La décellularisation de l’organe entier produit des échafaudages biologiques naturels qui peuvent être utilisés pour la médecine régénérative. La description d’un modèle de primate non humain de régénération pulmonaire dans lequel des poumons entiers sont décellularisés, puis ensemencés avec des cellules souches adultes et des cellules endothéliales dans un bioréacteur qui facilite la circulation vasculaire et la ventilation des milieux liquides, est présentée.
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Article de méthode
Décellularisation et recellularisation pulmonaires de primates non humains à l’aide d’un bioréacteur spécialisé à grands organes
Dans cet article
Résumé
Résumé
Il n’y a pas assez de poumons disponibles pour répondre aux besoins actuels et futurs en matière de transplantation d’organes. La régénération bioartificielle des tissus est une alternative intéressante à la transplantation d’organe classique. Cette technologie utilise la matrice extracellulaire biologique naturelle (MEC) d'un organe comme échafaudage sur lequel des cellules autologues ou souches/progénitrices peuvent être ensemencées et cultivées de manière à faciliter la régénération du tissu d'origine. L’ECM naturelle est isolée par un processus appelé décellularisation. La décellularisation est réalisée en traitant les tissus avec une série de détergents, de sels et d’enzymes pour obtenir une élimination efficace du matériel cellulaire tout en laissant l’ECM intacte. Des études menées utilisant la décellularisation et la recellularisation ultérieure des poumons de rongeurs ont démontré un succès marginal dans la génération de tissu de type pulmonaire capable d’échanges gazeux in vivo. Bien qu’ils offrent une preuve de concept essentielle, les modèles de rongeurs ne sont pas directement transposables à l’utilisation humaine. Les primates non humains (PNH) offrent un modèle plus approprié pour étudier l’utilisation de la production d’organes bioartificiels pour une utilisation clinique éventuelle.
Les protocoles pour réaliser la décellularisation complète des poumons acquis du macaque rhésus NHP sont présentés. Les poumons acellulaires qui en résultent peuvent être ensemencés avec une variété de cellules, y compris des cellules souches mésenchymateuses et des cellules endothéliales. Le manuscrit décrit également le développement d’un système de bioréacteur dans lequel des poumons de macaque enracinés dans des cellules peuvent être cultivés dans des conditions d’étirement mécanique et de déformation fournies par la ventilation à pression négative ainsi que la perfusion pulsatile à travers le système vasculaire ; Ces forces sont connues pour diriger la différenciation le long des lignées pulmonaires et endothéliales, respectivement. Des résultats représentatifs de la décellularisation et de l’ensemencement cellulaire sont fournis.
Introduction
La bio-ingénierie des tissus et des organes est un ajout intéressant au domaine de la médecine régénérative. La création d’organes « cultivés en laboratoire » qui conviennent à la transplantation chez les patients pour remplacer la fonctionnalité des organes malades est hautement souhaitable afin de répondre à la demande actuelle et future de besoins de transplantation. Les principes de l’ingénierie tissulaire sont centrés sur l’ensemencement des types de cellules souhaités, ou de leurs progéniteurs, dans un échafaudage qui soutient la forme du tissu modifié tout en fournissant les facteurs de croissance appropriés et les conditions de culture nécessaires pour imiter les processus de développement ou de régénération. Bien que des échafaudages synthétiques aient été utilisés pour l’ingénierie tissulaire, la matrice extracellulaire naturelle (MEC) peut être la meilleure source d’échafaudages spécifiques aux organes à cette fin. La décellularisation de l’organe entier est un processus qui permet l’élimination des cellules tout en laissant intacts les aspects chimiques et structurels de la MEC native. L’échafaudage matriciel acellulaire qui en résulte peut être utilisé comme plate-forme sur laquelle des cellules régénératives peuvent être ensemencées et cultivées in vitro1,2.
Plusieurs modèles de décellularisation pulmonaire et de recellularisation ultérieure ont été développés pour étudier la faisabilité de cette technologie3-6. Bien qu’ils offrent une preuve de concept essentielle, les modèles de rongeurs ne sont pas directement transposables aux besoins cliniques humains. Une étude récente a souligné que les réponses génomiques aux lésions traumatiques (et à l’inflammation associée) ne sont pas bien corrélées entre les souris et les humains ; Ces résultats soulèvent des questions sur la validité de l’utilisation de souris comme modèles pour des processus biochimiques aussi complexes chez l’homme7. Les modèles de primates non humains (PNH) offrent l’avantage de ressembler étroitement à la biologie des humains aux niveaux génomique, anatomique et physiologique et permettent une manipulation plus flexible pour une plus grande extrapolation à l’utilisation humaine. Le macaque rhésus a été utilisé dans une variété d’applications précliniques et constitue un excellent modèle pour étudier l’ingénierie tissulaire8-11. Nous avons récemment décrit la décellularisation réussie des poumons de macaque rhésus (Macacca mulatta) à l’aide d’une procédure qui a un impact minimal sur la MECpulmonaire 12. La décellularisation pulmonaire est réalisée en traitant le tissu consécutivement avec quatre solutions de décellularisation composées de détergents, de sels et d’enzymes avec un lavage intermittent avec de l’eau désionisée (dH2O) et PBS. Nous avons optimisé cette procédure en modifiant un protocole décrit à l’origine par Price et al.4 Diverses techniques d’analyse histologique et protéique ont été utilisées pour caractériser les composants des matrices acellulaires résultantes par rapport aux poumons indigènes de macaque.
Dans ce rapport, nous démontrons un protocole détaillé pour la décellularisation des poumons de primates non humains et la recellularisation des échafaudages pulmonaires acellulaires résultants dans un bioréacteur à grand organe initialement démontré par Calle et al. En modifiant leur protocole original pour tenir compte de la taille, de la ventilation et des exigences de perfusion des poumons des grands animaux, la technologie a été transférée avec succès du modèle de rongeur au modèle de macaque rhésus. Toutes les études présentées dans ce rapport ont été réalisées conformément aux politiques du Comité institutionnel de biosécurité (IBC) en place au Centre national de recherche sur les primates de Tulane. La démonstration de cette technique est essentielle car l’identification des structures anatomiques et la manipulation physique d’organes plus grands sont parfois difficiles sans visualiser les étapes du protocole. Les études rendues possibles par ces méthodes fournissent une base pour des études précliniques essentielles dans des poumons de macaque rhésus décellularisés, dans lesquelles la recellularisation avec des cellules souches de la lignée mésenchymateuse rhésus et des cellules endothéliales microvasculaires rhésus peut être évaluée. Notre version de ce bioréacteur simule l’environnement de développement et applique des forces d’étirement et de déformation mécaniques dans les poumons des grands animaux et permet d’étudier la recellularisation pulmonaire dans des conditions connues pour faciliter le développement pulmonaire et endothélial13-15.
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Protocole
1. Décellularisation pulmonaire du macaque à organe entier
- Préparation des solutions
- Autoclave 10-15 L d’eau déminéralisée (dH2O) en bouteilles de 1-2 L.
- Préparez la « solution Triton » (0,1 % de Triton X-100 en dH2O) en mélangeant 1 ml de Triton X-100 dans 999 ml de dH2O en agitant à l’aide d’un agitateur magnétique. Filtrez la solution à travers un appareil de filtration de 0,22 μm. Conserver à température ambiante.
- Préparez une « solution SDC » (2 % de SDC en dH2O) en ajoutant lentement 20 g de désoxycholate de sodium (SDC) à ~900 ml dH2O en remuant. Une fois le SDC dissous, transférez la solution dans un cylindre gradué et portez le volume à 1 ml avec dH2O. Filtrez la solution à travers un appareil de filtration de 0,22 μm. Conserver à température ambiante.
- Préparez la « solution de NaCl » en ajoutant 58 g de NaCl à ~900 ml dedH2O et remuez jusqu’à dissolution complète. Ajouter du dH2O à un volume final de 1 L, filtrer et conserver à température ambiante.
- Préparation des organes
- Il faut prendre les plus grands précautions pour prévenir les incidents d’exposition infectieuse lors du travail avec des tissus de macaque. Mettez l’équipement de protection individuelle (EPI) suivant avant de manipuler des tissus de primates non humains : masque chirurgical, écran facial, gants chirurgicaux, blouse jetable et une deuxième couche de gants chirurgicaux.
- Prélever des blocs cœur-poumon intacts à partir d’une nécropsie animale dans du PBS contenant 50 U/ml d’héparine pour prévenir la coagulation du sang externe.
- Avec les poumons à plat dans un plateau de dissection, canuler l’artère pulmonaire à l’aide d’un connecteur Luer femelle avec une barbillon de taille appropriée. Fixez la canule en place à l’aide d’un collier de serrage stérilisé à l’alcool.
- Glissez un collier de serrage stérile autour de la trachée, insérez un connecteur Luer femelle de 0,250 po dans l’ouverture trachéale et serrez le collier de serrage autour de l’ardillon du connecteur pour maintenir la trachée en place autour de l’ardillon.
- Éliminez l’air emprisonné des poumons en instillant du PBS contenant 30 U/ml d’héparine et 5 μg/ml de nitroprussiate sodique (SNP). Laissez la solution être expulsée par le recul naturel et répétez l’instillation deux fois de plus. Après la troisième instillation, recouvrir la canule Luer trachéale d’un bouchon Luer pour retenir la solution dans les poumons.
- Coupez l’apex du cœur et irriguez les ventricules internes avec du PBS-héparine-SNP pour éliminer le sang résiduel. Lacérer les deux oreillettes pour faciliter le drainage des circuits pulmonaires lors de la perfusion.
- Immerger le bloc cœur-poumon dans du dH2O. Remplir une seringue de 60 ml avec la solution PBS-héparine-SNP. À l’aide d’une pince, immergez la canule artérielle de manière à ce que toutes les bulles d’air s’échappent de l’ouverture vasculaire. Fixez la seringue et retirez délicatement le piston et laissez le liquide s’écouler dans le système vasculaire.
- Retirez le bouchon de la canule trachéale et laissez le liquide des voies respiratoires être expulsé par le recul naturel. Continuez à ajouter la solution PBS-héparine-SNP dans la seringue reliée à la canule vasculaire afin de maintenir une pression de ~15-20 cmH2O au-dessus de l’artère. Poursuivez la perfusion jusqu’à ce que la plus grande partie possible du système vasculaire pulmonaire soit retirée.
- Décellularisation
- Jour 1 : Immergez le bloc cœur-poumon dans du dH2O. Gonflez et perfuser le poumon avec du dH2O à l’aide de seringues de 60 ml fixées respectivement aux canules trachéales et artérielles immergées. Répétez les lavages des voies respiratoires et vasculaires avec dH2O 4 fois plus pour un total de cinq rinçages.
- Retirez les poumons de l’eau et immergez-le dans la solution Triton. Gonflez et perfuser les poumons avec la solution Triton comme précédemment. Répétez l’instillation une deuxième fois et incubez les organes immergés dans la solution de Triton pendant la nuit à 4 °C.
- JOUR 2 : Après une nuit d’incubation, retirez le bloc pulmonaire de la solution Triton, lavez-le à l’extérieur avec du dH2O, puis immergez-le dans du dH2O. Répétez les lavages dH2O 5 fois comme à l’étape 1.3.1.
- Retirez les poumons de dH2O et immergez-les dans une solution de SDC. Gonflez et perfusez avec la solution SDC de la même manière qu’à l’étape 1.3.2. Incuber immergé dans une solution de SDC pendant une nuit à 4 °C.
- JOUR 3 : Lavez à nouveau le mouchoir avec du dH2O comme au 1.3.1.
- Retirez le tissu dudH2O et immergez-le dans une solution de NaCl. Gonfler et perfuser avec la solution de NaCl de la même manière qu’à l’étape 1.3.2. Incuber immergé dans une solution de NaCl pendant 1 heure à température ambiante.
- Lavez les poumons de la solution de NaCl avec du dH2O comme à l’étape 1.3.1.
- Préparez une nouvelle « solution de DNase » (30 μg/ml de DNase, 1,3 mM de MgSO4, 2,0 mM de CaCl2 in dH2O) Baignez les poumons dans cette solution et instillez dans les voies respiratoires et le système vasculaire comme à l’étape 1.3.2. Incuber les poumons dans une solution de DNase pendant 1 heure à température ambiante.
- Préparez une « solution PBS » fraîche (1x PBS + 5x antibiotique/antimycosique). Retirez les poumons de la solution de DNase et lavez-les à l’extérieur avec la solution de PBS. Immergez les poumons dans une solution de PBS et lavez-les cinq fois avec cette solution comme à l’étape 1.3.1.
- Conservez les poumons dans une solution de PBS dans un récipient hermétique pendant la nuit à 4 °C. Le lendemain (JOUR 4), laver les poumons dans une solution de PBS fraîche et glacée cinq fois comme à l’étape 1.3.1 et les conserver dans une solution de PBS dans un récipient stérile et scellé à 4 °C jusqu’à utilisation.
2. Bioréacteur à grands organes
- Assemblage et installation de tissus
- Assemblez à l’avance les structures de l’anse respiratoire et de l’anse vasculaire ainsi que les adaptateurs des canules trachéales et vasculaires (Figure 1). À l’exception des filtres à air stériles et des orifices de seringue, autoclavez tous les composants du bioréacteur.
- Assembler les composants du bioréacteur sous une hotte à flux laminaire selon le schéma de la figure 2. Remplissez la chambre principale avec un milieu de culture qui a été équilibré à l’atmosphère de CO2 à 5 % d’un incubateur de culture cellulaire immédiatement avant de l’utiliser dans le bioréacteur.
- Appliquez les adaptateurs de canules trachéales et vasculaires sur les canules pulmonaires et installez les organes dans la chambre principale du bioréacteur en baignant les poumons dans le milieu de culture et en fixant les adaptateurs de canules aux orifices appropriés dans le couvercle modifié. Une fois connecté, fixez le couvercle de manière sûre et serrée ; La chambre ne sera pas rouverte pendant la durée de la recellularisation.
- Remplissez le réservoir trachéal à moitié environ avec du milieu de culture et fixez le capuchon modifié.
- Appliquez des filtres à seringue stériles de 0,22 μm, des bouchons Luer et des orifices de seringue dans toutes les chambres comme indiqué.
- Connectez le réservoir de la trachée à la chambre principale via l’appareil à boucle respiratoire. Fixez la tubulure de la boucle respiratoire comme indiqué.
- Aspirer l’air de la tubulure à l’aide des orifices de la seringue et d’une seringue de 60 ml munie d’une aiguille de 18 G ; déplacer la directionnalité des robinets d’arrêt à 3 voies pour diriger l’écoulement du liquide dans la seringue.
- Déplacez les chambres de bioréacteur scellées et connectées de manière contiguë avec les organes installés vers un incubateur de culture tissulaire pour équilibrer la température et le gaz. Aérer les poumons à l’aide d’un pousse-seringue fixé à la chambre principale à ~1 « respiration » complète toutes les 2 min, et perfuser le système vasculaire via la pompe péristaltique à environ 10 ml/min pour un total de ~30 min.
- Ensemencement des voies respiratoires
- Préparez des suspensions de cellules à ensemencer dans les voies respiratoires à la densité cellulaire souhaitée (le volume dépendra de la taille de l’organe).
- Gonflez les poumons avec la suspension cellulaire en injectant doucement à travers l’orifice de seringue fixé au robinet d’arrêt à trois voies dans la boucle respiratoire.
- Maintenir les poumons statiquement à 37 °C, 5 % de CO2 pendant la nuit sans voies respiratoires ni perfusion vasculaire pour permettre aux cellules de se fixer à la matrice pulmonaire décellularisée.
- Après une nuit d’incubation, relancez le programme standard de ventilation des voies respiratoires et cultivez les organes pendant 3 à 7 jours (ou pendant une autre durée souhaitée).
- Ensemencement vasculaire
- Préparez des suspensions de cultures de cellules endothéliales comme ci-dessus pour l’ensemencement des cellules des voies respiratoires.
- Transférez la suspension cellulaire dans le réservoir d’ensemencement endothélial qui contient une petite barre d’agitation magnétique.
- Modifiez la directionnalité de la voie d’écoulement de la chambre principale vers le réservoir d’ensemencement endothélial en tournant la vanne sur le robinet d’arrêt positionné dans la tubulure reliant ces deux compartiments, et ensemencez progressivement les cellules endothéliales tout en remuant doucement à l’aide de la pompe péristaltique.
- Lorsque l’ensemencement est terminé (c’est-à-dire que le volume de suspension de cellules endothéliales est épuisé dans le réservoir d’ensemencement endothélial), arrêtez la perfusion et incubez statiquement pendant ~4 à 6 heures. Relancez la perfusion vasculaire avec le milieu de la chambre principale à un débit de ~10 ml/min (ou la pression souhaitée si surveillée).
- Culture pendant 3 à 7 jours avec perfusion vasculaire continue.
3. Dépannage et approches alternatives
- Canulation trachéale : Des sutures peuvent être utilisées à la place d’un lien zippé pour maintenir la canule Luer en place si la trachée est trop petite. Une connexion Luer femelle de 1/4 po agit comme une canule suffisante pour une large gamme de diamètres de trachée.
- Élimination du sang par perfusion de l’artère pulmonaire : Étant donné que les tissus sont prélevés sur des animaux cadavériques, les microthrombi sont fréquents et empêchent certaines zones du lit capillaire pulmonaire d’être complètement débarrassées du sang résiduel. Au cours de la décellularisation, cependant, ces petits vaisseaux deviennent perméables et les réactifs de décellularisation lysent et dégradent efficacement ces caillots. Une perfusion de prédécellularisation doit être effectuée pour évacuer le plus de sang possible, mais il n’est pas nécessaire d’éliminer toutes les traces de sang du parenchyme.
- Expulsion des fluides des poumons : Les poumons du macaque conservent un fort recul naturel ex vivo, même lorsqu’ils sont gonflés avec des liquides. Cependant, lors de la décellularisation, les cellules sont lysées et libèrent des matériaux (y compris l’ADN) qui augmentent la viscosité des fluides instillés, ce qui les rend plus difficiles à expulser. Une incubation d’une nuit à 4 °C immergé dans le liquide instillé est généralement suffisante pour permettre aux poumons d’expulser complètement le liquide visqueux. Alternativement, laissez autant de liquide que possible être expulsé des poumons, puis procédez à l’instillation des solutions suivantes ; L’ajout de détergents et de lavages à l’eau déminéralisée facilite généralement l’élimination des fluides visqueux et permet à la décellularisation de se dérouler efficacement.
- Ajout d’antibiotiques aux solutions détergentes : Des antibiotiques et des antimycosiques peuvent être ajoutés aux solutions de lavage à l’eau déminéralisée ainsi qu’aux solutions détergentes ; cependant, la pénicilline/streptomycine précipite en présence de désoxycholate de sodium, et ces précipités peuvent interférer avec les processus de décellularisation et de lavage. De plus, la présence d’antibiotiques/antimycosiques n’est pas nécessaire lors de la décellularisation car les détergents utilisés à ces concentrations sont capables de lyser et de tuer les microbes. Après la décellularisation, le rinçage et le stockage avec une solution de PBS (contenant 5x pénicilline/streptomycine/amphotéricine B) sont suffisants pour prévenir la plupart des contaminations.
- Évacuation de l’air de la tuyauterie du bioréacteur : l’air est aspiré efficacement de la tuyauterie du bioréacteur à l’aide d’une seringue avec une aiguille insérée dans les orifices de l’aiguille dans les robinets d’arrêt à trois voies. Alternativement, 1x PBS ou milieu de culture peut être rincé à travers le tube avant l’installation des organes à l’aide d’une seringue fixée de la même manière.
- Ventilation et perfusion des poumons pendant et après la recellularisation : Bien que les débits et les temps indiqués dans le présent rapport soient suffisants pour l’attachement des cellules ainsi que pour la ventilation liquide des voies respiratoires et la perfusion vasculaire, ces valeurs doivent être déterminées empiriquement par l’utilisateur. Les temps de culture peuvent également être ajustés en fonction des taux de croissance des cellules instillées.
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Résultats
Les résultats présentés ci-dessous représentent des expériences distinctes dans lesquelles les compartiments des voies respiratoires ou vasculaires ont été ensemencés respectivement avec des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse de macaque rhésus ou des cellules endothéliales microvasculaires dérivées du poumon de macaque rhésus, isolées et caractérisées comme décrit précédemment16-18.
Tout au long du processus de décellularisation, les poumons de macaque o...
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Discussion
Les tissus peuvent être décellularisés de manière efficace et efficiente par un certain nombre de méthodes utilisant des agents physiques, chimiques et enzymatiques12,20. Les défis de la production de matrices biologiques 3D à partir de grands organes comprennent la nécessité de grands volumes de solutions de décellularisation, d’équipements commerciaux coûteux (c’est-à-dire des bioréacteurs) et une quantité vertigineuse de perturbations méthodologiques nécessaires pour obtenir le produit final dérivé...
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Déclarations de divulgation
Nous n’avons rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs souhaitent remercier les rédacteurs de Tissue Engineering d’avoir autorisé l’utilisation d’images d’une publication précédente dans ce rapport.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nitroprussiate de sodium | Sigma-Aldrich | 71778-25G | |
| Héparine sel de sodium | Fisher | BP2425 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Désoxycholate de sodium | Fisher | BP349-100 | |
| Chlorure de sodium | Fisher | 7647-14-5 | |
| DNase pancréatique bovine | Sigma-Aldrich | DN25 | Préparation de la matière, aliquote et congélation |
| Sulfate de magnésium | Fisher | 10034-99-8 | |
| Chlorure de calcium | Fisher | C614-500 | |
| PBS (sans Ca/Mg) | Gibco, Life Technologies | 10010-031 | |
| Antibiotique-antimycosique | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| Milieux | |||
| Alpha MEM | Gibco Life Technologies | 12561-072 | |
| Moyen 199 | Gibco Life Technologies | 11150067 | |
| Sérum de veau fœtal de qualité supérieure | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| L-Glutamine 100x | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| Supplément de croissance des cellules endothéliales (ECGS) | ScienCell | 1052 | |
| Antibiotique-antimycosique | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| Ensemencement cellulaire et culture de bioréacteur | |||
| Clapets anti-retour | Cole-Parmer | EW-98553-20 | |
| Connecteurs en Y | Cole-Parmer | ED-30614-08 | |
| Robinets d’arrêt à 3 voies Appareil | Harvard | 721664 | |
| MasterFlex L/S 14 tubes | Cole-Parmer | 96420-14 | |
| MasterFlex L/S 16 tube | Cole-Parmer | 96420-16 | |
| Serrure mâle Luer 1/8 po | Cole-Parmer | EW-45505-04 | |
| Femelle Luer 1/8 po | Cole-Parmer | SI-45502-04 | |
| Bouchon Luer mâle | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Orifices d’injection | Medi-Dose EPS | IV2004 | |
| Tubulure en latex | St. Louis Medical Suppy | HN10910 | |
| Collier de serrage | Cole-Parmer | EW-06832-02 | |
| Pot à large ouverture 2 L | Fisher | 05-719-276 | |
| Seringues de 60 ml | Fisher | NC9035364 |
Références
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Réimpressions et autorisations
