendrites et les axones, sont des processus cellulaires neuronales qui permettent la conduction des impulsions électriques entre les neurones. Définition de la structure des neurites est essentielle pour comprendre comment ces processus qui déplacent des matières et des signaux qui facilitent la communication synaptique. microscopie électronique (EM) a été traditionnellement utilisé pour évaluer les caractéristiques ultrastructurales dans neurites, mais l'exposition au solvant organique lors de la déshydratation et l'incorporation de résine peut fausser les structures. Un objectif important non satisfait est la formulation de procédures qui permettent des évaluations structurelles pas touchés par ces objets. Ici, nous avons établi un protocole détaillé et reproductible pour la croissance et entières neurites flash-gel des différents neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivie de leur examen à la tomographie cryo-électronique (cryo-ET). Cette technique permet la visualisation en 3-D de neurites, hydratés-congelés à résolution nanométrique, facilitant assessment de leurs différences morphologiques. Notre protocole donne une vue sans précédent du ganglion de racine dorsale (DRG) neurites, et une visualisation des neurites de l'hippocampe dans leur état quasi-native. En tant que tel, ces méthodes créent une fondation pour les études futures sur neurites des deux neurones normaux et ceux qui sont touchés par des troubles neurologiques.

Introduction

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Les neurones établissent l'essentiel des circuits complexes de la fonction des systèmes nerveux central et périphérique, par l'élaboration de dendrites et des axones recevoir des informations, souvent assez volumineux, de communiquer avec des neurones en aval. L'extension des neurites joue un rôle fondamental pendant le développement embryonnaire et la différenciation neuronale et la maintenance des neurites soutient de manière critique de la fonction du système nerveux. Processus séniles également critique dans les lésions neuronales et de régénération, ainsi que des troubles du système nerveux. L'étude de l'architecture neuronale est crucial de ....

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Protocol

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Une. La préparation des plats avec EM grilles pour placage neurones primaires

  1. Examiner l'intégrité de carbone troué sur les grilles EM d'or à l'aide d'un microscope optique à un grossissement d'au moins 25X. Assurez-vous que les trous de carbone sont> 98% intact.
  2. Pour le placage neurones primaires, utiliser un brûleur Bunsen à flamme stériliser les grilles EM et en même temps rendre hydrophile. Utilisez des pinces pour ramasser la grille de EM par son bord, pas la partie quadrillée central. ATTENTION: Ne laissez jamais un brûleur Bunsen allumé sans surveillance, et ne pas utiliser de gants ou des pincettes avec des composants ....

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Results

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Avant la congélation et l'imagerie par cryo-ET, images au microscope optique devraient être prises de la grille de EM sur lequel les neurones sont de plus en plus. Neurites doivent être clairement visibles sans chevauchement important avec l'autre. Une boîte de couleur dans la figure 3A représente une zone qui est agrandie en montrer un plus fort grossissement de la figure 3B, dans laquelle neurites s'étendent à travers le treillis de la grille. Chaque grille-carré est composé d'un film.......

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Discussion

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Nous montrons que le rat neurones embryonnaires (ganglionnaires de la racine dorsale et l'hippocampe) peuvent être cultivées en microscopie électronique or (EM) des grilles et dans la glace vitreuse suffisamment minces pour leurs neurites être imagées à l'aide de 2-D cryo-EM et 3-D cryo- ET. Alors que neurites hippocampe ont déjà été imagées en utilisant cryo-ET 8,10,18,23, un protocole suffisamment détaillée pour reproduire avec succès en utilisant des dispositifs disponibles dans le commerce qui a f.......

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Disclosures

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Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

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Cette recherche a été soutenue par les subventions des NIH (PN2EY016525 et P41GM103832). SHS a été soutenue par une bourse du Programme du Centre interdisciplinaire de WM Keck Bioscience formation de la Côte du Golfe consortiums (NIH Grant No. T32EB009379) de formation supérieure nanobiologie interdisciplinaire.

SHS disséqué, a grandi et DRG et les cellules de l'hippocampe vitrifié; recueilli cryo-EM et données cryo-ET de DRG et les axones de l'hippocampe; reconstruit et couleur annoté de la série d'inclinaison. MRG disséqué et fourni cellules de l'hippocampe dans le laboratoire du MRN....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dumont #7 Pince à épilerMicroscopie électronique Sciences72803-01Pour la manipulation des grilles EM
Plats à fond de verreMatTek Corp.P35G-1.5-10CPour la croissance de l’échantillon
Grilles de microscopie électroniqueQuantifoilHoley Carbon, Au 200, R 2/2Pour la croissance de l’échantillon
Papier filtre sans calciumWhatman1541-055Pour l’échantillon de transfert
Grande pince à épiler longue à pointe plateExcelta CorporationE003-000590, 25-SAPour l’échantillon de transfert
Dispositif de vitrification et pince à épilerFEIVitrobot Mark IIIPour la congélation d’échantillons
Boîtes de stockage MinigridTed Pella, Inc.160-40Pour le stockage des grilles EM Support de
transfert cryogéniqueGatan626 Single Tilt Liquid Nitrogen Support de transfertpour l’imagerie d’échantillons
Logiciel d’acquisition de la série semi-automatiséeSerialEMhttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/Pour l’imagerie d’échantillonsLogiciel
de traitement d’imagesIMOD eTomohttp://bio3d.colorado.edu/imod/Pour le traitement d’images
Microscope électronique à transmission pour cryoEMJEOL, Tokyo200-kV JEM2100 LaB6 microscope électroniquePour l’imagerie d’échantillons
Caméra CCD 4k x 4kN/APour l’imagerie d’échantillonsd’annotation
3DVisage Imaging GmbH Amira/AvizoPour le traitement de données 3D
Logiciel pour l’assemblage numérique d’images 2DAdobeAdobe PhotoshopPour le traitement des données 2D
DMEM, High GlucoseInvitrogen11965-118Pour la culture de l’hippocampe
Acide boriqueSigma AldrichB-0252Pour la culture de l’hippocampe
Tétraborate de sodiumSigma AldrichB-9876Pour la culture de l’hippocampe
Poly-L-lysine  ;Sigma AldrichP2636-500MGPour la culture de l’hippocampe
Système de filtrationCorning430758Pour la culture de l’hippocampe
Milieu neurobasalInvitrogen21103-049Pour la culture DRG
B-27 supplémentInvitrogen17504-044Pour la culture DRG
Pénicilline/StreptomycineInvitrogen15140-122Pour la culture DRG
GlutaMAXInvitrogen35050-061Pour la culture DRG
Rat recombinant b-NGFR& D Systems556-NGPour la culture DRG
UridineSigmaU3003-5GPour la culture DRG
5'-Fluoro-2'-désoxyuridineSigmaF0503-100MGPour la culture DRG
MatrigelBD Biosciences356234Pour la culture DRG
Gatan Logiciel

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
  2. Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like ....

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