Préparation de neurones primaires pour visualiser Neurites à l&#39;état congelé-hydraté utilisant microscopie cryo-électronique

Sarah H. Shahmoradian; Mauricio R. Galiano; Chengbiao Wu; Shurui Chen; Matthew N. Rasband; William C. Mobley; Wah Chiu

doi:10.3791/50783

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Article de méthode

Préparation de neurones primaires pour visualiser Neurites à l'état congelé-hydraté utilisant microscopie cryo-électronique

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DOI :

10.3791/50783

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12 février 2014

Sarah H. Shahmoradian¹ , Mauricio R. Galiano² , Chengbiao Wu³ , Shurui Chen⁴ , Matthew N. Rasband² , William C. Mobley³ , Wah Chiu⁴

¹Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, ²Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, ³Department of Neuroscience, University of California at San Diego, ⁴National Center for Macromolecular Imaging, Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Afin de préserver les processus neuronaux pour l'analyse ultrastructurale, nous décrivons un protocole pour le placage de neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivies par la congélation instantanée, ce qui donne des échantillons en suspension dans une couche de glace vitreuse. Ces échantillons peuvent être examinés avec un microscope cryo-électronique pour visualiser les structures à l'échelle nanométrique.

Résumé

Neurites, les dendrites et les axones, sont des processus cellulaires neuronales qui permettent la conduction des impulsions électriques entre les neurones. Définition de la structure des neurites est essentielle pour comprendre comment ces processus qui déplacent des matières et des signaux qui facilitent la communication synaptique. microscopie électronique (EM) a été traditionnellement utilisé pour évaluer les caractéristiques ultrastructurales dans neurites, mais l'exposition au solvant organique lors de la déshydratation et l'incorporation de résine peut fausser les structures. Un objectif important non satisfait est la formulation de procédures qui permettent des évaluations structurelles pas touchés par ces objets. Ici, nous avons établi un protocole détaillé et reproductible pour la croissance et entières neurites flash-gel des différents neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivie de leur examen à la tomographie cryo-électronique (cryo-ET). Cette technique permet la visualisation en 3-D de neurites, hydratés-congelés à résolution nanométrique, facilitant assessment de leurs différences morphologiques. Notre protocole donne une vue sans précédent du ganglion de racine dorsale (DRG) neurites, et une visualisation des neurites de l'hippocampe dans leur état quasi-native. En tant que tel, ces méthodes créent une fondation pour les études futures sur neurites des deux neurones normaux et ceux qui sont touchés par des troubles neurologiques.

Introduction

Les neurones établissent l'essentiel des circuits complexes de la fonction des systèmes nerveux central et périphérique, par l'élaboration de dendrites et des axones recevoir des informations, souvent assez volumineux, de communiquer avec des neurones en aval. L'extension des neurites joue un rôle fondamental pendant le développement embryonnaire et la différenciation neuronale et la maintenance des neurites soutient de manière critique de la fonction du système nerveux. Processus séniles également critique dans les lésions neuronales et de régénération, ainsi que des troubles du système nerveux. L'étude de l'architecture neuronale est crucial de ....