La micro-injection est une technique couramment utilisée pour fournir des constructions d'ADN, ARNm, des oligonucléotides morpholino antisens ou d'autres traitements dans les œufs, les embryons et les cellules de diverses espèces.
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Article de méthode
À haut débit microinjections oursins zygotes
Dans cet article
Résumé
Résumé
La micro-injection dans des cellules et des embryons est une technique couramment utilisée pour étudier un grand nombre de processus biologiques. Dans ce procédé, une petite quantité de solution de traitement est chargée dans une aiguille de micro-injection qui est utilisée pour injecter physiquement les cellules immobilisées ou des embryons individuels. Malgré la nécessité d'une formation initiale pour effectuer cette procédure pour la livraison à haut débit, la micro-injection offre un maximum d'efficacité et de livraison reproductible d'une grande variété de solutions de traitement (y compris les mélanges complexes d'échantillons) dans les cellules, les ovules ou d'embryons. Applications aux micro-injections comprennent la livraison de constructions d'ADN, ARNm, protéines recombinantes, gain de fonction, et la perte de réactifs de fonction. Colorant fluorescent ou colorimétrique est ajouté à la solution injectée pour permettre la visualisation instantanée de la livraison efficace, ainsi que d'un outil pour la normalisation fiable de la quantité de la solution fournie. La méthode décrite permet la micro-injection de 100-400 oursin zygotes dans 10-15 min.
Introduction
L'administration du traitement efficace et reproductible est l'un des principaux défis méthodologiques pour les chercheurs. Plusieurs méthodes ont été mis en place pour fournir des solutions de traitement transitoire dans les oeufs, embryons et les cellules. Ces procédés comprennent l'électroporation (basé sur une génération de pores transitoires de la membrane à l'aide de courtes impulsions électriques) 1,2, la lipofection (livraison par la fusion de liposomes contenant au traitement avec la membrane) 1, 1 bombardement de microparticules (ADN est précipité sur le micron particules de taille métalliques qui sont ensuite utilisés ....
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Protocole
Une. Préparation de Sulfate de protamine (PS) Plats couché
- Préparer une solution à 1% de sulfate de protamine (PS) en ajoutant 0,5 g de PS à 50 ml d'eau désionisée, de l'eau distillée (FD 2 O) dans un tube conique de 50 ml. Bien agiter à grande vitesse sur un agitateur de banc à la température ambiante pendant 1-2 heures pour assurer la dissolution complète de PS. Cette solution peut être conservé à 4 ° C pendant au moins 3 mois (assurez-vous de dissoudre complètement précipité de gel avant chaque utilisation) 3.
- Prenez une douille de 60 mm x 15 mm de polystyrène boîtes de Pétri et exposer les deux couvercles et les ....
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Résultats
GFP et mCherry constructions rapporteurs ont été transcrits in vitro et micro-injecté dans les œufs nouvellement fécondés. Les embryons ont été incubées à 15 ° C pendant 24 heures (jusqu'à ce que le stade blastula) et imagées par Zeiss Observateur Z1 microscope. Injection de constructions rapporteurs n'a pas conduit à des défauts de développement (figure 6). Pour la quantification de signaux de fluorescence, l'acquisition des images a été effectuée à un faible grossissement (100X) pour capturer.......
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Discussion
La micro-injection est une technique puissante pour délivrer divers traitements tels que l'ADN, l'ARNm, des protéines recombinantes, une perte de fonction et de gain de fonction de réactifs, les colorants et leurs combinaisons dans des œufs, des embryons et des cellules de divers organismes 7.1. Toutefois, plusieurs considérations doivent être gardées à l'esprit lors de la conception d'une expérience de micro-injection.
Il est extrêmement important de prendre en co.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents ou d'autres conflits d'intérêts.
Remerciements
Nous remercions Santiago Suarez pour la lecture critique du manuscrit et Betty Cowgill à l'aide de la photographie. Nous remercions également les relecteurs anonymes pour leurs commentaires critiques. Ce travail est soutenu par l'Université du Delaware Fonds de recherche.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Pipettes Pasteur en verre | VWR | 14673-043 | ; |
| Microscope inversé ; Axiovert 40 ° ; C | Zeiss | 4109431007990000 | Microscope à injection |
| Embouts de microchargeur | Eppendorf | 5242 956.003 | Solution d’injection de charge |
| Maille filtrante en nylon 80 ; &mu ; m | Amazon.com | 03-80-37 | Filtrer les œufs pour se débarrasser des débris |
| P20 ou P200 Pointes de pipette barrière anti-aérosol | Fisher Scientific | 02707432 ou 02707430 | Partie d’une pipette buccale |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Partie d’une pipette buccale |
| Tube en polyéthylène | Intramedic | PE-160 | Partie d’une pipette buccale |
| Sulfate de protamine | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attacher des œufs en gelée à des boîtes d’injection |
| Oursins S. purpuratusPt | . Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | ; |
| Eau de mer | n’importe quelle animalerie | Instant Ocean | ; |
| Stérile 60 mm x 15 mm Boîte de Pétri en polystyrène | Fisher Scientific | 0875713A | Boîtes d’injection |
| Micromanipulateur à positionnement grossier à trois axes MMN-1 | Narishige | 9124 | Aiguille d’injection |
| à manipuler Joystick à trois axes Type Huile Micromanipulateur fin hydraulique MMO-202ND | Narishige | 9212 | Aiguille d’injection à manipuler Pipettes |
| de transfert | Fisher Scientific | 13-711-9AM& | nbsp ; |
| Vertical ; extracteur d’aiguille ; | Narishige | PC-10 | Aiguilles d’injection Pull |
Références
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y.
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Réimpressions et autorisations
