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Eaux usées dérivées électroactifs microbiennes biofilms: croissance, l'entretien et la caractérisation de base

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DOI :

10.3791/50800

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29 décembre 2013

 , 
1Department of Environmental Microbiology, UFZ - Helmholtz-Centre for Environmental Research

Dans cet article

Résumé

La croissance chronoampérométrique de biofilms microbiens électroactifs anodiques dans un réacteur à commande commandée utilisant une configuration à trois électrodes, contrôlée par un potentiostat, est démontrée. Le transfert d’électrons extracellulaire est caractérisé par voltampérométrie cyclique en présence du donneur d’électrons et en l’absence du donneur d’électrons. L’analyse fondamentale des données est démontrée.

Résumé

La croissance de biofilms microbiens électroactifs anodiques à partir d’inoculums d’eaux usées dans un réacteur à commande extensive est démontrée à l’aide d’une configuration à trois électrodes contrôlée par un potentiostat. Ainsi, l’utilisation de potentiostats permet un réglage précis du potentiel de l’électrode et garantit des conditions de culture microbienne reproductibles. Pendant la croissance, la production actuelle est surveillée à l’aide de la chronoampérométrie (CA). Sur la base de ces données, la densité de courant maximale (jmax) et l’efficacité coulombienne (CE) sont discutées comme mesures pour la caractérisation de la performance bioélectrocatalytique. La voltampérométrie cyclique (CV), une méthode non destructive, c’est-à-dire non invasive, est utilisée pour étudier le transfert d’électrons extracellulaire (EET) des bactéries électroactives. Les mesures CV sont effectuées sur des électrodes de biofilm anodique en présence du substrat microbien, i.e. et en l’absence du substrat, c’est-à-dire des conditions de non-retournement, en utilisant différentes vitesses de balayage. Par la suite, l’analyse des données est illustrée et les paramètres thermodynamiques fondamentaux de l’EET microbien sont dérivés et expliqués : potentiel de crête (Ep), densité de courant de crête (jp), potentiel formel (Ef) et séparation des pics (ΔEp). De plus, les limites de la méthode et l’analyse des données de pointe sont abordées. Ainsi, cet article vidéo fournira un guide pour les étapes expérimentales de base et l’analyse fondamentale des données.

Introduction

L’élucidation des principes fondamentaux du transfert d’électrons extracellulaires microbiens (EET) et de son exploitation dans les systèmes d’ingénierie est un domaine de recherche et développement vital et en croissance rapide1-3. L’étude de ces micro-organismes électroactifs (ou bioélectrocatalytiques ou électrochimiquement actifs), y compris les souches pures ainsi que les co-cultures définies et les consortiums complexes, nécessite un arsenal complexe de techniques, de méthodes et de protocoles4. Ces méthodes découlent de diverses disciplines scientifiques, par exemple l’électrochimie, la science des matériaux, la microbiologie, et fournissent des informations à différents niveaux hiérarchiques, par ex. de l’ensemble du biofilm microbien aux molécules uniques. Ainsi, l’électrochimie et les méthodes électrochimiques représentent le fondement de toutes les activités.

Traditionnellement, les configurations de type pile à combustible étaient souvent utilisées pour la croissance et la maintenance de cultures microbiennes électroactives dans l’archétype de ces systèmes modifiés : les piles à combustible microbiennes (MFC)5. Malheureusement, ces types de MFC ne permettaient souvent pas de surveiller ou même de contrôler le potentiel d’une seule électrode et, par conséquent, seules des informations limitées sur les processus d’électrode étaient possibles - seule la tension de la cellule était signalée. Aujourd’hui, il est de plus en plus reconnu que la surveillance et le contrôle individuels des potentiels des électrodes simples dans les MFC représentent un avantage évident, non seulement pour la recherche fondamentale, mais aussi pour l’ingénierie. De plus, avec la diversification des applications des technologies électrochimiques microbiennes qui incluent aujourd’hui, par exemple, l’assainissement, le dessalement, les synthèses et même la bio-informatique, dans les systèmes bioélectrochimiques microbiens (BES)2,6,7, un contrôle externe des potentiels d’électrodes individuelles est souvent substantiel. Ce contrôle est généralement réalisé à l’aide de sources d’alimentation externes ou de potentiostats. Ainsi, l’utilisation de potentiostats permet, contrairement à d’autres types de configurations, un réglage précis du potentiel de chaque électrode. Ceci est d’une grande importance car l’électrode représente l’accepteur d’électrons microbien terminal (pour les anodes) ou le donneur d’électrons (pour les cathodes) du transfert d’électrons extracellulaire. La figure 1 illustre l’état actuel des connaissances sur l’EET microbien aux anodes - voir pour plus de détails, par exemple 2, 4, 6, 8, 9 L’EET à la cathode est encore principalement inexploitée10.

Ainsi, le contrôle du potentiel de l’électrode permet non seulement l’utilisation de conditions de culture microbienne reproductibles, mais aussi son adaptation en termes de thermodynamique EET11. Dans cet article, nous démontrons comment les paramètres caractéristiques des biofilms microbiens électroactifs peuvent être extraits d’expériences de réacteurs alimentés en batch à l’aide de la chronoampérométrie (CA) et de la voltampérométrie cyclique (CV). Cela inclut les paramètres de performance, la densité de courant maximale (jmax) et l’efficacité coulombienne (CE) ainsi que les caractéristiques EET. Ici, l’identification des potentiels formels (Ef) des sites de transfert d’électrons possibles et réels sera mise en évidence. L’extraction de ces paramètres est illustrée par l’exemple des biofilms de culture mixte dérivés des eaux usées qui sont dominés par la spécification Geobacter. 12 Ces biofilms dérivés des eaux usées sont obtenus par une simple procédure de sélection électrochimique, comme l’ont démontré de nombreux groupes de recherche dans le monde13-16.

Techniques électrochimiques dynamiques pour étudier le transfert d’électrons extracellulaires microbiens

Pour une caractérisation thermodynamique de l’EET des cultures microbiennes électroactives, des techniques électrochimiques dynamiques sont nécessaires. En général, ces techniques comprennent le contrôle du potentiel, c’est-à-dire voltammétrique, et le contrôle du courant, c’est-à-dire le contrôle du courant. Galvanodynamique, Techniques17. Ainsi, les techniques contrôlées potentielles sont plus répandues et comprennent par exemple la voltampérométrie à ondes carrées et la voltampérométrie à balayage linéaire18. La plus populaire, cependant, est la voltampérométrie cyclique (CV)19,20. CV est bien connu et répandu dans différents domaines de l’électrochimie, allant de la recherche sur les batteries à la bioélectrochimie enzymatique en passant par la science des matériaux21. Son application aux cellules microbiennes vivantes ne peut être datée que de plus d’une décennie22 et augmente considérablement au cours des dernières années23,24. En particulier, la combinaison des méthodes CV et spectroscopiques a fourni des informations sans précédent sur les mécanismes de l’EET et sa nature moléculaire, par exemple25,26 En parallèle, le cadre théorique pour l’extraction des caractéristiques thermodynamiques et théoriques de l’EET microbien a été élargi et approfondi27-30. En revanche, une mauvaise manipulation expérimentale ou une analyse inadéquate des données entravent souvent l’application appropriée de la CV dans le domaine de la bioélectrochimie microbienne. Par conséquent, en plus des ateliers (par exemple à l’EU-ISMET 2012) et des tutoriels19, cet article vidéo fournira un guide de base pour la réalisation d’expériences voltampérométriques cycliques sur des bactéries électroactives. Il se concentre donc sur les étapes expérimentales de base et l’analyse fondamentale des données et n’a pas pour but de fournir les derniers protocoles d’analyse cinétique. Les terminus les plus importants pour la discussion suivante sont résumés dans l’encadré 1 (adapté de Harnisch et Freguia19 et modifié).

Protocole

Comme la procédure de sélection dans le réacteur bioélectrochimique alimenté en lots est très spécifique en raison du choix du substrat et des conditions anoxiques, il n’est pas nécessaire de travailler dans des conditions stériles pour l’exemple démontré.

1. Préparation du milieu de croissance

  1. Préparez une quantité appropriée de milieu de croissance à l’aide d’un tampon phosphate selon Kim et al.13 (voir tableau 1). Ici, l’acétate de sodium (10 mM) sert de substrat. Le milieu de culture utilisé dans cet article n’est qu’un exemple et, selon le but de l’expérience, ses composants peuvent varier.
  2. Ajouter 1 ml d’eaux usées primaires pour 20 ml de milieu de culture sous forme d’inoculum. L’échantillon d’eaux usées est prélevé dans une station d’épuration municipale après la filtration mécanique (voir par exemple figure 2) et peut être stocké jusqu’à trois mois jusqu’à ce qu’il soit utilisé dans un récipient fermé à 4 °C
    (Remarque : selon l’objectif de l’expérience, le nombre initial exact de cellules peut être important et doit ensuite être déterminé. Dans l’exemple démontré, le nombre initial de cellules n’est pas important, car le biofilm atteint des conditions d’équilibre.)
  3. Rincez le milieu, y compris l’inoculum, avec de l’azote pendant au moins 30 minutes pour le désaérer, en insérant une aiguille dans le milieu et en allumant le flux d’azote. Le jet doit être suffisamment fort pour que vous puissiez observer un mélange complet du milieu.
    (Remarque : en fonction du volume du fluide, il faut même envisager d’allonger le temps de désaération. Lors de la configuration de la désaération, le réacteur alimenté par lots (étapes 2.1-2.2))

2. Configuration du réacteur Fed-batch

  1. Prenez une cuve de réacteur appropriée - ici, une fiole à fond rond modifiée à 4 cols de 250 ml est utilisée.
    (Remarque : En général, le bâtiment doit avoir au moins quatre entrées. Ceux-ci sont nécessaires pour les trois électrodes et pour l’échantillonnage/l’échange de fluides. Les volumes de gaz produits peuvent être négligés lors de l’ouverture régulière du réacteur en raison d’un échantillonnage ou d’un changement de fluide, ou bien un compteur de bulles doit être installé. Afin d’éviter une croissance phototropique indésirable, les réacteurs doivent être protégés de l’exposition directe à la lumière.)
  2. Pour la configuration à trois électrodes (voir la figure 3 et la section 3 pour plus de détails), placez l’électrode de référence (RE) (ici Ag/AgCl, sat. KCl, 0,197 V vs. SHE), l’électrode de travail (WE) et la contre-électrode (CE) dans le ballon à travers des entrées individuelles via des bouchons en silicone – étanchéité à l’air.
    (Remarque : Comme les tiges de graphite WE et CE sont utilisées. Le fil des électrodes est tiré à travers la prise en silicone et fixé à l’extérieur. L’électrode de référence est insérée dans le bouchon de silicium par un trou percé. Pour éviter les courts-circuits, assurez-vous qu’il n’y a pas de contact physique entre les électrodes, même lors de l’agitation ou de la recirculation du fluide. Placez les électrodes de manière à ce qu’elles soient complètement recouvertes d’une solution moyenne. Pour l’étanchéité, enveloppez le bouchon en silicone de chaque entrée avec du Parafilm.)
  3. Versez le milieu de croissance, y compris l’inoculum (ici 250 ml) à travers l’orifice d’échantillonnage dans le réacteur tout en rinçant à l’azote.
  4. Fermez la dernière entrée à l’aide d’un bouchon en silicone et fermez-la hermétiquement. Remarque : Les traces d’oxygène n’endommageront pas les biofilms des espèces mélangées. Ils sont capables de résister et même de consommer de faibles niveaux d’oxygène, ce qui peut à son tour diminuer l’EC.

3. Croissance chronoampérométrique du biofilm

  1. Connectez les électrodes aux câbles respectifs du potentiostat. Placez le récipient dans une chambre à température contrôlée, ici 35 °C est utilisé31, afin d’assurer des conditions environnementales constantes.
  2. Ouvrez le logiciel pour contrôler le potentiostat et choisissez la technique : Chronoampérométrie. Réglez les paramètres par exemple comme suit : Un potentiel constant EWE de 0,2 V (vs. Ag/AgCl) pour une durée t de 500 h (≈ 20 jours). Le courant est enregistré en pas de temps dti toutes les minutes.
    Remarque : Le choix du potentiel appliqué dépend du système/micro-organisme étudié. Généralement, les processus d’anode sont étudiés à potentiel positif et les processus de cathode à potentiel négatif. On peut également déduire un potentiel approprié à partir des potentiels standard du donneur/accepteur d’électrons et du potentiel formel du site de transfert d’électrons microbien attendu, ici comme point de départ, veuillez vous référer à la littérature récente.
  3. Démarrez la chronoampérométrie. Un graphique du courant mesuré au fil du temps est tracé par le logiciel, le courant maximal observé (imax) est un paramètre en ligne important, comme discuté dans les sections 4 et 5.

4. Maintenance du biofilm

  1. En fonction des conditions environnementales, par exemple la température, un courant oxydatif commence à circuler et atteint un plateau (voir figure 4). Après avoir atteint à nouveau un courant nul, interrompez la mesure chronoampérométrique et remplissez la solution de fluide. Pour une croissance plus rapide du biofilm, remplacez le milieu juste après que le plateau du courant maximum est atteint. Ouvrez l’orifice d’échantillonnage et déchargez le milieu avec précaution, sans détruire le mince biofilm. Tout en remplissant le fluide, rincez à nouveau avec de l’azote. Fermez l’orifice d’échantillonnage et fermez-le hermétiquement.
  2. Répétez la procédure de l’étape 4.1 jusqu’à ce que le courant d’oxydation maximal atteigne un état d’équilibre (voir Figure 4).
    (Remarque : On pense qu’une constante imax indique une formation de biofilm stable à l’état d’équilibre.)
  3. Prélever des échantillons de 1 ml des solutions fraîches et des solutions de milieu échangé pour l’analyse du substrat, par exemple par HPLC. La concentration initiale du substrat (acétate) (c0) ainsi que la concentration de la solution de substrat restante (c1) sont ensuite nécessaires pour les calculs d’efficacité (voir section Analyse des données).
    Remarque : Pour obtenir des résultats inaltérés, par exemple en raison d’une consommation supplémentaire de substrat, analysez immédiatement les échantillons de substrat. Si cela n’est pas possible, conservez les échantillons dans un congélateur à une température minimale de -18 °C pendant au plus un mois.)

5. Application de la voltampérométrie cyclique à l’étude de l’EET

  1. Effectuer la voltampérométrie cyclique aux maxima et minima du flux de courant comme indiqué (Figure 4). En fonction de la question d’intérêt, la CV est généralement effectuée lorsque le système a atteint l’état d’équilibre pour obtenir des résultats comparables. (Remarque : la génération de courant est appelée conditions de renouvellement et liée à l’oxydation microbienne du substrat et au transfert d’électrons ultérieur : bioélectrocatalyse microbienne ; tandis que les CV sans renouvellement sont effectués à un flux de courant (presque) nul dans l’AC.)
  2. Choisissez dans le logiciel de contrôle du potentiostat la technique : Voltampérométrie cyclique, et réglez les paramètres appropriés, ici par exemple : Un potentiel initial de l’EWE à Ei de -0,5 V vs. RE avec une vitesse de balayage v=dE/dt de 1 mV/s à un potentiel de sommet E1 de 0,3 V vs. RE et de retour au potentiel de départ E2 = Ei de -0,5 V.
    Remarque : Lors de l’utilisation de la voltampérométrie cyclique, la tension appliquée au niveau de l’unité d’action est modifiée linéairement avec le temps par le potentiostat (voir figure 5) - L’encadré 2 fournit les règles de principe pour le choix des paramètres de l’expérience et le dépannage).
  3. Démarrez la voltammométrie cyclique et enregistrez autant de cycles que nécessaire pour effectuer un CV reproductible. Habituellement, au moins 3 cycles sont nécessaires. Le graphique résultant est appelé voltammographie cyclique (voir aussi la figure 7). Remarque : En fonction des conditions de mesure, différentes informations peuvent être obtenues, comme le montre la section suivante.

6. Traçage des données

Ici, seul le tracé des données est abordé. Un traité plus détaillé suit dans la section suivante.

  1. Utilisez un logiciel d’analyse de données approprié, ici toutes les données sont exportées sous forme de texte et importées sous forme de fichier ASCII.
  2. Calculer et utiliser préférentiellement les densités de courant (j) et non les courants absolus (i).
    (Remarque : Cependant, comme il existe différents protocoles pour calculer j, indiquez clairement lequel a été utilisé. Ici, la densité de courant par géomètre, c’est-à-dire projetée, la surface de l’électrode est utilisée.)
  3. Chronoampérométrie : Tracez la densité de courant mesurée en fonction du temps.
  4. Voltampérométrie cyclique : Tracer la densité de courant mesurée en fonction du potentiel du WE Ewe.

Résultats

1. Chronoampérométrie

À partir des mesures chronoampérométriques, deux caractéristiques opérationnelles peuvent être calculées : la densité de courant maximale (jmax), c'est-à-dire le flux maximal d'électrons par seconde, et le rendement coulombique (CE), c'est-à-dire le flux de courant total par rapport au substrat consommé. Figure 4 montre une courbe typique de croissance de biofilm obtenue par chronoampérométrie sur plusieurs cycles de croissance en utilisant un réacteur en mode fed-batch. Après une phase de latence initiale, un premier maximum de densité de courant apparaît. Ensuite, le courant diminue à nouveau en raison de l'épuisement du substrat. Lorsque le flux de courant atteint (presque) zéro, le milieu est renouvelé, comme indiqué. Après ce réapprovisionnement en substrat, la densité de courant augmente de nouveau, et le maximum suivant est supérieur au premier. Après plusieurs cycles de croissance, jmax devient constante – ce qui indique une formation de biofilm en régime stationnaire14. Étant donné que la valeur de jmax en régime stationnaire dépend de plusieurs paramètres, par exemple le matériau de l'électrode, la température du réacteur et la composition du biofilm, elle est souvent considérée comme une caractéristique propre à un système donné de biofilm microbien électroactif/électrode. (Dans le cas des réacteurs à flux continu, ce n'est pas jmax, mais la densité de courant stationnaire constante qui est utilisée.) La deuxième caractéristique opérationnelle est le rendement coulombique (CE) (Équation 1). Il s'agit du nombre d'électrons enregistrés sous forme de courant électrique, Qp, par cycle fed-batch, rapporté au nombre théorique maximal d'électrons Qth, calculé à partir de la consommation de substrat durant ce cycle.

Formule d'équilibre statique CE=QP/Qth×100 ; calcul de l'efficacité dans un diagramme de processus.

(Équation 1)

La charge totale transférée peut être obtenue par intégration de la courbe CA (voir aussi Figure 6) :

Calcul de la charge électrique, équation, \( Q_P = \int_0^t i \, dt \), méthode d'intégration.

(Équation 2)

La charge électrique théoriquement possible est calculée selon la loi de Faraday :

Équation thermodynamique Qth=ΔcVzF, analyse du potentiel chimique, usage éducatif.

(Équation 3)

Où V est le volume du milieu de croissance, F la constante de Faraday (F = 96 485,34 C/mol), z le nombre d'électrons libérés par le substrat oxydé (dans le cas de l'acétate, 8 électrons sont libérés lors de l'oxydation en CO2) et Δc = c0-c1, qui représente la consommation de substrat (déterminée par des méthodes d'analyse chimique, par exemple par HPLC).

2. Voltampérométrie cyclique :

Des voltammogrammes cycliques sont enregistrés dans des conditions de non-transformation et dans des conditions de transformation (comme indiqué dans la Figure 4). Dans les deux cas, différents types d'informations peuvent être obtenus. On examine ci-dessous comment les sites d'EET possibles et effectifs peuvent être identifiés.

2.1 Conditions sans renouvellement – identification des sites EET possibles :

Figure 7 montre des CV typiques dans des conditions sans renouvellement, c.-à-d. en l'absence de substrat. Figure 7A présente le CV d'un biofilm à des vitesses de balayage élevées (ici 50 mV/s), où une seule paire de pics, et donc un seul potentiel formel Ef, peut être identifiée. En général, le potentiel formel d'un couple redox peut être calculé à partir du potentiel de pic d'oxydation EpA et du potentiel de pic de réduction de l'espèce respective EpC en faisant la moyenne arithmétique (voir aussi Figure 7C) :

Équation d'électrochimie : Ej = (EpA + Epc)/2, analysant le potentiel redox dans les études de voltampérométrie.

(Équation 4)

Lorsqu'on applique une vitesse de balayage suffisamment faible au même biofilm (ici 1 mV/s), jusqu'à quatre couples redox peuvent être identifiés (les potentiels formels respectifs sont indiqués dans Figure 7B). La raison en est que le courant capacitif de fond diminue lorsque des vitesses de balayage plus faibles sont utilisées, voir également Encadré 1 et par ex.17,21 pour plus de détails. Toutefois, la CV sans transfert montre uniquement tous les composés redox actifs à l'électrode et donc le Ef des sites EET possibles. Seule l'analyse de la CV en régime de transfert fournit le Ef des sites de transfert EET effectifs (voir étape 2.2.).

Lors d'une analyse plus poussée des CV sans renouvellement, d'autres paramètres caractéristiques, tels que l'écart entre pics ΔEp (Équation 5) ou le courant de pic maximal ipA et le courant de pic minimal ipC, peuvent être analysés (voir Figure 7C).

Équation d'équilibre statique ΔEP=EpA-EpC ; schéma de formule à des fins éducatives.

(Équation 5)

Ces paramètres, en particulier lorsqu’ils sont enregistrés à différentes vitesses de balayage, peuvent être utilisés pour l’analyse mécanistique et cinétique des processus de transfert d’électrons aux électrodes. Toutefois, cette analyse cinétique, bien établie pour les systèmes chimiques, n’est pas directe pour les biofilms microbiens électroactifs, voir par ex.19,30

  1. Conditions de renouvellement – identification des sites EET effectifs :

Lorsque l'on effectue une mesure de CV en présence de substrat, on obtient une courbe de CV de turnover (voir Figure 8A). Après avoir tracé les données, on observe une courbe typique en forme de « s », dite bioélectrocatalytique17-19. Lors d'une analyse plus poussée des données, le maximum de la première dérivée, c.-à-d. le point d'inflexion de la courbe de CV, fournit le potentiel formel Ef des site(s) EET effectif(s) (voir Figure 8B). Dans le cas d'un biofilm jeune, c.-à-d. mince, dominé par les Geobacteraceae, ici 168 h après le début du CA, deux points d'inflexion peuvent être observés. Par la suite, la dérivée présente deux maxima correspondant aux potentiels formels des sites EET actifs au niveau bioélectrocatalytique : -0,376 V et -0,295 V par rapport à Ag/AgCl (KCl sat., 0,197 V par rapport à l'ENH). Sur la Figure 7B, ces sites sont désignés respectivement par Ef,2 et Ef,3. Cette observation montre également que les processus redox associés aux potentiels formels Ef,1 et Ef,4 (dans le CV sans turnover) ne sont pas liés à la bioélectrocatalyse. Lorsque le biofilm grandit et s'épaissit, le CV ne présente qu'un seul point d'inflexion, c.-à-d. un seul maximum sur la courbe dérivée. Ce potentiel formel Ef, ici égal à -0,32 V par rapport à Ag/AgCl (KCl sat.), est (approximativement) égal à la moyenne arithmétique des deux potentiels formels attribués à l'EET du biofilm mince (par ex. ici Ef,2 et Ef,3) – voir Figure 9. Cela montre que cette analyse fondamentale du CV permet d'obtenir des informations sur la thermodynamique de l'EET de manière rapide et non invasive, mais ne permet pas, de manière notable, de tirer des conclusions supplémentaires sur les mécanismes ou la cinétique.

Notamment, les biofilms obtenus dans les conditions spécifiques de ce protocole sont fortement dominés par des espèces de Geobacter (non démontré ici)12,15. La modification de certains paramètres sélectionnés, par exemple le substrat, la température, etc., influencera également la composition microbienne et, par conséquent, les propriétés électrochimiques.

Tableau 1. Milieu de croissance selon Kim et al.32

Composant(mg/L) / (ml/L)   
NaH2PO4•H2O2,690.00
Na2HPO44,330.00
NH4Cl310.00
KCl130.00
acétate de sodium820.00
solution de métaux12.50
solution vitaminique12.50
Tableau 2. Composants de la solution de métaux et de vitamines33.
Solution d'éléments traces :Solution de vitamines :
Composantmg/L   Composantmg/L   
Acide nitriloacétique1,500.0Biotine2.0
MgSO4•7H2O         3,000.0Acide folique2.0
MnSO4•2H2O         500.0Hydrochlorure de pyridoxine10.0
NaCl  1,000.0Hydrochlorure de thiamine5.0
FeSO4•7H2O          100.0Riboflavine5.0
CoSO4 ou CoCl2     100.0Acide nicotinique5.0
CaCl2•2H2O            100.0DL-Panthothénate de calcium5.0
ZnSO4   130.0Vitamine B120.1
CuSO4•H2O10.0Acide p-aminobenzoïque5.0
AlK(SO4)2               10.0Acide lipoïque5.0
H3BO3 10.0
Na2MoO4•2H2O     10.0
Remarque : Dissoudre l'acide nitriloacétique avec du KOH jusqu'à pH 6,5, puis ajouter les minéraux.


Schéma des terminologies bioélectrochimiques ; inclut des équations et des formules en électrochimie.
Paramètres de réglage et guide de dépannage de la voltampérométrie cyclique, axé sur les ajustements de la fenêtre de potentiel et de la vitesse de balayage pour des expériences CV optimales.

Schéma des mécanismes de transfert d'électrons extracellulaires microbiens ; voies MET, DET, MIET, DIET ; analyse du transport d'électrons.
Figure 1. Schéma des mécanismes possibles de transfert d'électrons extracellulaires microbiens. Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle.

Processus d'échantillonnage de l'eau ; échantillonneur à seau prélevant des échantillons dans le flux d'une station d'épuration.
Figure 2. Échantillonnage à la station d'épuration après le collecteur à grille (station d'épuration Allemagne). Cliquez ici pour voir l'image en grand.

Schéma et photo d'une cellule électrochimique avec potentiostat, configuration des électrodes ; CE, RE, WE indiqués.
Figure 3. Dispositif à trois électrodes. (A) Schéma, (B) réacteur réel ; CE = électrode auxiliaire, RE = électrode de référence, WE = électrode de travail avec biofilm microbien électroactif, SP = prise d’échantillonnage. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Graphique électrochimique ; analyse CV ; courant en fonction du temps ; approche en état stationnaire ; données en microampères et en heures.
Figure 4. Tracé de la croissance d'un biofilm à partir d'un inoculum de boues activées en mode fed-batch analysée par chronoampérométrie. Le courant oxydatif atteint un état stationnaire après trois cycles de renouvellement du milieu. Sont indiquées la phase de latence ainsi que les instants de renouvellement du milieu et de réalisation de la voltampérométrie cyclique (CV) en mode turnover et en mode non-turnover, pour des conditions de biofilm en régime stationnaire (données brutes provenant de Liu14). Cliquez ici pour visualiser l'image en taille agrandie.

Analyse électrochimique, diagramme E-t, voltampérométrie cyclique, potentiel en fonction du temps, chimie analytique.
Figure 5. Évolution du potentiel en fonction du temps au cours d’un cycle de voltampérométrie cyclique. La voltampérométrie cyclique commence au potentiel initial Ei. La tension appliquée varie ensuite linéairement en fonction du temps avec une vitesse de balayage v. À un potentiel de sommet choisi E1, la tension revient à un potentiel final E2, ici E2 = Ei. Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle.

Graphique d'analyse électrochimique avec la densité de courant j en fonction du temps t, illustrant le pic jmax.
Figure 6. Chronoampérogramme typique d’un cycle de croissance d’un biofilm issu d’eaux usées ; on y indique la densité de courant maximale jmax, la charge électrique écoulée (pratique) Qp, le prélèvement de la concentration initiale en substrat c0 et la concentration en substrat après un cycle de croissance c1 . Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle.

Graphique d'analyse électrochimique ; diagrammes de voltampérométrie cyclique montrant les résultats de courant en fonction de la tension.
Figure 7. Voltampérogrammes cycliques sans renouvellement d'un biofilm de G. sulfurreducens. Vitesse de balayage : (A) 50 mV/s, (B) 1 mV/s 23 ; (C) agrandissement de B, illustrant la densité de courant maximale (jpA) et le potentiel maximal correspondant (EpA) de l'anode aux pics maximaux. De manière correspondante, aux minima, sont indiquées la densité de courant maximale (jpC) et le potentiel maximal correspondant (EpC) de la cathode. Le potentiel formel Ef et l'écart entre pics ΔEp sont déduits respectivement de l'équation 4 et de l'équation 5 (pour plus de détails, voir le texte ci-dessous). Cliquez ici pour voir l'image en taille agrandie.

Analyse électrochimique ; graphique de voltampérométrie ; courant en fonction du potentiel ; détection des pics ; analyse des données.
Figure 8. (A) Voltammogramme cyclique de régénération d'un biofilm métabolisant de G. sulfurreducens. La vitesse de balayage était de 5 mV/s. (B) Dérivées premières de la courbe voltampérométrique23. Les potentiels formels des sites réels de TEE sont indiqués : Ef,2 et Ef,3. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Cyclic voltammetry graph; current vs. potential; electrochemical analysis; data results.
Figure 9. (A) Voltammogramme cyclique de renouvellement et (B) dérivées premières d'un métabolisant plus épais G. sulfurreducens biofilm. La vitesse de balayage était de 5 mV/s (comparer Figure 8). Cliquez ici pour voir l'image en taille agrandie.

Discussion

Le protocole présenté montre un moyen simple et direct de cultiver des biofilms microbiens électroactifs à partir d’inoculation d’eaux usées à l’aide d’une configuration à trois électrodes dans un réacteur alimenté par lots. La chronoampérométrie permet la croissance et la sélection de biofilms microbiens électroactifs à partir de divers inoculums, ainsi que la caractérisation fondamentale des biofilms en termes de densité de courant maximale et d’efficacité coulombienne. La voltampérométrie cyclique, étant une technique non invasive, permet de réaliser des études fondamentales sur la thermodynamique EET du biofilm microbien et ainsi d’identifier des sites de transfert EET possibles et réels. Ensemble, ces paramètres permettent i) de caractériser et de comparer différents biofilms microbiens dans des conditions identiques ainsi que d’étudier l’impact de différentes conditions de fonctionnement sur des biofilms microbiens électroactifs identiques. Cependant, ces expériences ne peuvent être qu’un point de départ. D’une part, le domaine multiforme de la bioélectrochimie microbienne nécessite une exploitation plus poussée et approfondie des méthodes et protocoles électrochimiques. Il s’agit, par exemple, de modèles permettant d’extraire des données cinétiques et mécanistes, ainsi que d’autres méthodes telles que la spectroscopie d’impédance électrochimique34,35. D’autre part, les méthodes électrochimiques ne peuvent fournir aucune information sur la nature moléculaire, la composition microbienne, l’organisation microbienne spatiale, etc. Dans ce cas, d’autres techniques, soit non invasives et couplées à l’électrochimie, soit invasives, sont nécessaires4. L’encadré 2 fournit une brève discussion sur les étapes critiques de la réalisation des expériences ainsi que sur le dépannage initial.

Du point de vue de l’ingénierie, il faut tenir compte du fait que l’anode du biofilm électroactif n’est qu’un composant des systèmes bioélectrochimiques microbiens actuels, et qu’une multitude d’autres facteurs doivent être analysés pour les systèmes complets36. Cependant, nous espérons que cet article vidéo aidera à comprendre et à adapter les éléments centraux de la BES, c’est-à-dire les électrodes microbiennes, à l’avenir.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

F.H. remercie le BMBF (Prix de recherche « Procédés biotechnologiques de nouvelle génération - Biotechnologie 2020+ ») et l’Association Helmholtz (Groupe des jeunes chercheurs).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Eaux usées primairesStation d’épurationPrise après filtration mécanique
250 ml Fioles à fond rond avec trois entrées supplémentairesTh.Geyer Berlin GmbH, Allemagne9.011 845Des entrées supplémentaires ont été fixées par notre propre souffleur de verre
Électrode de référence Ag/AgCl (sat. KCl, 0,195 V vs. SHE) avec membrane en céramiqueSensortechnik Meinsberg, AllemagneSE 11
Tiges en graphite (Ø ;=1 cm, l=3 et 5 cm)CP-Handels-GmbH, Wachtberg, AllemagneUtilisé comme matériau d’électrode
Acier inoxydable, n° 1.4301, Fil Fe/Cr18/Ni10Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Allemagne155-923-05
Bouchons en siliconeTh.Geyer Berlin GmbH, Allemagne9.230 512 et
ParafilmneoLab, Heidelberg, Allemagne3-1011Pour l’étanchéité afin de maintenir des conditions anaérobies
Modèle Potentiostat/ Galvanostat MPG2BioLogic Science Instruments, France
EC-LabBioLogic Science Instruments, FranceLogiciel pour la réalisation de mesures électrochimiques
Origin 8.6Logiciel d’analyse de donnéesOriginLab
des eaux usées

Références

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Inoculum d eaux us esVoltamperom trie cycliqueChronoamp rom trieTransfert d lectrons extracellulaireR acteur semi continuDispositif trois lectrodesDensit de courant maximaleEfficacit coulombiquePotentiel formel
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