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Article de méthode

Extraction et analyse de cortisol de l'homme et de singe cheveux

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DOI :

10.3791/50882

⸱

24 janvier 2014

 ,  ,  , 
1Department of Psychology, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst

Dans cet article

Résumé

Cortisol (CORT) s'accumule dans l'arbre de la croissance des cheveux de l'homme et les primates non humains. Nous décrivons des méthodes pour extraire et analyser CORT de cheveux avec une grande précision et sensibilité. Mesure de cheveux CORT est particulièrement bien adapté pour évaluer le stress chronique sur des périodes de plusieurs semaines à plusieurs mois.

Résumé

Le cortisol, l'hormone du stress (CORT) est lentement incorporé dans la tige du cheveu de plus en plus d'êtres humains, les primates non humains et d'autres mammifères. Nous avons développé et validé une méthode pour l'extraction et l'analyse de CORT cheveux de singe rhésus et ensuite adapté cette méthode pour une utilisation avec des cheveux de cuir chevelu humain. Contrairement aux échantillons CORT "ponctuelles" obtenus à partir du plasma ou de la salive, des cheveux CORT fournit une mesure intégrée de l'activité du système hypothalamique-pituitaire-surrénale (HPA), et donc le stress physiologique, au cours de la période d'incorporation hormone. Parce que les cheveux de cuir chevelu humain croît à un taux moyen de 1 cm / mois, les niveaux CORT obtenus à partir de segments de cheveux plusieurs cm de longueur peuvent potentiellement servir de biomarqueur de stress vécu sur un certain nombre de mois.

Dans notre procédé, chaque échantillon de cheveux sont d'abord lavés deux fois dans de l'isopropanol pour éliminer tout CORT de l'extérieur de la tige du cheveu qui a été déposée à partir de la sueur ou le sébum. Après séchage, l'échantillon est broyé en une poudre fine pour briser la matrice protéique du cheveu et augmenter la surface d'extraction. CORT de l'intérieur de la tige du cheveu est extrait dans le methanol, on évapore le méthanol, et l'extrait est reconstitué dans du tampon d'essai. Extrait CORT, ainsi que des normes et des contrôles de qualité, est ensuite analysée à l'aide d'une enzyme disponible dans le commerce immunologique sensible et spécifique (EIE) du kit. Lecture de l'EIE est converti en pg CORT par mg de poids de cheveux poudrés. Cette méthode a été utilisée dans notre laboratoire pour analyser CORT de cheveux chez l'homme, plusieurs espèces de singes macaques, ouistitis, les chiens et les ours polaires. De nombreuses études à la fois de notre laboratoire et d'autres groupes de recherche ont démontré la large applicabilité de CORT de cheveux pour évaluer l'exposition au stress chronique naturel ainsi que les paramètres de laboratoire.

Introduction

Mesure de CORT dans le plasma, la salive, ou de temps en temps dans l'urine ou les matières fécales a été utilisée comme un indice de stress physiologique depuis la découverte par Selye du rôle de l'axe HPA en une contrainte. Bien que de nombreux articles ont été publiés concernant l'activité HPA à des situations stressantes aiguë, le champ a été entravée par l'absence d'un indice simple et fiable de stress physiologique chronique. Ce problème se pose parce que le plasma et la salive à la fois rendement estimations «ponctuelles» de l'activité HPA qui sont soumis à variation circadienne et peuvent être confondus par des perturbations environnementales. Échantillons urinaires et fécaux donnent des mesures de CORT et / ou élimination des métabolites qui couvrent un nombre d'heures jusqu'à une journée complète dans certains cas. Collection de multiples échantillons en utilisant l'une de ces matrices peuvent fournir un indice composite rugueux de niveaux CORT au fil du temps, cependant, aucune de ces approches fournit un indice vraiment à long terme de l'activité HPA et la réactivité de ce sysouches de stress chronique.

Mesure CORT dans les cheveux a commencé à répondre à ce besoin important dans la littérature sur le stress. Les premières études par plusieurs laboratoires ont démontré la présence de CORT dans les cheveux humains mais n'ont pas enquêté si les niveaux de CORT de cheveux ont changé en fonction de la contrainte 2. Comme notre laboratoire s'intéresse depuis de nombreuses années dans la régulation de l'axe HPA singe rhésus par divers facteurs sociaux et comportementaux 3, nous avons décidé d'établir et de valider des méthodes pour l'extraction et l'analyse des cheveux de singe rhésus 4. Basé sur le principe que CORT le sang est lente et continue incorporé dans les cheveux de plus en plus, le but de cette nouvelle méthode a été d'utiliser des niveaux de CORT de cheveux dérivé comme un indice intégrée de l'activité HPA sur des périodes de plusieurs semaines à plusieurs mois.

Plusieurs défis méthodologiques ont été rencontrées dans le développement du présent protocole. Premièrement, des études précédentes ont montré que de petites quantités of circulation CORT sont excrétés dans la sueur et le sébum et donc pouvait manteau de l'extérieur de la tige du cheveu 2. Afin d'éliminer ce facteur de confusion potentiel, nous avons développé une procédure de lavage doux qui semble enlever CORT externe tout en ayant un effet minime sur CORT présent dans l'arbre de la croissance des cheveux. Ainsi, les poils de singe soumis à cette procédure (ie deux lavages de 3 min avec de l'isopropanol) ont perdu environ 7-8% de la teneur totale en CORT-cheveux, et un troisième lavage retiré à moins de 1% de plus de stéroïdes de l'échantillon 4. Il semble y avoir plus CORT externe dans les cheveux humains, depuis la même procédure retiré une moyenne de 27% de teneur en CORT totale des échantillons (K. Rosenberg et J. Meyer, non publiées). Comme les cheveux de singe, cependant, un lavage supplémentaire contenait beaucoup moins CORT (environ 7%) que les deux premiers lavages. Par conséquent, les résultats de deux de singe et de cheveux humains soutiennent l'opinion que la plupart (sinon tous) CORT externe peut être retiré tout en conservant une fraction importantetion de CORT sein de la matrice capillaire interne. Deuxièmement, nos études pilotes ont également montré que le broyage des cheveux avant l'extraction de récupération augmenté de manière significative à partir de l'échantillon CORT, vraisemblablement ouvert en rompant la matrice protéique complexe de la tige du cheveu ainsi que l'augmentation de la surface disponible pour la pénétration du solvant. Deux méthodes de broyage différentes ont été développées, chacune ayant ses avantages et ses inconvénients. Méthode 1, qui utilise un broyeur à billes, présente l'avantage de produire de la poudre fine. Cependant, un broyeur à boulets est un article d'équipement relativement coûteux et, si elle est utilisée avec des pots et des billes de broyage classiques, on est capable de broyage seulement deux échantillons à la fois. De petits échantillons sont également difficiles à traiter à l'aide d'un broyeur à boulets avec des bols de broyage classiques. Méthode 2, qui utilise un BeadBeater, est moins efficace dans sa capacité de meulage. Par conséquent, la récupération de CORT moyenne est d'environ 10% inférieure à l'aide de cette méthode par rapport au broyeur à boulets (données non publiées). D'autre part, un BeadBeaterest beaucoup moins cher qu'un broyeur à billes, 16 à 24 échantillons peuvent être broyés à la fois en fonction du modèle, et le procédé est bien adapté pour de petits échantillons. En raison de la récupération de différentiel mentionné ci-dessus, il est conseillé d'utiliser la même méthode de meulage pour tous les échantillons dans une étude particulière.

Une fois que les échantillons de cheveux ont été traités, ils sont extraits avec du methanol et CORT dans les extraits est analysée au moyen d'un kit EIA du commerce sensible et spécifique à l'origine conçu pour mesurer CORT salivaire. Les procédures d'extraction et d'analyse ont été validées en partie en démontrant que des dilutions en série d'extraits des échantillons de cheveux de singe ont donné des lectures de l'EIE qui ressemblent beaucoup aux lectures obtenues à partir des normes de CORT authentiques. Nous avons ensuite montré que CORT de cheveux (en plus de plasma et la salive CORT) était sensible à la majeure stress de la vie d'une réinstallation mandat administratif des singes à de nouveaux quartiers d'habitation 4,5. La présentationt document fournit un compte rendu détaillé des méthodes utilisées en routine dans notre laboratoire à traiter des échantillons de cheveux humains et de singe et d'extraire et d'analyser CORT de ces échantillons.

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Protocole

Une. Collecte et stockage des échantillons

  1. Cheveux humains
    1. Fixer la totalité de la longueur de la chevelure à échantillonner (jusqu'à un crayon-largeur de diamètre) avec une bande de caoutchouc ou de ce plan. Coupe de cheveux au plus près du cuir chevelu que possible (en prenant soin de ne pas entailler la peau) avec une paire de ciseaux propres. Remarque: La zone d'échantillonnage standard est le sommet postérieure du crâne.
    2. Certains chercheurs ont signalé une baisse des niveaux de CORT de cheveux humains avec la distance du cuir chevelu 6, qui peut être dû au lavage d'une exposition répétée à l'eau et du shampoing 7 (bien voir Manenschijn et al. 8 et Thomson et al. 9 pour des résultats contraires à qui ne baisse segmentaire a été observée) Pour minimiser l'impact de ce potentiel "effet de lavage", nous vous recommandons de collecte des segments de cheveux proximale sur le cuir chevelu avec une longueur maximale de 3 cm (en supposant un taux de croissance moyen de 1 cm / mois 10, un 3 cm segment contient CTRO qui a été déposée sur environ les 3 derniers mois). Pour ce faire, utilisez une règle pour mesurer 3 cm de la première coupe et couper de nouveau pour obtenir l'échantillon de 3 cm. Remarque: Une fois que les cheveux ont été coupés à la longueur, il n'est plus nécessaire de maintenir les brins dans l'alignement à moins que l'étude consiste à couper l'échantillon de 1 cm de longs segments distincts d'établir un calendrier rétrospectif de dépôt CORT cours de la période de temps avant l'échantillonnage 6.
    3. Placer l'échantillon de cheveux dans une pochette faite d'une feuille d'aluminium, une enveloppe de papier propre, ou un bouchon à vis en polypropylène tube à centrifuger de 15 ml du type utilisé pour l'échantillon de lavage. Comme CORT est extrêmement stable dans les cheveux 2, les échantillons peuvent être conservés indéfiniment à -20 ° C et, si nécessaire, livré nuit à température ambiante.
    4. La procédure de collecte de cheveux doit être pratiquée sur les bénévoles et les exemples de bonnes pratiques doivent être pesés avant d'entreprendre une étude complète. Remarque: les échantillons de cheveux que small comme 5-10 mg peuvent être analysées en utilisant les méthodes décrites ici, mais il est souhaitable de recueillir des échantillons> 10 mg pour minimiser la probabilité d'obtenir des lectures EIE en dessous de la norme de CORT plus bas.
  2. poils de singe
    1. Raser les poils (100-250 mg) de la nuque à l'aide d'une tondeuse animal standard. Raser au plus près de la peau que possible, en faisant attention à ne pas entailler la peau et provoquer des saignements parce que les niveaux de CORT de sang sont très élevés par rapport à ceux trouvés dans les cheveux. Remarque: La région du cou a été choisi pour l'échantillonnage de routine, car il est généralement une bonne source de cheveux et peut être facilement observée pour la repousse des cheveux avant rééchantillonnage.
    2. Placer l'échantillon de cheveux dans une pochette faite d'une feuille d'aluminium ou d'un bouchon à vis en polypropylène tube à centrifuger de 15 ml. des échantillons de cheveux de singe doivent être stockés et transportés dans la même manière que celle décrite ci-dessus pour les échantillons de cheveux humains.
    3. Parce que les cheveux de singe, la différence des cheveux de cuir chevelu humain, pousse à une certaine longueur, puis stops croissance 11, il n'est généralement pas possible dans ce cas d'utiliser la distance de la peau comme un calendrier pour le dépôt CORT. Toutefois, si un animal peut être échantillonné plus d'une fois (par exemple, lors d'examens de santé de routine périodiques), il est souhaitable d'effectuer un rasage initiale pour définir un point de temps de référence, puis reshave la même zone après la période de temps désirée est écoulé. CORT dans le second échantillon a été déposé au cours de l'intervalle de rasage-reshave, ce qui permet une attribution précise de la teneur en CORT de l'échantillon à l'activité HPA-dessus de cet intervalle 5.

2. Lavage et séchage de l'échantillon

  1. Laver
    1. Placer chaque échantillon de cheveux en un bouchon à vis en polypropylène tube à centrifuger de 15 ml.
    2. Ajouter 5 ml de chromatographie en phase liquide à haute performance de l'isopropanol (HPLC) de qualité pour chaque tube suivie d'une inversion répétée pendant 3 min en utilisant un dispositif de rotation.
    3. Décanter le isopropanol dans un conteneur à déchets, en tenant cne sont pas à perdre de l'échantillon.
    4. Répétez les étapes 2.1.2 et 2.1.3 une fois de plus.
  2. Séchage
    1. Sécher les cheveux pendant au moins 2-3 jours pour assurer une évaporation complète de l'isopropanol.

3. Rectification de l'échantillon et CORT Extraction - Méthode 1 pour de grands échantillons

  1. broyage de l'échantillon
    1. Placer un maximum de 250 mg de cheveux séchés dans un 10 ml en acier inoxydable pot de broyage avec une seule bille de broyage en acier inoxydable de 12 mm.
    2. Broyer l'échantillon pendant 6 minutes à une vitesse de 25 Hz en utilisant un broyeur à billes.
    3. Peser jusqu'à 50 mg de poudre de cheveux sur une balance analytique et puis le transférer à un polypropylène microtube propre 2,0 ml pour l'extraction de CORT ultérieure.
  2. Extraction CORT
    1. Ajouter 1,0 ml de méthanol de qualité HPLC pour le tube à centrifuger contenant l'échantillon en poudre.
    2. Boucher le tube et incuber l'échantillon pendant 18 à 24 h à la température ambiante avec des coInstant inversion en utilisant un dispositif de rotation.
    3. Centrifuger les tubes à 14 000 rpm pendant 1 min à la température ambiante pour obtenir un culot des cheveux en poudre.
    4. Transférer 0,6 ml du surnageant dans un tube de 1,5 ml microtubes propres, en prenant soin de ne pas perturber le culot de cheveux poudrés.

4. Rectification de l'échantillon et CORT Extraction - Méthode 2 pour de petits échantillons

  1. broyage de l'échantillon
    1. Placez un maximum de 60 mg de cheveux en 2 ml microtube prépesé renforcé pour perle battre.
    2. Peser à nouveau le flacon pour obtenir le poids de l'échantillon.
    3. Ajouter trois billes d'acier de chrome de 3,2 mm à chaque flacon, puis broyer l'échantillon pendant au moins 2 min dans une pile de billes. Si l'inspection visuelle révèle que l'échantillon n'est pas suffisamment pulvérisé, puis effectuer un broyage supplémentaire pour 0,5 ou 1 min. Note: Pas de transfert de la chevelure de sol est nécessaire dans ce cas parce que l'extraction CORT est réalisée dans le même flacon que le broyage.
  2. Extraction CORT
    1. Ajouter 1,5 ml de methanol de qualité HPLC pour le microtube contenant l'échantillon de poudre.
    2. Boucher le tube et incuber l'échantillon pendant 18 à 24 h à la température ambiante avec inversion constante en utilisant un dispositif de rotation.
    3. Centrifuger les tubes à 10 000 rpm pendant 5 min à température ambiante pour obtenir un culot des cheveux en poudre. Remarque: Les billes d'acier au chrome restent dans le tube avec les cheveux au cours des étapes d'extraction et de centrifugation, qui représente la vitesse de centrifugation plus faible par rapport à la méthode 1.
    4. Transférer 1,0 ml du surnageant dans un tube de 1,5 ml microtubes propres, en prenant soin de ne pas perturber le culot de cheveux poudrés.

5. L'évaporation de solvants et de reconstitution échantillon

  1. Sécher le bas le methanol ou l'autre à l'aide d'un évaporateur sous vide ou d'un courant d'azote gazeux si un évaporateur sous vide n'est pas disponible. Si un évaporateur à vide est utilisé, la vapeur de méthanol peut être piégé au moyend'un piège froid ou un piège chimique équipé d'une cartouche de charbon actif.
  2. Après élimination du méthanol, de l'extrait de reconstituer CORT dans un volume approprié de tampon de dosage EIA (dosage de diluant). Si des valeurs relativement élevées de CORT sont prévus, puis d'utiliser un volume tampon de 0,4 ml ou plus. Si des valeurs relativement faibles sont prévues, le volume peut être réduit à 0,2 ml ou moins pour augmenter la sensibilité. Note: 0,2 ml le volume est suffisant pour exécuter aliquotes en double de l'échantillon au moins deux fois dans le cas d'une reprise de l'échantillon est nécessaire.
  3. Soit doser l'échantillon reconstitué immédiatement ou congeler à -20 ° C pour analyse ultérieure. Remarque: Si l'échantillon reconstitué est congelé, il est important d'éviter la sublimation au cours de la période de gel depuis un changement dans le volume de l'échantillon conduit à une valeur de CORT faux quand les derniers calculs sont effectués.

6. CORT test et de conversion de données

  1. Doser les extraits de cheveux pourCORT l'aide d'un dosage immuno-enzymatique à haute sensibilité (EIE) du kit. Remarque: Si vous utilisez un kit salivaire commerciale CORT EIE, suivre les recommandations du fabricant, comme indiqué dans le kit insert sauf que les échantillons de test seront aliquotes en double de chaque extrait de cheveux reconstitué au lieu d'échantillons de salive.
  2. Préparer un contrôle de qualité (QC) extrait de cheveux pour une utilisation dans chaque dosage.
    1. Prélever un nombre d'échantillons de cheveux supplémentaires et soit de les traiter individuellement comme dans les étapes 4.1 et 4.2 ou en commun leur grande pour le traitement de l'échantillon comme dans les étapes 3.1 et 3.2.
    2. Évaporer le solvant et reconstituer les extraits que dans les étapes 5.1 et 5.2, puis regrouper les extraits reconstitués à partir de plusieurs échantillons individuels ou groupés.
    3. Aliquoter un volume approprié de l'extrait reconstitué commun (par exemple 0,10 ml) dans des microtubes individuels et congeler pour une utilisation ultérieure.
    4. Décongeler et exécuter un QC aliquote en double sur chaque d'immunoessais en microplaques de fournir un référence valeur CORT pour vérifier la qualité de chaque course.
    5. Un coefficient intra-essai de variation (CV; définie comme l'écart type divisé par la moyenne d'un ensemble de valeurs d'échantillons) peut être calculée par l'analyse de 10 à 12 QC puits dans la même course, alors qu'un CV inter-essai peut être calculé en utilisant les valeurs de CQ à travers un groupe de pistes. Si son logiciel de lecteur de microplaques calcule un CV pour les puits en double représentant chaque extrait de cheveux, puis une autre méthode pour déterminer intra-essai CV consiste à calculer la moyenne de ces valeurs de CV individuels à travers toute la plaque.
    6. Si l'extrait de l'échantillon donne une lecture supérieure à la norme de CORT plus élevé dans l'EIE, puis une autre aliquote de l'extrait est dilué avec une quantité appropriée de tampon de dosage et la lecture ultérieure EIE est corrigé pour le facteur de dilution. Des échantillons sont également régulièrement analysés de nouveau si le CV pour les deux puits est> 10%.
    7. Parce kits CORT EIE sont conçus pour mesurer CORT values dans des échantillons liquides, tels que de la salive ou du plasma, le signal de sortie du logiciel de lecteur de microplaque doit être convertie en quantité d'CORT par unité de poids de poudre de cheveux. La formule suivante convertit la sortie de dosage en mg / dl à pg CORT par les cheveux mg:
      (A / B) * (C / D) * E * 10000 = F
      où A = ug / dl à partir de la sortie de test, B = poids (en mg) de cheveux soumis à une extraction, C = vol. (En ml) de methanol ajoutés à la poudre pour cheveux, D = vol. (En ml) de méthanol récupéré à partir de l'extrait et on sèche ensuite vers le bas, E = vol. (En ml) de tampon d'essai utilisée pour reconstituer l'extrait séché, et F = valeur finale de la concentration de CORT de cheveux en pg / mg.

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Résultats

La figure 1 montre l'impression d'un ensemble représentatif d'échantillons de cheveux humains (mâles adultes et des sujets humains de sexe féminin) traitées selon la méthode 2 broyage et d'extraction. Logiciels On a utilisé pour générer la sortie de données et pour adapter une courbe sigmoïde à 4 paramètres aux normes CORT (Figure 2). Les CV entre-bien de cette plaque variaient de 0,01 à 5,73% avec un CV moyen de 1,34% intra-essai. Le CV inter-essai déterminé en utilisan...

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Discussion

La procédure de CORT des cheveux décrite ci-dessus est simple à réaliser, est relativement peu coûteux, rend l'utilisation de produits chimiques facilement disponibles, des réactifs et des fournitures, et nécessite un équipement qui, à une exception près, est susceptible d'être présent dans un laboratoire d'analyse typique. L'exception est un appareil de broyage tel qu'un broyeur à billes ou d'un mini-BeadBeater. Nous notons que certains groupes de recherche mâché échantillons de cheveux en petit...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt à déclarer.

Remerciements

Nous remercions Kymberlee O'Brien, Celia Moore, et Edward Tronick (Département de psychologie, Université du Massachusetts, Boston) pour fournir des échantillons de cheveux humains analysés dans cette étude, et Stephen Suomi et Amanda Dettmer (Laboratoire d'éthologie comparée, NICHD) pour fournir des échantillons de cheveux de singe rhésus. Le développement initial et l'utilisation continue de cette méthode a été soutenu par le NIH RR11122 à MAN

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Isopropanol de qualité HPLCFisherA451
Méthanol de qualité HPLCFisherA452
Kits de dosage du cortisol salivaireSalimetrics1-3002Voir la notice du fabricant pour plus d’informations sur la sensibilité et la spécificité du test
15 ml Tubes centrifuges en polypropylène à bouchon à visMax Scientific10-9151
1,5 ml Microtubes à centrifuger Safe-LockFisher05-402-25
2,0 ml Tubes à centrifuger Safe-LockFisher05-402-7
2,0 ml Microflacons renforcés XXTuffBioSpec330TXutiliser avec un mini-beadbeater
3,2 mm billes en acier chroméBioSpec11079132cÀ utiliser avec un mini-beadbeater
10 ml Bocaux de broyage en acier inoxydableRetsch02.462.0061Utilisation avec broyeur mélangeur
Billes de broyage en acier inoxydable de 12 mmRetsch05.368.0037Utilisation avec broyeur
à cartouche de charbon actif SavantFisherDTK120RUtilisation avec piège chimique Savant
Rotateur pour tubes à centrifuger de 15 mlFisherS02135
Rotateur pour tubes à microcentrifugerFisherNC9854190
Centrifugeuse de paillasse pour tubes de microcentrifugationFisher13-100-675
MM 200 broyeurmélangeur Retsch20.746.0001
Mini-Beadbeater 16  ;BioSpec607
Savant DNA SpeedvacFisherDNA120-115
Piège à vapeur réfrigéréSavant FisherRVT400-115
Piège à produits chimiques SavantFisherSCT120Alternative au piège à vapeur réfrigéré
Lecteur
microplaques Laveur
de microplaquesMélangeur de
Pipette
Balance
À de microplaquesmulticanaux analytique

Références

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