Visualisation du flux cytoplasmique pendant la cicatrisation d’une plaie unicellulaire chez Stentor coeruleus

Résumé

Le Stentor coeruleus cilié géant est un système classique pour l’étude de la régénération et de la cicatrisation des plaies dans des cellules uniques. En imageant simultanément les cellules de Stentor à faible et à fort grossissement, il est possible de mesurer les flux cytoplasmiques avant, pendant et après la blessure.

Résumé

Bien que la cicatrisation des plaies soit souvent abordée au niveau des tissus entiers, dans de nombreux cas, les cellules individuelles sont capables de guérir les plaies à l’intérieur d’elles-mêmes, réparant la membrane cellulaire brisée avant que le contenu cellulaire ne s’échappe. L’organisme unicellulaire géant Stentor coeruleus, dans lequel les cellules peuvent mesurer plus d’un millimètre, a été un organisme modèle classique pour l’étude de la cicatrisation des plaies dans les cellules uniques. Les cellules de Stentor peuvent être coupées en deux sans perte de viabilité, et peuvent même être coupées et greffées ensemble. Mais cette grande tolérance à la coupe soulève la question de savoir pourquoi le cytoplasme ne s’écoule pas simplement de la taille de la coupe. Nous présentons ici une méthode pour couper les cellules de Stentor tout en imageant simultanément le mouvement du cytoplasme à proximité de la coupe à haute résolution spatiale et temporelle. La clé de notre méthode est d’utiliser une configuration de microscope à deux étages dans laquelle la chirurgie est réalisée sous un microscope de dissection focalisé sur une chambre qui est simultanément vue d’en bas à haute résolution à l’aide d’un microscope inversé avec une lentille à haute ouverture numérique. Cette configuration permet un haut niveau de contrôle sur l’intervention chirurgicale tout en permettant un suivi à haute résolution du cytoplasme.

Introduction

La régénération et la cicatrisation des plaies sont des processus biologiques importants dont les mécanismes restent des domaines d’investigation actifs. En effet, la capacité à guérir les plaies et à régénérer les parties endommagées est l’une des caractéristiques qui distinguent les êtres vivants des objets inanimés. Normalement, on pense que la régénération est médiée par la différenciation des cellules souches en divers types de cellules nécessaires pour reconstruire une partie animale endommagée ou sectionnée, tandis que la cicatrisation des plaies est considérée en termes de nouvelles cellules envahissant une plaie pour reconstruire un épithélium intact. Ainsi, les deux processus semblent être médiés par des collectifs de cellules individuelles, et semblent donc être des processus multicellulaires par excellence. Il est donc potentiellement surprenant que des cellules individuelles soient, dans certains cas, capables de réparer les plaies et de régénérer les composants perdus¹. La cicatrisation des plaies à l’intérieur de cellules individuelles peut impliquer plusieurs voies, notamment l’actine-myosine, la contraction du cordon de bourse autour de la plaie et le ragréage de la membrane par fusion rapide des vésicules exocytotiques^{1 à 3}. Bien que de nombreux types de cellules soient capables d’un certain degré de cicatrisation des plaies^4-6, l’exemple le plus spectaculaire est peut-être le cilié géant Stentor coeruelus⁷, illustré à la figure 1. Les cellules individuelles de Stentor mesurent 1 mm de long et sont recouvertes de rangées de cils. Les cellules de Stentor sont en forme de cône avec un appareil buccal, composé de milliers de cils, à une extrémité, et une structure étroite à l’autre extrémité. Stentor était un organisme modèle classique pour l’étude de la régénération, car si une partie de la cellule était coupée, elle pouvait se régénérer⁷. Par exemple, dans une série d’expériences classiques, Thomas Hunt Morgan⁸ a montré qu’une cellule de Stentor pouvait être coupée en deux et que chaque moitié régénérerait une cellule normalement proportionnée en quelques heures⁸. Les voies moléculaires responsables de la régénération chez Stentor restent complètement inconnues.

La capacité des cellules de Stentor à servir de système modèle de régénération dépend de l’étonnante capacité de ces cellules à se guérir elles-mêmes après avoir été coupées. Pourquoi le cytoplasme d'une cellule de Stentor ne s'échappe-t-il pas lorsque la cellule est coupée ? La cicatrisation des plaies n’est pas due à la contraction immédiate du cortex cellulaire, car il est possible de prendre deux cellules de Stentor, de les couper, puis de joindre les deux cellules coupées dans diverses configurations⁷. Au cours de telles expériences de greffe, le cytoplasme des deux cellules doit rester exposé puisqu’il fusionne lorsque les cellules sont poussées ensemble. D’une manière ou d’une autre, le cytoplasme est suffisamment exposé aux milieux environnants pour permettre la greffe, mais il ne s’écoule pas hors de la cellule. Le cytoplasme de Stentor est-il suffisamment élastique pour qu’il ne puisse tout simplement pas s’écouler même lorsqu’un grand trou est fait dans la membrane plasmique ? Les cellules augmentent-elles la viscosité du cytoplasme localement autour d’une plaie pour empêcher le cytoplasme de s’écouler ? Le cytoplasme est un matériau actif très complexe^9-11, et la réponse de cicatrisation des plaies de Stentor représente une occasion unique d’étudier les flux cytoplasmiques et la mécanique pendant la cicatrisation des plaies sur cellule unique. Cependant, l’utilisation de méthodes chirurgicales pour induire des lésions chez Stentor pose un défi technique. Afin de couper une cellule de 1 mm de long à l’aide d’aiguilles de verre, le paradigme chirurgical conventionnel, il est nécessaire d’opérer à faible grossissement avec une longue distance de travail. Dans ces conditions d’imagerie, il n’est pas possible de suivre le flux du cytoplasme, et tout ce que l’on peut déterminer, c’est si le cytoplasme reste à l’intérieur de la cellule ou non. La vraie question que nous aimerions poser est de savoir comment le mouvement et la viscosité du cytoplasme peuvent changer pendant la coupe et la cicatrisation. Cela nécessite une imagerie à haute résolution. Nous présentons ici une adaptation du protocole de Tartare pour la coupe de Stentor⁷ qui permet de faire la coupe sous des optiques à faible grossissement pour voir la cellule entière tout en observant simultanément le flux du cytoplasme à haute résolution, ce qui permet d'utiliser ce système comme plate-forme pour explorer les mécanismes de cicatrisation des plaies unicellulaires.

Protocole

1. Culture et collecte de cellules

1. Procurez-vous des cellules de Stentor coeruleus soit à partir d’étangs naturels tels que décrits par Tartare⁷, soit auprès d’un fournisseur commercial (voir Réactifs).
2. Maintenir les cultures en les cultivant dans l’obscurité à 20 ºC dans un milieu Stentor modifié (MSM), adapté des recettes décrites par Tartar⁷ et De Terra¹² contenant 0,75 mM Na₂CO₃, 0,15 mM KHCO₃, 0,15 mM NaNO₃, 0,15 mM KH₂PO₄, 0,15 mM MgSO₄, 0,5 mM CaCl₂, et 1,47 mM de NaCl.
3. Complétez le milieu MSM avec une source de carbone en ajoutant des proies vivantes au milieu. Cultiver des cultures de Chlamydomonas reinhardtii en milieu TAP en utilisant des méthodes de culture standard¹³. Avant de nourrir, lavez les cellules de Chlamydomonas dans du MSM. Donner 300 ml de cultures de Stentor ~3 x 10⁷ cellules de Chlamydomonas 2 à 3 fois par semaine.
4. Prélever des cellules de Stentor pour la chirurgie à l’aide d’une pipette. Stentor a tendance à s’ancrer au fond et sur les côtés de la boîte de culture et, ainsi, afin de recueillir des cellules, agiter la culture en faisant bouillonner l’air à travers la pointe d’une pipette jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher et à nager librement.
5. Capturez les cellules nageuses à l’aide d’une pipette équipée d’une pointe large pour éviter de cisailler les cellules.
6. Laver les cellules collectées dans du MSM frais.

2. Préparation des outils pour la microchirurgie

1. Tenez deux tiges d’agitation en verre au-dessus d’un bec Bunsen ou d’une autre flamme jusqu’à ce que les extrémités commencent à fondre.
2. Touchez les extrémités des deux tiges ensemble pour que le verre fondu fusionne.
3. Après avoir créé une petite gouttelette de verre fondu entre les deux tiges, retirez-les de la flamme, laissez-les refroidir pendant 1 à 2 secondes, puis séparez-les pour faire une rupture nette. Idéalement, le verre se retire en fines ficelles et se brise en douceur à mesure que le verre refroidit, ce qui donne une aiguille d’environ 1 à 2 cm de long avec une pointe fine à l’extrémité (figure 2).
4. Si l’aiguille résultante n’est pas optimale, les pointes peuvent être brisées en déchets de verre et les tiges peuvent être réutilisées.

3. Montage de cellules pour la microchirurgie et l’observation (chirurgie normale)

1. Préparez une chambre carrée à paroi en vaseline à l’aide d’un tampon en caoutchouc carré recouvert de vaseline et pressé sur une lamelle en verre.
2. Ajoutez du MSM contenant 2 % de méthylcellulose au carré de vaseline.
3. Placez la lamelle dans un adaptateur en plastique, ce qui permet de la placer sur un microscope avec un porte-lame standard (Figure 3).
4. Ajoutez des cellules lavées à partir de l’étape 1.6 au MSM plus de la méthylcellulose pour entraver la motilité des cellules de Stentor afin qu’elles restent en place pendant la chirurgie.
5. Disposez les cellules dans la méthylcellulose de manière à ce qu’elles soient régulièrement espacées et qu’elles soient poussées suffisamment près de la surface de la lamelle pour être nettes pendant l’imagerie.

4. Imagerie haute résolution de la cicatrisation des plaies dans Stentor sous tension

Pour imager simultanément une cellule Stentor à haute résolution tout en la coupant chirurgicalement sous un faible grossissement, construisez un microscope à deux étages avec une lunette de dissection fixée à la tête de l’oculaire de la lunette inversée de sorte qu’elle soit focalisée sur le haut de la lame tandis que la lunette inversée est focalisée sous la lame.

1. Placez une diapositive sur la lunette inversée (utilisez un Zeiss Axiovert 200M ou un Olympus IX80).
2. Retirez le corps du microscope à dissection de son support et déterminez la position approximative au-dessus de l’oculaire du microscope inversé pour placer la lunette de dissection afin de permettre à la lame d’être visualisée à faible grossissement.
3. Modifiez une boîte en carton pour qu’elle ait la même épaisseur que l’espacement souhaité entre la tête de l’oculaire inversé et la lunette de dissection, puis collez-la dans la lunette inversée à l’aide de ruban adhésif de laboratoire qui peut être facilement retiré une fois l’expérience terminée. Ajustez l’épaisseur de la boîte en fonction de la configuration exacte de la tête de l’oculaire du microscope inversé et de la taille du microscope de dissection afin que l’échantillon soit dans le champ de vision sans avoir à déplacer la lunette de dissection une fois qu’elle est fixée.
4. En tenant la lunette de dissection contre la boîte, déplacez-la jusqu’à ce que la lame soit nette, puis collez-la à nouveau sur la boîte à l’aide de ruban adhésif de laboratoire. La configuration finale est illustrée à la figure 4.
5. Imagez les cellules à travers une lunette inversée à l’aide d’une optique DIC et d’un objectif aérien 20X. Utilisez un condensateur DIC à longue distance de travail pour fournir suffisamment d’espace pour effectuer la microchirurgie par le haut.
6. Acquérez des images à une fréquence d’images de 2 images/s à l’aide d’une caméra CCD 512 x 512.
7. Commencer l’acquisition avant de commencer à couper les cellules de manière à capturer le schéma de flux cytoplasmique initial et observer toutes les étapes du processus de blessure et de cicatrisation de la plaie.
8. Mettre fin à l’acquisition lorsque la cellule a retrouvé son aspect normal et/ou sa motilité active, afin de visualiser et de mesurer les mouvements cytoplasmiques tout au long du processus de régénération.

5. Analyse du flux cytoplasmique pendant la cicatrisation des plaies

Mesurez le flux cytoplasmique à l’aide de la vélocimétrie par image de particules (PIV). Cette technique est courante dans l’étude de la dynamique des fluides et peut générer des champs d’écoulement en l’absence de particules traçables individuellement dans le fluide. La PIV a été utilisée pour mesurer les flux de cytoplasme sur la base de l’imagerie, des vésicules subcellulaires et d’autres caractéristiques visibles dans le cytoplasme par microscopie à lumière transmise¹⁴.

1. Téléchargez PIVLab, un package MATLAB pour PIV, depuis le site web http://pivlab.blogspot.com/.
2. Chargez la pile d’images tiff pour chaque séquence vidéo dans le programme PIV de MATLAB.
3. Générez manuellement un masque pour chaque pile d’images afin de masquer les régions des données brutes en dehors du corps de Stentor.
4. Configurez PIVLab pour qu’il utilise le paramètre de transformation de Fourier rapide et une taille de corbeille de 64 x 64 pixels, qui divisera les pixels de chaque image en pixels carrés plus grands.
5. Exécutez PIVLab pour calculer les corrélations croisées entre les pixels de chaque image et les pixels voisins de l’image suivante afin d’obtenir un vecteur de flux dépendant du temps centré sur chaque pixel regroupé, qui a la même résolution temporelle que nos données brutes.
6. Calculez les moyennes temporelles de la sortie du champ vectoriel résultant pour générer des rationalisations permettant de comparer les données prises avec le Stentor avant la coupe et pendant la cicatrisation des plaies, et calculez des histogrammes des vitesses d’écoulement (pour étudier l’intensité de l’écoulement) et du changement de vitesse à un pixel donné au fil du temps (pour étudier les fluctuations de l’écoulement).
7. Pour des séquences d’images avec Stentor clivé en deux et le cytoplasme s’échappant visiblement dans la mémoire tampon environnante, calculez le flux total de cytoplasme dans le corps cellulaire proprement dit en multipliant la vitesse d’écoulement moyenne par la section transversale de la section transversale de la base de la bulle extracellulaire du cytoplasme.

Résultats

En utilisant les protocoles décrits ci-dessus, il a été constaté que le cytoplasme de Stentor est remarquablement dynamique, à la fois avant et après la coupe. La vidéo 1 montre le flux important de cytoplasme présent dans les cellules non coupées. Malgré notre attente initiale selon laquelle la capacité de Stentor à survivre à la coupe impliquerait un raidissement ou une gélification du cytoplasme, en fait, lorsque les cellules de Stentor sont coupées avec suffisamment de violence pour attirer le cytoplasme hors de la cellule, le cytoplasme reste très dynamique et parvient à refluer dans la cellule d'une manière hautement dirigée (vidéo 2).

En plus de démontrer un degré de mouvement cytoplasmique jusqu’alors insoupçonné pendant la cicatrisation des plaies, la haute résolution de l’imagerie dans le test peut être utilisée pour quantifier les débits à l’aide de la vélocimétrie par image de particules. La capacité d’effectuer de telles mesures permettra de tester rigoureusement l’effet des inhibiteurs chimiques.

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Vidéo 1. Exemple de flux cytoplasmique observé dans une cellule vivante de Stentor. Imagerie de la cellule avec un objectif 10X avec une optique en fond noir à une vitesse de 2 images/s.

Vidéo 2. Vued’une cellule de Stentor alors qu’elle est coupée et perturbée à l’aide d’une aiguille de verre. Après la coupe, une quantité substantielle de cytoplasme a été retirée du corps cellulaire principal, mais elle retourne rapidement dans la cellule.

Discussion

L’application la plus importante de cette méthode sera de l’utiliser pour déterminer les voies moléculaires qui régulent le flux cytoplasmique pendant la cicatrisation des plaies chez Stentor. Il existe une large gamme d’inhibiteurs chimiques qui ciblent les protéines motrices ainsi que les composants du cytosquelette. Les inhibiteurs de la signalisation calcique seraient également des candidats probables. Il serait également intéressant d’enlever ou de réduire les granules de pigment (extrusomes) contenant le pigment bleu Stentorin, dont la libération de la cellule est déclenchée sous l’effet d’un stress, et de se demander comment la libération exocytotique de Stentorin peut affecter le flux du cytoplasme voisin. Le pigment peut être appauvri à l’aide d’un simple traitement de blanchiment¹⁵ qui pourrait être effectué juste avant la coupe. Il ne semble pas y avoir de moyen simple d’effectuer le test de cicatrisation des plaies de manière parallèle, car les cellules doivent être coupées et imagées une par une. Ainsi, à l’aide d’un seul microscope, il serait possible d’opérer et de mesurer des cellules à une fréquence d’environ 1 par 0,5 heure, de sorte qu’au cours d’une seule journée de travail, il devrait être possible d’obtenir suffisamment de points de données pour un seul composé afin de déterminer s’il a un effet statistiquement significatif sur le processus. Bien que la méthode ne soit donc en aucun cas à haut débit, il sera tout à fait possible de cribler un ensemble sélectionné de composés candidats spécifiques à quelques voies cibles soigneusement choisies.

L’une des principales limites de l’approche actuelle est la méthode relativement rudimentaire d’assemblage du microscope à deux étages. En supposant que le microscope inversé utilisé pour l’imagerie est un instrument d’usage général que d’autres travailleurs doivent utiliser à d’autres fins, il est important de prendre en compte la facilité avec laquelle l’appareil peut être démonté et remonté. Bien que la méthode actuelle utilisant du ruban adhésif de laboratoire soit en effet rapide et facile à démonter, elle nécessite un alignement minutieux de la part de l’utilisateur lors de l’assemblage à chaque fois. Une modification importante serait donc de construire un support amovible personnalisé avec des fentes pour la tête de l’oculaire de la lunette inversée et le corps de la lunette de dissection. Cela devrait être facile à fabriquer à l’aide de la technologie moderne des imprimantes 3D.

Une deuxième limite de l’approche est la dépendance à l’imagerie DIC des organites intracellulaires comme marqueurs de flux. L’identité de ces organites observés au microscope n’étant pas connue à l’heure actuelle, il n’est pas possible de connaître leur taille ou leurs interactions potentielles avec d’autres composants cellulaires. Il peut donc être avantageux d’injecter des traceurs extrinsèques tels que des billes fluorescentes et de les utiliser pour suivre l’écoulement. Cependant, cela nécessiterait une étape supplémentaire - la micro-injection - avant que l’expérience puisse être réalisée, ce qui ralentirait encore plus le test.

La dernière limitation clé est la dépendance à l’égard d’un seul plan d’image pour l’acquisition des données. L’importance primordiale de ce test est qu’il va au-delà de la simple question de savoir si une plaie cicatrise ou non, et permet d’obtenir une analyse détaillée du modèle d’écoulement. À cet égard, il sera extrêmement important d’étendre l’imagerie à l’imagerie tridimensionnelle. La méthode actuelle image un seul plan focal et, par conséquent, lorsque l’analyse PIV est effectuée, le résultat est une coupe à travers le champ d’écoulement tridimensionnel complet. C’est informatif mais incomplet. En acquérant des images 3D à chaque pas de temps, il devrait être possible d’obtenir un champ d’écoulement entièrement tridimensionnel. Cela sera particulièrement critique pour observer exactement comment le cytoplasme se déplace à proximité immédiate du site de la plaie.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Stentor coeruleus culture vivante	Carolina Biological	131598
Methyl Cellulose, 1,500 cP	Sigma	M0387
ÉQUIPEMENT :
Nom du matériau	de catalogue		l’entreprise
Tige d’agitation en verre souple 5 po de long	Fisher Scientific	11-380A
Plat de culture 4.5 en 250 ml  ; verre	Carolina Biological	741004
IX81 microscope inversé	Olympus
Axiovert 200M microscope inversé	Zeiss
Stemi 2000 Stereomicroscope	Zeiss
Evolve 512 x 512 EMCCD appareil	photométrique
Plan Apo 20X objectif	Olympus	UPLSAPO