Décellularisation et recellularisation pulmonaires de primates non humains à l’aide d’un bioréacteur spécialisé à grands organes

Summary

La décellularisation de l’organe entier produit des échafaudages biologiques naturels qui peuvent être utilisés pour la médecine régénérative. La description d’un modèle de primate non humain de régénération pulmonaire dans lequel des poumons entiers sont décellularisés, puis ensemencés avec des cellules souches adultes et des cellules endothéliales dans un bioréacteur qui facilite la circulation vasculaire et la ventilation des milieux liquides, est présentée.

Abstract

Il n’y a pas assez de poumons disponibles pour répondre aux besoins actuels et futurs en matière de transplantation d’organes. La régénération bioartificielle des tissus est une alternative intéressante à la transplantation d’organe classique. Cette technologie utilise la matrice extracellulaire biologique naturelle (MEC) d'un organe comme échafaudage sur lequel des cellules autologues ou souches/progénitrices peuvent être ensemencées et cultivées de manière à faciliter la régénération du tissu d'origine. L’ECM naturelle est isolée par un processus appelé décellularisation. La décellularisation est réalisée en traitant les tissus avec une série de détergents, de sels et d’enzymes pour obtenir une élimination efficace du matériel cellulaire tout en laissant l’ECM intacte. Des études menées utilisant la décellularisation et la recellularisation ultérieure des poumons de rongeurs ont démontré un succès marginal dans la génération de tissu de type pulmonaire capable d’échanges gazeux in vivo. Bien qu’ils offrent une preuve de concept essentielle, les modèles de rongeurs ne sont pas directement transposables à l’utilisation humaine. Les primates non humains (PNH) offrent un modèle plus approprié pour étudier l’utilisation de la production d’organes bioartificiels pour une utilisation clinique éventuelle.

Les protocoles pour réaliser la décellularisation complète des poumons acquis du macaque rhésus NHP sont présentés. Les poumons acellulaires qui en résultent peuvent être ensemencés avec une variété de cellules, y compris des cellules souches mésenchymateuses et des cellules endothéliales. Le manuscrit décrit également le développement d’un système de bioréacteur dans lequel des poumons de macaque enracinés dans des cellules peuvent être cultivés dans des conditions d’étirement mécanique et de déformation fournies par la ventilation à pression négative ainsi que la perfusion pulsatile à travers le système vasculaire ; Ces forces sont connues pour diriger la différenciation le long des lignées pulmonaires et endothéliales, respectivement. Des résultats représentatifs de la décellularisation et de l’ensemencement cellulaire sont fournis.

Introduction

La bio-ingénierie des tissus et des organes est un ajout intéressant au domaine de la médecine régénérative. La création d’organes « cultivés en laboratoire » qui conviennent à la transplantation chez les patients pour remplacer la fonctionnalité des organes malades est hautement souhaitable afin de répondre à la demande actuelle et future de besoins de transplantation. Les principes de l’ingénierie tissulaire sont centrés sur l’ensemencement des types de cellules souhaités, ou de leurs progéniteurs, dans un échafaudage qui soutient la forme du tissu modifié tout en fournissant les facteurs de croissance appropriés et les conditions de culture nécessaires pour imiter ....

Protocol

1. Décellularisation pulmonaire du macaque à organe entier

1. Préparation des solutions
   1. Autoclave 10-15 L d’eau déminéralisée (dH₂O) en bouteilles de 1-2 L.
   2. Préparez la « solution Triton » (0,1 % de Triton X-100 en dH₂O) en mélangeant 1 ml de Triton X-100 dans 999 ml de dH₂O en agitant à l’aide d’un agitateur magnétique. Filtrez la solution à travers un appareil de filtration de 0,22 μm. Conserver à température ambiante.
   3. Préparez une « solution SDC » (2 % de SDC en dH₂O) en ajoutant lentement 20 g de désoxycholate de sodium (SDC) à ~900 ml dH₂O en remuant. Une fo....

Results

Les résultats présentés ci-dessous représentent des expériences distinctes dans lesquelles des compartiments respiratoires ou vasculaires ont été ensemencés avec des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse du macaque rhésus ou des cellules endothéliales microvasculaires dérivées du poumon rhésus, respectivement, qui ont été isolées et caractérisées comme décrit précédemment^16-18.

Tout au long du processus de décellularisation, les poumons du macaque ont montr.......

Discussion

Les tissus peuvent être décellularisés de manière efficace et efficiente par un certain nombre de méthodes utilisant des agents physiques, chimiques et enzymatiques^12,20. Les défis de la production de matrices biologiques 3D à partir de grands organes comprennent la nécessité de grands volumes de solutions de décellularisation, d’équipements commerciaux coûteux (c’est-à-dire des bioréacteurs) et une quantité vertigineuse de perturbations méthodologiques nécessaires pour obtenir le produit final dérivé.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nitroprussiate de sodium	Sigma-Aldrich	71778-25G
Héparine sel de sodium	Fisher	BP2425
Triton X-100	Fisher	BP151-100
Désoxycholate de sodium	Fisher	BP349-100
Chlorure de sodium	Fisher	7647-14-5
DNase pancréatique bovine	Sigma-Aldrich	DN25	Préparation de la matière, aliquote et congélation
Sulfate de magnésium	Fisher	10034-99-8
Chlorure de calcium	Fisher	C614-500
PBS (sans Ca/Mg)	Gibco, Life Technologies	10010-031
Antibiotique-antimycosique	Gibco Life Technologies	15240062
Milieux
Alpha MEM	Gibco Life Technologies	12561-072
Moyen 199	Gibco Life Technologies	11150067
Sérum de veau fœtal de qualité supérieure	Atlanta Biologicals	S11150
L-Glutamine 100x	Gibco Life Technologies	25030-081
Supplément de croissance des cellules endothéliales (ECGS)	ScienCell	1052
Antibiotique-antimycosique	Gibco Life Technologies	15240062
Ensemencement cellulaire et culture de bioréacteur
Clapets anti-retour	Cole-Parmer	EW-98553-20
Connecteurs en Y	Cole-Parmer	ED-30614-08
Robinets d’arrêt à 3 voies Appareil	Harvard	721664
MasterFlex L/S 14 tubes	Cole-Parmer	96420-14
MasterFlex L/S 16 tube	Cole-Parmer	96420-16
Serrure mâle Luer 1/8 po	Cole-Parmer	EW-45505-04
Femelle Luer 1/8 po	Cole-Parmer	SI-45502-04
Bouchon Luer mâle	Cole-Parmer	EW-45505-56
Orifices d’injection	Medi-Dose EPS	IV2004
Tubulure en latex	St. Louis Medical Suppy	HN10910
Collier de serrage	Cole-Parmer	EW-06832-02
Pot à large ouverture 2 L	Fisher	05-719-276
Seringues de 60 ml	Fisher	NC9035364