Sauvetage de virus de la maladie de Newcastle recombinant à partir d'ADNc

Résumé

Virus de la maladie de Newcastle (NDV) a été largement étudiée au cours des dernières années afin de développer de nouveaux vecteurs pour la vaccination et le traitement, entre autres. Ces études ont été possibles grâce à des techniques de sauvetage virus recombinant à partir d'ADNc, comme celles que nous décrivons ici.

Résumé

Le virus de la maladie de Newcastle (NDV), le membre prototype du genre Avulavirus de la famille des Paramyxoviridae ^1, est un, de sens négatif non segmenté simple brin, virus enveloppé à ARN (Figure 1) avec des applications potentielles en tant que vecteur pour la vaccination et traitement de maladies humaines. Exploration de ces applications en profondeur est seulement devenu possible après la mise en place de techniques de génétique inverse pour sauver des virus recombinants de plasmides codant pour leurs génomes complets comme ADNc ^2-5. ADNc viral peut être facilement modifiée in vitro en utilisant des procédures de clonage standard pour modifier le génotype du virus et / ou pour inclure de nouvelles unités de transcription. Sauvetage de ces virus génétiquement modifiés constitue un outil précieux pour comprendre les facteurs qui affectent plusieurs stades de l'infection, ainsi que permet le développement et l'amélioration des vecteurs pour l'expression et la livraison des antigènespour la vaccination et de la thérapie. Ici, nous décrivons un protocole pour le sauvetage de NDVs recombinantes.

Introduction

Virus de la maladie de Newcastle (NDV), un paramyxovirus aviaire appartenant au genre Avulavirus ^1, est un agent zoonotique économiquement pertinent et donc largement étudiée et surveillée, qui peuvent gravement affecter l'élevage de volailles dans le monde entier. Bien que n'étant pas un agent pathogène humain, NDV a également été étudiée à fond au-delà du champ de vétérinaire à la fois comme un paramyxovirus de modèle et en raison de ses très intéressantes, les propriétés oncolytiques naturelles ^6. Recherche sur le NDV a grandement bénéficié de l'évolution des techniques de génétique inverse pour, non segmentés virus à ARN....

Protocole

Une. Préparation des cellules de mammifères (figure 4A, Jour 1)

Scission HEp-2 ou des cellules A549 le jour avant la transfection dans des plaques à 6 puits. Densité de cellules doit atteindre 80 à 90% de confluence le jour suivant. Habituellement, un confluent boîte de 100 mm peut être divisé en 8 puits (environ 1 x 10 ⁶ cellules par puits). Pour chaque virus pour être sauvé, 2-4 puits différents devraient être inclus, ainsi que deux puits supplémentaires pour les contrôles pCAGGS-GFP et pCITE-GFP ^18, visant à surveiller la transfection et MVA-T7 efficacité d'infection, respectivement.

Résultats

Sauvetage de NDV est une procédure bien établie, régulièrement effectuées dans les laboratoires qui ont accès à l'ADNc complet du virus. Cependant, la nature stochastique intrinsèque du procédé, il est difficile d'atteindre 100% d'efficacité de sauvetage. Suivi des premières étapes du processus, spécialement l'efficacité de la transfection et l'infection par le MVA-T7, aide à identifier les problèmes possibles. Figure 5A montre transfection standard et l'efficacité de transfection / infection qui sont a.......

Discussion

Plusieurs facteurs sont à considérer pour obtenir de bons résultats tout en sauvant NDV. Tout d'abord, la construction d'ADNc de pleine longueur à utiliser doit être conçu pour permettre l'incorporation fonctionnelle des nouvelles modifications / transgènes dans le génome du NDV. Cela signifie, comme indiqué ci-dessus, que (i) fin appropriée du gène (GE), intergénique (IG) et début de gène (GS) des séquences doivent être ajoutés si nécessaire, (ii) il n'existe pas de séquences GE ou GS putatifs dans le é.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Tout fournisseur
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35 % Albumine bovine (BA)	Sigma	232-936-2	Tout fournisseur
Trypsine-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Tout fournisseur
Pénicilline/Streptomycine (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Tout fournisseur
Sérum fœtal bovin (FBS)	Hyclone	SH30070.03	N’importe quel fournisseur
Lignées cellulaires cellules A549 (numéro de catalogue CRL-185), cellules HEp-2 (numéro de catalogue CRL-185), fibroblastes d’embryons de poulet (numéro de catalogue CRL-12203) et fibroblastes d’embryons de canard (numéro de catalogue CCL-141) sont disponible auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 États-Unis). Toutes les lignées cellulaires sont maintenues à une température de 37 ° ; C avec 5 % de CO2 dans DMEM 10 % FBS, 1 % PS. Œufs de poule embryonnés Les œufs de poule embryonnés peuvent être obtenus auprès de Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) et sont maintenus à 37 ° ;C. La viabilité des embryons est évaluée à l’aide d’un candler d’oeuf. Les œufs sont infectés lorsqu’ils atteignent l’âge de 8 à 10 jours. L’infection et la récolte du liquide allantoïdien ont lieu dans des conditions stériles. Tous les œufs sont autoclavés et jetés conformément aux protocoles de biosécurité standard en laboratoire. Turkey Red blood cells (RBC) Turkey RBC peuvent être achetés auprès de Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, États-Unis) et conservés à 4 °C. Pour préparer les globules rouges pour le dosage de l’AH, laver 5 ml du stock commercial avec 45 ml de PBS 1x dans un tube conique de 50 ml. Centrifugez pendant 5 min à 1 000 tr/min et jetez soigneusement le surnageant. Granulés dilués de globules rouges 1:1 000 dans PBS 1x pour une concentration finale de 0,5 à 1,0 %. Les globules rouges lavés peuvent être conservés à 4 ° ; C pendant plusieurs jours. Plasmids Les préparations plasmidiques sont obtenues avec n’importe quel kit maxiprep disponible dans le commerce suivant le fabricant' ; , dilué dans du ddH20 jusqu’à une concentration finale de 1 &mu ; g/&mu ; l et stocké à -20 ° ;C. La concentration et la pureté de l’ADN sont évaluées par spectrophotométrie à 260 et 280 nm. Les préparations dont le rapport 260/280 est supérieur à 1,8 sont considérées comme de qualité acceptable pour le sauvetage. La qualité de l’ADN plasmidique est également régulièrement vérifiée par chromatographie sur gel d’agarose. Viruses Le protocole décrit pour le sauvetage de la souche lentogène NDV Hitchner B1 peut être réalisé dans des conditions de niveau de biosécurité (BSL) 2. La vaccine Ankara modifiée exprimant l’ARN polymérase T7 (MVA-T7) a été décrite 34 et obtenue auprès du Dr Bernard Moss. Ce virus est une croissance dans des monocouches confluentes de fibroblastes d’embryons de poulet et titrée dans des cellules de mammifères (A549 ou HEp-2). Les souches de NDV sont cultivées dans des œufs de poule embryonnés et titrées par l’IFA à l’aide de sérum polyclonal élevé contre des virions purifiés. Tout le matériel contaminé doit être stérilisé et éliminé en toute sécurité conformément aux procédures de biosécurité standard. Milieux et solutions de culture tissulaire : DMEM 10 % FBS 1 % PS : Dulbecco' ; s modifié Eagle' ; s Milieu (DMEM) complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et pénicilline/streptomycine (P/S) : 445 ml de DMEM, 50 ml de FBS inactivé par la chaleur, 5 ml de solution commerciale 100x P/S. Conserver à 4 ° ;C. 10x Saline tamponnée au phosphate (PBS) : 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na2HPO4.7H2O, 2 g de KH2PO4. Ajouter du ddH2O jusqu’à 1 L. Ajuster le pH à 7,3. Stériliser par autoclave. Conserver à température ambiante. 1x PBS : Diluer 10x PBS 1:10 avec ddH2O. Stériliser en autoclave et conserver à température ambiante. 100x Ca/Mg : 1,327 g CaCl2.2H2O, 2,133 g de MgCl2.6H2O et ajouter du ddH2O jusqu’à 100 ml. Autoclave et entreposage à température ambiante. 1x PBS/BA/PS : 50 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 10x dans 437 ml de ddH2O. Autoclave et, une fois refroidi à température ambiante, ajouter 5 ml de pénicilline/streptomycine 100x, 3 ml de 35 % de bovins et 5 ml de 100x Ca/mg. Conserver à 4 ° ;C.