Article de méthode

Enregistrement électrophysiologique simultané et imagerie calcique des neurones du noyau suprachiasmatique

DOI :

10.3791/50794

⸱

8 décembre 2013

 , 
1Center for Research on Occupational and Environmental Toxicology, Oregon Health & Science University, 2Department of Behavioral Neuroscience, Oregon Health & Science University

Dans cet article

Résumé

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Les procédures sont décrites pour effectuer des enregistrements simultanés du potentiel ou du courant de la membrane et des changements de concentration intracellulaire de calcium. Les neurones du noyau suprachiasmatique sont remplis de l’indicateur de calcium bis-fura-2 à l’aide d’une électrode de patch clamp dans la configuration de patch clamp de cellule entière.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des méthodes d’enregistrement simultanées d’imagerie électrophysiologique et fluorescente ont été utilisées pour étudier le rôle des changements de potentiel ou de courant membranaire dans la régulation de la concentration intracellulaire de calcium. Les conditions environnementales changeantes, telles que le cycle lumière-obscurité, peuvent modifier l’activité des réseaux neuronaux et neuronaux et l’expression d’une famille de gènes de l’horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique (SCN), l’emplacement de l’horloge circadienne maîtresse dans le cerveau des mammifères. La transmission synaptique excitatrice entraîne une augmentation de la concentration postsynaptique de Ca2+ qui est censée activer les voies de signalisation qui modifient l’expression rythmique des gènes de l’horloge circadienne. Des tranches hypothalamiques contenant le NSC ont été clampées par patch à l’aide de microélectrodes remplies d’une solution interne contenant l’indicateur de calcium bis-fura-2. Après qu’un joint ait été formé entre la microélectrode et la membrane neuronale du NKS, la membrane a été rompue par une aspiration douce et la sonde de calcium s’est diffusée dans le neurone, remplissant à la fois le soma et les dendrites. Des mesures ratiométriques quantitatives de la concentration intracellulaire de calcium ont été enregistrées simultanément avec le potentiel ou le courant membranaire. En utilisant ces méthodes, il est possible d’étudier le rôle des changements de la concentration intracellulaire de calcium produite par l’activité synaptique et l’activation du potentiel d’action des neurones individuels. Dans cette présentation, nous démontrons les méthodes permettant d’enregistrer simultanément l’activité électrophysiologique avec le calcium intracellulaire à partir de neurones SCN individuels maintenus dans des coupes de cerveau.

Introduction

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Des modifications de l’expression des gènes sont connues pour se produire dans les neurones à la suite de la signalisation synaptique. La signalisation par le glutamate, un neurotransmetteur excitateur, peut dépolariser le potentiel de la membrane neuronale, conduisant finalement à la transcription et à la traduction des gènes1,2. L’activation des récepteurs ionotropiques par le glutamate permet aux ions calcium extracellulaires de pénétrer dans la cellule, qui jouerait un rôle essentiel en tant que second messager dans l’activation de la transcription des gènes. L’évaluation de la relation entre l’activité électrique membranaire, telle que la fréquence de décharge du potentiel d’action, et les changements de la concentration intracellulaire de calcium nécessite la combinaison de deux méthodes - le clampage de patchs de cellules entières et l’imagerie quantitative de sondes de calcium fluorescentes3-5, permettant d’étudier la relation dans des neurones individuels. La technique d’enregistrement de cellule unique permet d’enregistrer l’activité de neurones individuels dans des parties identifiables du cerveau. La technique d’enregistrement de l’ensemble de la cellule permet de contrôler la tension ou le courant de la membrane, ce qui permet de manipuler expérimentalement des courants de canaux ioniques spécifiques. L’utilisation de micropipettes remplies de sondes calciques fluorescentes permet également de s’assurer que le neurone est bien rempli de sonde calcique. Cette technique présente un avantage évident lorsque l’on travaille avec des préparations de tranches de cerveau à partir de préparations de tranches adultes, car ces neurones sont particulièrement difficiles à charger à l’aide des sondes perméables cellulaires les plus courantes et réduisent les problèmes potentiels de fluorescence de fond6-8.

La lumière est la principale façon dont les mammifères ajustent leur horloge circadienne, qui est située dans le noyau suprachiasmatique hypothalamique (SCN). L’information lumineuse transduite dans la rétine est transmise 9-11 via le tractus rétino-hypothalamique (RHT) où le glutamate est libéré dans le SCN12,13. Le glutamate ouvre les récepteurs ionotropiques NMDA et AMPA situés sur les neurones du NKS, produisant un afflux de calcium et de sodium, et initiant une cascade de signalisation intracellulaire qui conduit finalement à modifier l’expression d’une famille de gènes d’horloge14-17 et à des changements de phase de l’horloge circadienne18-20. Cependant, le calcium peut pénétrer dans les neurones soit directement par les récepteurs ionotropiques du glutamate, soit par la dépolarisation membranaire et l’activation des canaux calciques voltage-dépendants (VDCC)21. Nous avons donc développé un protocole expérimental pour étudier la relation entre la concentration de calcium intracellulaire et l’activité électrique membranaire dans les neurones du NKS, comme cela se produit lors de l’activation du potentiel d’action et de l’entrée synaptique22.

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Protocole

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1. Préparation des tranches de cerveau hypothalamique

  1. Obtenir à l’avance l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) pour toute procédure impliquant des animaux. Les procédures sur les animaux décrites ici sont conformes aux directives de l’AVMA pour l’euthanasie des animaux 2013 et ont été approuvées à l’avance par l’IACUC de l’Oregon Health & Science University.
  2. Préparez 500 ml de tampon de tranchage sans le MgCl2 et le CaCl2 (tableau 1). Faites buller la solution avec 95 % d’O2 et 5 % de CO2 à température ambiante puis ajoutez le MgCl2 et le CaCl2 tout en continuant d’aérer. Ajustez l’osmolarité à 300 mOsm avec du saccharose. L’osmolarité est mesurée à l’aide d’un osmomètre à pression de vapeur.
  3. Préparez 1 L du support d’enregistrement sans le MgCl2 et le CaCl2 (Tableau 2). Faites buller la solution avec 95 % d’O2 et 5 % de CO2 puis ajoutez le MgCl2 et le CaCl2 tout en continuant d’aérer. Ajustez le pH à 7,2-7,4 avec du NaOH (10 N) et l’osmolarité à 300 mOsm avec du saccharose. L’ajout d’un tampon HEPES est facultatif et a été utilisé pour stabiliser davantage le pH.
  4. Les solutions de tranchage et d’enregistrement peuvent être conservées au réfrigérateur pendant plusieurs jours avant d’être utilisées.
  5. Préparez de l’agarose à 3 % et versez-le dans une boîte de Pétri stérile (6 mm de profondeur) et réfrigérez.
  6. Coupez trois cubes d’agarose d’environ 6 mm x 6 mm x 6 mm.
  7. Anesthésie profondément un rat Sprague-Dawley âgé de quatre à huit semaines avec de l’isoflurane. Testez la profondeur de l’anesthésie. La profondeur de l’anesthésie est jugée appropriée lorsqu’il n’y a pas de réflexe de retrait du membre postérieur suite au pincement du coussinet plantaire. Une fois correctement anesthésié, le rat est euthanasié par décapitation rapide.
  8. Retirez rapidement le cerveau en prenant soin de couper d’abord les nerfs optiques, et placez-le dans une solution de tranchage glacée saturée de 5 % de CO2 et de 95 % d’O2 et laissez refroidir pendant 2-3 min.
  9. Coupez le cerveau. Placez le cerveau à l’aide d’une pince sur un papier filtre circulaire humidifié (avec une solution de tranchage) posé sur une boîte de Pétri en verre posée sur de la glace.
  10. Coupez le cerveau coronalement pour enlever le cervelet et le tronc cérébral restants, puis le cortex rostral et les côtés, pour laisser un bloc de cerveau contenant l’hypothalamus en préservant soigneusement le côté contenant le SCN, les nerfs optiques et le chiasma optique.
  11. Étalez une fine couche de colle cyanoacrylique suffisamment grande pour fixer les blocs de cerveau et d’agarose dans une chambre de tranchage de microtome glacée mais sèche.
  12. Transférez le bloc cérébral glacé côté caudal vers le bas sur la colle, le côté contenant le SCN étant positionné pour couper en premier, les nerfs optiques formant un « V » pointant vers le haut.
  13. Placez les blocs d’agarose sur les 3 autres côtés. Remplissez la chambre d’un tampon de tranchage glacé à bulles continues avec 5 % de CO2 et 95 % d’O2. La colle cyanoacrylique se solidifiera avec l’humidité qui maintiendra le cerveau et les blocs d’agarose en place.
  14. Coupez des tranches hypothalamiques coronales (de 220 à 250 μm d’épaisseur) contenant le NSC à l’aide du microtome à lame vibrante. Généralement, une tranche est choisie où le chiasma optique mesure environ 2 à 4 mm de diamètre, apparaissant comme une bande blanche avec SCN juste dorsal apparaissant comme deux petites « indentations » dans le chiasma optique de chaque côté du 3e ventricule (Figure 1A).
  15. Placez les tranches dans la chambre d’enregistrement (36 °C) montée sur la platine d’un microscope Leica DMLFS. La chambre est remplie d’une solution d’enregistrement à écoulement continu (2 ml/min) aérée avec 95 % d’O2 et 5 % de CO2 et préchauffée avec un réchauffeur en ligne.
  16. Effectuer des enregistrements de patch clamp et d’imagerie calcique dans les neurones du SCN 0,5 à 8 heures après la préparation de la tranche.

2. Enregistrement par patch clamp

  1. Préparez la solution de solution d’électrode (intracellulaire) dans la moitié du volume final total d’eau.
  2. Ajustez la solution à un pH de 7,3 avec du KOH (1 N).
  3. Ajouter le reste de l’eau. L’osmolarité finale de la solution doit être de l’ordre de 280-290 mOsm.
  4. Passez la solution d’électrode à travers un filtre de 0,2 μm, une aliquote (0,5 ml) dans des tubes à microfuge et conservez-la à -20 °C.
  5. Préparez la solution mère de sel hexapotassique de sonde de calcium (10 mM) en mélangeant 1 mg de sel hexapotassique de bis-fura-2 avec 99,29 μl d’eau filtrée de 0,2 μm.
  6. Aliquote dans des tubes séparés (2-5 μl chacun) et congélation (-20 °C).
  7. Décongelez une aliquote de solution interne et la sonde Ca2+ peu de temps avant utilisation. Ajouter 2 μl de la solution mère de bis-fura-2 à 400 μl de la solution interne pour une concentration finale de sonde calcique de 50 μM. Triturez brièvement pour mélanger les solutions. La concentration de la sonde calcique (10-250 μM) varie en fonction de la conception expérimentale et du système d’imagerie. Notez que le bis-fura-2 est composé de deux molécules de fura-2 liées.
  8. Tirez les électrodes patch de cellules entières, en deux étapes, jusqu’à ce qu’elles aient un diamètre de pointe extérieur d’environ 1 μm et des résistances de 7 à 10 MΩ lorsqu’elles sont remplies de la solution intracellulaire.
  9. Remplissez l’électrode avec quelques μl de la solution interne contenant la sonde calcique filtrée avec un filtre à seringue de 4 mm (0,2 μm) pour les échantillons de faible volume via un tube Microfil.
  10. Appliquez une petite quantité de pression positive sur l’électrode lorsqu’elle est guidée dans la chambre d’enregistrement sous un éclairage à lumière rouge tout en étant visionnée sur un moniteur vidéo.
  11. Placez la microélectrode sur le SCN à l’aide d’un objectif de faible puissance (4X). Le NSC est identifié comme les deux zones translucides de chaque côté du troisième ventricule et dorsale au chiasma optique (figure 1A).
  12. Basculez le microscope sur un grossissement puissant (40X ou 63X). Des sous-régions du NSC et des neurones individuels du NSC peuvent être ciblés pour l’enregistrement à un grossissement plus élevé.
  13. Appliquez une légère pression positive sur la microélectrode lorsqu’elle avance sur la surface d’un neurone.
  14. Appliquez une légère pression négative sur la microélectrode pour former un joint avec des résistances de 3 à 10 GΩ.
  15. Ajustez la tension de la membrane à -60 mV avec l’amplificateur contrôlé par un logiciel d’acquisition.
  16. Appliquez une pression négative supplémentaire sur l’électrode pour rompre la membrane cellulaire en mode cellule entière.
  17. Lors de l’entrée en mode cellule entière, le neurone, le soma et les dendrites du SCN se remplissent d’une sonde fluorescente.
  18. La tension de la membrane est mesurée en mode ampèremètre ou en mode tension-pince pendant que les données d’image de la sonde calcique sont surveillées et stockées (décrites ci-dessous). Visualisez les images acquises ainsi qu’un graphique des données de fluorescence au rapport 340 nm/380 nm pendant l’expérience.

3. Mesure du Ca2+ intracellulaire

  1. Les mesures quantitatives de Ca2+ sont obtenues en enregistrant une paire d’images en excitant rapidement le tissu avec de la lumière UV à 340 nm et 380 nm via un monochronomètre avec une bande passante de 10 nm et passé à travers un filtre optique UG11 pour restreindre les longueurs d’onde harmoniques supérieures à 400 nm, un DCLP dichroïque de 400 nm et la lumière émise à travers un filtre d’émission de 510±40 nm.
  2. Les images sont acquises à l’aide d’une caméra CCD refroidie, le temps d’acquisition et le binning étant ajustés pour minimiser le photoblanchiment et maximiser la vitesse d’enregistrement.
  3. Un logiciel d’imagerie quantitative est utilisé pour acquérir et afficher les images.
  4. Sélectionnez les régions d’intérêt de l’image initiale à convertir en données d’unité d’intensité de fluorescence relative (c’est-à-dire soma, dendrite, etc.). Sélectionnez également une région pour la mesure de la fluorescence de fond (Figure 1B).
  5. Les images brutes et les données optiques quantifiées sont enregistrées en permanence pendant l’expérience. Après l’expérience, les images sauvegardées sont généralement réanalysées lorsque l’on peut prendre plus de temps pour sélectionner plus précisément les régions d’intérêt à quantifier.
  6. Les données peuvent être présentées sous la forme d’une estimation de la concentration intracellulaire de calcium (Est[Ca2+]i). Le rapport (R) de la lumière émise après excitation et soustraction du bruit de fond à 340 nm divisé par 380 nm ainsi que la fluorescence maximale et minimale à 340 nm et 380 nm est utilisé pour calculer la concentration de calcium4. La soustraction d’arrière-plan et d’autres calculs sont effectués à l’aide d’un logiciel d’analyse de données.
  7. Une détermination in vitro de la fluorescence maximale et minimale de bis-fura-2 peut être effectuée en utilisant 10 mM de CaCl2 pour les conditions liées à Ca2+ et 10 mM d’EGTA pour les conditions libres de Ca2+. La constante de dissociation Ca2+, Kd de la sonde, est considérée comme étant de 370 nM pour le bis-fura-2 (Invitrogen).

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Résultats

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En utilisant des tranches de cerveau hypothalamiques, nous avons enregistré simultanément des changements de calcium intracellulaire en mode cellule entière dans des conditions de tension et de courant clamp. La microélectrode illustrée à la figure 1A est abaissée en position sous un fort grossissement (objectifs UV 40X ou 63X) avec une petite quantité de pression positive appliquée. Après avoir touché le neurone, un joint gigaohm se forme avec une aspiration douce. En mode pince de tension, après avoir ...

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Discussion

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Les méthodes décrites ci-dessus fournissent un outil puissant pour enregistrer simultanément le lien entre l’activité électrique de la membrane neuronale et la concentration intracellulaire de calcium. La méthode présente un certain nombre d’avantages en ce sens qu’elle combine deux méthodes très bien caractérisées : l’enregistrement par patch clamp de cellules entières et la mesure du calcium intracellulaire à l’aide de colorants fluorescents. Notre approche est similaire à celles décrites par d’autres chercheurs

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Les travaux ont été financés par une subvention de l’Institut national des sciences médicales générales (GM096972).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
NaClFisher Scientific Co.S271-3
KClFisher Scientific Co.P217-500
NaH2PO4&bull ; H2OSigma Chemical Co.S-9638
MgCl2&bull ; 6H2OFisher Scientific Co.M33-500
CaCl2&bull ; 2H2OFisher Scientific Co.C79-500
D-glucoseFisher Scientific Co.D16-500
NaHCO3Fisher Scientific Co.S233-500
SaccharoseFisher Scientific Co.S5-500
D-gluconate de potassiumSigma-AldrichG4500
HEPESSigma-AldrichH4034
Adénosine 5&prime ;-triphosphate dipotassique sel dihydratéSigma-AldrichA8937
Guanosine 5&prime ;-triphosphate tris selSigma-AldrichG9002
Agarose (ultrapure)Life Technologies15510-027Gel poré dans une boîte de Pétri stérile Couche de 6 mm d’épaisseur
KOHSigma-AldrichP-6310
NaOHSigma-AldrichS-5881
Bis-fura-2, sel hexapotassiqueInvitrogenB6810Imperméabilisation de la cellule
Nom de l’équipementEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
MicrotomeLeicaVT1000STranchage des tissus
Colle cyanoacrylique (Roti-Coll1)Carl Roth GmbH+CoArt-Nr. 0258.1
Extracteur de microélectrodesNarshige International USAPP-83
Microelectrode Tubes capillairesWorld Precision Instruments1B150F-4
Microfil 34 gWorld Precision InstrumentsMF34G-5
Filtre à seringueCorning#431212
MicroscopeLeicaDM LFSAvec objectifs 4X, 40X UV et 63X UV, et caméra CCD à épifluorescence
HamamatsuORCA ER12 bit CCD
Fura-2 FilterCube Chroma71500ASet avec filtre UG11
Polychrome IVTill Photonics GmBHMonochronomètre
Lunettes de sécurité anti-ultravioletsultra-violets
EPC-9 amplificateurHEKA Eletronik
MetafluorMolecular DevicesLogiciel d’imagerie
PatchmasterHEKA EletronikLogiciel d’acquisition de données
Igor version 6WavemetricsElectrophysiologie & Ca2+ Analyse des données
VAPRO 5520Osmomètre à pression de vapeurWestcor
Produits

Références

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Mots-clés

Patch clampBis fura 2potentiel de membranecalcium intracellulairesonde fluorescentepr paration de coupes de cerveauenregistrement simultan

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