Extraction et analyse de cortisol de l'homme et de singe cheveux

Résumé

Cortisol (CORT) s'accumule dans l'arbre de la croissance des cheveux de l'homme et les primates non humains. Nous décrivons des méthodes pour extraire et analyser CORT de cheveux avec une grande précision et sensibilité. Mesure de cheveux CORT est particulièrement bien adapté pour évaluer le stress chronique sur des périodes de plusieurs semaines à plusieurs mois.

Résumé

Le cortisol, l'hormone du stress (CORT) est lentement incorporé dans la tige du cheveu de plus en plus d'êtres humains, les primates non humains et d'autres mammifères. Nous avons développé et validé une méthode pour l'extraction et l'analyse de CORT cheveux de singe rhésus et ensuite adapté cette méthode pour une utilisation avec des cheveux de cuir chevelu humain. Contrairement aux échantillons CORT "ponctuelles" obtenus à partir du plasma ou de la salive, des cheveux CORT fournit une mesure intégrée de l'activité du système hypothalamique-pituitaire-surrénale (HPA), et donc le stress physiologique, au cours de la période d'incorporation hormone. Parce que les cheveux de cuir chevelu humain croît à un taux moyen de 1 cm / mois, les niveaux CORT obtenus à partir de segments de cheveux plusieurs cm de longueur peuvent potentiellement servir de biomarqueur de stress vécu sur un certain nombre de mois.

Dans notre procédé, chaque échantillon de cheveux sont d'abord lavés deux fois dans de l'isopropanol pour éliminer tout CORT de l'extérieur de la tige du cheveu qui a été déposée à partir de la sueur ou le sébum. Après séchage, l'échantillon est broyé en une poudre fine pour briser la matrice protéique du cheveu et augmenter la surface d'extraction. CORT de l'intérieur de la tige du cheveu est extrait dans le methanol, on évapore le méthanol, et l'extrait est reconstitué dans du tampon d'essai. Extrait CORT, ainsi que des normes et des contrôles de qualité, est ensuite analysée à l'aide d'une enzyme disponible dans le commerce immunologique sensible et spécifique (EIE) du kit. Lecture de l'EIE est converti en pg CORT par mg de poids de cheveux poudrés. Cette méthode a été utilisée dans notre laboratoire pour analyser CORT de cheveux chez l'homme, plusieurs espèces de singes macaques, ouistitis, les chiens et les ours polaires. De nombreuses études à la fois de notre laboratoire et d'autres groupes de recherche ont démontré la large applicabilité de CORT de cheveux pour évaluer l'exposition au stress chronique naturel ainsi que les paramètres de laboratoire.

Introduction

Mesure de CORT dans le plasma, la salive, ou de temps en temps dans l'urine ou les matières fécales a été utilisée comme un indice de stress physiologique depuis la découverte par Selye du rôle de l'axe HPA en ^une contrainte. Bien que de nombreux articles ont été publiés concernant l'activité HPA à des situations stressantes aiguë, le champ a été entravée par l'absence d'un indice simple et fiable de stress physiologique chronique. Ce problème se pose parce que le plasma et la salive à la fois rendement estimations «ponctuelles» de l'activité HPA qui sont soumis à variation circadienne et peuvent être confondus par des perturbations....

Protocole

Une. Collecte et stockage des échantillons

1. Cheveux humains
   1. Fixer la totalité de la longueur de la chevelure à échantillonner (jusqu'à un crayon-largeur de diamètre) avec une bande de caoutchouc ou de ce plan. Coupe de cheveux au plus près du cuir chevelu que possible (en prenant soin de ne pas entailler la peau) avec une paire de ciseaux propres. Remarque: La zone d'échantillonnage standard est le sommet postérieure du crâne.
   2. Certains chercheurs ont signalé une baisse des niveaux de CORT de cheveux humains avec la distance du cuir chevelu ^6, qui peut être dû au lavage d'une exposition répétée à l'eau et du sham....

Résultats

La figure 1 montre l'impression d'un ensemble représentatif d'échantillons de cheveux humains (mâles adultes et des sujets humains de sexe féminin) traitées selon la méthode 2 broyage et d'extraction. Logiciels On a utilisé pour générer la sortie de données et pour adapter une courbe sigmoïde à 4 paramètres aux normes CORT (Figure 2). Les CV entre-bien de cette plaque variaient de 0,01 à 5,73% avec un CV moyen de 1,34% intra-essai. Le CV inter-essai déterminé en utilisan.......

Discussion

La procédure de CORT des cheveux décrite ci-dessus est simple à réaliser, est relativement peu coûteux, rend l'utilisation de produits chimiques facilement disponibles, des réactifs et des fournitures, et nécessite un équipement qui, à une exception près, est susceptible d'être présent dans un laboratoire d'analyse typique. L'exception est un appareil de broyage tel qu'un broyeur à billes ou d'un mini-BeadBeater. Nous notons que certains groupes de recherche mâché échantillons de cheveux en petit.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Isopropanol de qualité HPLC	Fisher	A451
Méthanol de qualité HPLC	Fisher	A452
Kits de dosage du cortisol salivaire	Salimetrics	1-3002	Voir la notice du fabricant pour plus d’informations sur la sensibilité et la spécificité du test
15 ml Tubes centrifuges en polypropylène à bouchon à vis	Max Scientific	10-9151
1,5 ml Microtubes à centrifuger Safe-Lock	Fisher	05-402-25
2,0 ml Tubes à centrifuger Safe-Lock	Fisher	05-402-7
2,0 ml Microflacons renforcés XXTuff	BioSpec	330TX	utiliser avec un mini-beadbeater
3,2 mm billes en acier chromé	BioSpec	11079132c	À utiliser avec un mini-beadbeater
10 ml Bocaux de broyage en acier inoxydable	Retsch	02.462.0061	Utilisation avec broyeur mélangeur
Billes de broyage en acier inoxydable de 12 mm	Retsch	05.368.0037	Utilisation avec broyeur
à cartouche de charbon actif Savant	Fisher	DTK120R	Utilisation avec piège chimique Savant
Rotateur pour tubes à centrifuger de 15 ml	Fisher	S02135
Rotateur pour tubes à microcentrifuger	Fisher	NC9854190
Centrifugeuse de paillasse pour tubes de microcentrifugation	Fisher	13-100-675
MM 200 broyeur	mélangeur Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16  ;	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Piège à vapeur réfrigéré	Savant Fisher	RVT400-115
Piège à produits chimiques Savant	Fisher	SCT120	Alternative au piège à vapeur réfrigéré
Lecteur
microplaques Laveur
de microplaquesMélangeur de
Pipette
Balance

À de microplaquesmulticanaux analytique