Deux photons Imaging calcium dans la souris Naviguer une réalité environnement virtuel

Résumé

Nous décrivons ici les procédures expérimentales impliquées dans l'imagerie à deux photons de cortex de la souris pendant le comportement dans un environnement de réalité virtuelle.

Résumé

Au cours des dernières années, l'imagerie à deux photons est devenu un outil précieux dans les neurosciences, car il permet de mesurer chronique de l'activité des cellules génétiquement identifiés lors de comportements ^1-6. Nous décrivons ici les méthodes d'effectuer une imagerie à deux photons dans le cortex de la souris alors que l'animal navigue un environnement de réalité virtuelle. Nous nous concentrons sur les aspects des procédures expérimentales qui sont essentiels à l'imagerie chez un animal se comporter dans un environnement virtuel bien éclairée. Les principaux problèmes qui se posent dans ce dispositif expérimental que nous sommes ici adresse: minimiser les mouvements des artefacts liés au cerveau, en minimisant les fuites de lumière à partir du système de projection de la réalité virtuelle, et en minimisant induite par laser des lésions tissulaires. Nous fournissons également des logiciels de l'échantillon à contrôler l'environnement de réalité virtuelle et de faire le suivi des élèves. Avec ces procédures et les ressources, il devrait être possible de convertir un microscope à deux photons pour une utilisation conventionnelle en se comportant souris.

Introduction

Imagerie à deux photons des indicateurs de calcium (codés génétiquement comme GCaMP5 ⁷ ou R-GECO ^8, ou des colorants synthétiques comme OGB ou Fluo4) a émergé comme une puissante méthode de mesure de l'activité neuronale en comporter souris ^1-6. Il permet la mesure simultanée de l'activité de plusieurs centaines de cellules à l'action quasi-unique résolution potentielle, jusqu'à environ 800 um en dessous de la surface du cerveau ^9,10. En outre, en utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECIS) l'activité neuronale peut être mesurée de façon chronique ^5,11,12, et dans des types cellulaires génétiquement déterminées ^13. Ensemble, ces méthodes fournissent un degré de résolution temporelle et spatiale qui ouvrent une multitude de nouvelles possibilités dans l'étude de calcul neuronal in vivo.

Une intervention chirurgicale est nécessaire d'exposer et étiqueter le cerveau de la souris pour l'imagerie. Les cellules sont transfectées en utilisant typiquement un vir adéno-associé recombinant nous système (AAV) pour la livraison GECI et une fenêtre crânienne est implanté sur le site d'injection pour obtenir un accès optique au cerveau. Une barre de tête est ensuite fixé sur le crâne pour la tête de fixation sous le microscope à deux photons. La conception et la mise en œuvre de ces étapes est essentiel car la plupart des problèmes de l'imagerie éveillé découlent de l'instabilité dans la préparation. Idéalement, le procédé décrit ici devrait permettre l'imagerie chronique pouvant aller jusqu'à plusieurs mois après la chirurgie.

Pour activer le comportement guidé visuellement lors de l'imagerie à deux photons, la tête la souris fixe se trouve sur un tapis roulant sphérique de l'air pris en charge, qu'il peut utiliser pour naviguer dans un environnement de réalité virtuelle. Locomotion de la souris sur le tapis roulant est couplé au mouvement dans l'environnement virtuel qui s'affiche sur un écran toroïdal entourant le ^14,15 de la souris. Variables comportementales telles que la locomotion, stimulus visuel, et la position de la pupille peuvent être enregistrées ^6.

t "> Nous décrivons les procédures impliquées dans chronique imagerie à deux photons dans les souris d'explorer un environnement de réalité virtuelle Les principaux points abordés sont:. réduction des artefacts de mouvement, la réduction des fuites de lumière, la maximisation du nombre de cellules enregistrées simultanément, et la minimisation des dommages photo. Nous fournissons également des détails sur la mise en place du tapis de course gonflable, le suivi des élèves, et l'environnement de réalité virtuelle. Les procédures décrites ici peuvent être utilisés pour l'imagerie des populations de cellules marquées par fluorescence dans des souris fixes de la tête dans une potentiellement grande variété de paradigmes comportementaux .

Protocole

Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés et mis en œuvre conformément aux lignes directrices du département vétérinaire du canton de Bâle-Ville.

Une. Matériel et logiciel Setup

1. Deux photons configuration balayage du microscope:
   1. Utiliser un laser infrarouge à impulsions comme source d'éclairage (de largeur d'impulsion <120 fs).
   2. Utilisez une tête de balayage composé d'un scanner de résonance 8 ou 12 kHz et un niveau galvanomètre. Remarque: Cela permet des taux de 40 ou 60 Hz cadre à 750 x 400 pixels. Un taux de rafraîchissement élevé est essentiel pour minimiser cerveau mouvement induit de distorsion de l'image. En outre, les résultats d'analyse rapide de résonance dans un rendement de signal plus élevé et réduit photoblanchiment ¹⁶ et la phototoxicité.
   3. Utilisez une vitesse élevée z-stepper piézo-électrique de façon séquentielle des images entrelacées de temps à acquérir des profondeurs multiples. Remarque: Cette option est facultative et utilisée pour augmenter le rendement de données au détriment de la vitesse de défilement.
   4. Utilisez hoccultation écanique pour réduire l'exposition au laser pour le tissu. Ajuster la largeur de l'occultation selon l'amplitude du scanner résonant. Remarque: En raison de la nature sinusoïdale du trajet de balayage d'un scanner résonant, le faisceau laser se déplace lentement comparativement aux points de retournement de balayage. Pour éviter d'endommager des tissus à ces points d'exécution lorsque l'exposition au laser est plus grand, une occultation mécanique est introduit dans le plan focal entre l'analyse et les verres de tubes qui arrête le faisceau laser.
   5. Pour l'acquisition de données en utilisant un numériseur haute vitesse (800 MHz) en combinaison avec un gate array (field-programmable FPGA). Remarque: Les filtres passe-haut et FPGA bacs le signal de PMT en pixels. La combinaison du filtre passe-haut sur le FPGA et le filtre efficace passe-bas sur le résultat de l'amplificateur de PMT dans un filtre passe-bande centré approximativement autour de la vitesse du laser (80 MHz) de répétition. Exemple de code FPGA est fourni en supplément.
2. Installation du tapis de course gonflable sur la base de la conception de Dombeck et collègues ²
   1. Connecter le support de boule à une conduite d'alimentation en air au moyen d'un tube d'alimentation en air d'au moins 10 mm de diamètre intérieur. Maximiser la section transversale de l'entrée d'alimentation en air de support de balle et la placer quantité suffisante de tuyau entre l'arrivée d'air principal et le porte-ballon. Remarque: section transversale accrue et la longueur accrue de la tubulure d'amenée d'air permet de réduire la génération de bruit.
   2. Placez une balle en mousse de polystyrène (20 cm de diamètre) dans un porte-balle et imprimé en 3D conçu sur mesure.
   3. Si le paradigme de comportement ne nécessite avant (et arrière) locomotion, limiter le mouvement de la balle à l'(pitch) axe horizontal par l'insertion d'une broche (par exemple un G de l'aiguille 19 hypodermique) sur le côté de la balle Note:. Généralement les animaux s'adaptent à l'installation beaucoup plus rapide dans ce paradigme de rotation réduite.
   4. mouvement de la piste de la balle à l'aide d'un ou deux souris d'ordinateur optiquepour détecter le mouvement autour de deux ou trois axes, respectivement. Remarque: Les souris d'ordinateur devraient idéalement fonctionner avec une diode infrarouge pour moins d'interférence avec l'imagerie.
3. Configuration de l'environnement de réalité virtuelle
   1. Préparer l'environnement de réalité virtuelle. Remarque: Un environnement de l'échantillon sur la base Panda3D, un moteur de jeu disponible gratuitement, est fourni en supplément. Les objets de l'environnement virtuel sont générées en utilisant Wings3D, un modeleur 3D open source. L'exemple de programme lit les informations de position sur une carte d'acquisition de données et le traduit en un mouvement dans l'environnement virtuel. Le code exécute également la transformation non-linéaire pour l'environnement nécessaire pour être projetée sur un écran toroïdal. La construction détaillée de l'écran toroïdal a été décrite ailleurs ^14,17.
   2. Utilisez projecteurs à LED ou écrans d'ordinateur LED rétro-éclairé pour afficher l'environnement virtuel. Intégrer un cir de déclenchementCuit de scintillement rapide des DEL lors de l'imagerie. Remarque: Un problème inhérent à l'imagerie à deux photons pendant la stimulation visuelle est la lumière de fuite provenant du système de stimulation visuelle, qui peut être réduit en protégeant l'objectif. Cependant, la lumière de fuite du système de stimulation visuelle peut être entièrement supprimée par la synchronisation de la sortie de lumière du projecteur sur les points du scanner à résonance (lorsque les données ne sont pas acquis) d'exécution, comme on le fait avec les arènes de LED utilisées pour la stimulation visuelle lors de l'imagerie dans Drosophila ^18. Cela se traduit par une alternance haute vitesse effective de stimulation visuelle et d'acquisition de données (voir la figure 2). La fréquence de clignotement (24 kHz) est de plusieurs ordres de grandeur au-dessus du seuil critique de fusion, au-dessus duquel le scintillement n'est plus perçu par l'animal. Le schéma du circuit électronique de cette modification à un projecteur LED du commerce est représenté sur la figure 3.
4. Chiotsuivi il
   1. Utilisation d'une caméra vidéo sur la base de CMOS (30 fps) pour le suivi de position de la pupille. Assurez-vous que l'appareil photo ne contient pas de filtre de blocage infrarouge. Remarque: L'élève est visible à contraste élevé lors des enregistrements en raison de la lumière parasite de deux photons laser d'excitation sortant par l'œil. position de la pupille et le diamètre est extrait en temps réel en utilisant un logiciel programmé sur mesure basé sur la conception de Sakatani et Isa ^19.

2. Injection de l'indicateur de calcium génétique et la fenêtre de l'implant

L'injection d'un indicateur de calcium ²⁰ et l'implantation de la fenêtre crânienne ²¹ sont réalisées comme décrit précédemment avec les ajouts suivants:

1. Injecter du virus dans la région d'intérêt en utilisant une pipette d'injection de verre remblayée avec une solution de virus, et relié à un système d'injection sous pression. Régler la pression en fonction de la pipette du centre-diamètre, typiquement environ. 70 à 140 mbar, pour injecter environ 100 nl d'une solution de virus, au cours de 1-2 min. Faible volume impulsions d'injection livrés à basse fréquence (0,05 impulsions sec à 2 Hz) doivent être utilisées pour éviter le débordement du virus le long de la pipette lors de l'injection. Remarque: Afin de contrôler le volume d'injection, la pipette peut être marqué à petit , longueurs espacés (par exemple 0,5 mm) sous un microscope stéréo. Le déplacement du ménisque entre les marquages ​​peut ensuite être utilisée pour estimer le volume injecté.
2. Plusieurs semaines post injection cela devrait aboutir à un bolus de cellules densément marqués avec un diamètre d'environ 500 um. L'efficacité d'expression GECI dans la région d'intérêt dépend du choix de GECI et la combinaison du promoteur, ainsi que le titre infectieux et le sérotype de l'AAV recombinant utilisé. Remarque: Comme exemple représentatif, avec injection de AAV2/1-EF1α-GCaMP5 un tit viraleer de 8 x 10 ¹² GC / ml dans le cortex visuel primaire d'un résultat de la souris dans l'expression satisfaisante à environ deux semaines après l'injection (figure 1).
3. Le bar de la tête ne doit pas obstruer le champ visuel de la souris, mais doit être suffisamment rigide pour permettre l'imagerie stable pendant comportement. Cela nécessite généralement deux points de fixation de chaque côté de la barre de la tête (voir la figure 1). Pour fixer fermement la barre de la tête sur le crâne, veillez à optimiser et sécher la zone du crâne exposé où la barre de la tête sera fixée. En outre, à l'aide d'un scalpel ou d'une seringue, gratter le crâne pour créer des rainures superficielles augmentant ainsi l'aire de surface pour le collage. Couvrir l'os avec de la colle cyanoacrylate tissu avant de fixer la barre de la tête avec du ciment dentaire.

3. Procédure expérimentale

1. Deux à trois semaines après l'injection de virus, vérifiez la fenêtre implant crânien pour plus de clarté et d'expression sous epifluorescence éclairage. Limites clairement visibles et bien définies de vaisseaux sanguins superficiels sont une bonne indication que l'implant de fenêtre est adapté pour l'imagerie (voir la figure 1).
2. Mesurer et régler la puissance du laser à une valeur inférieure à 50 mW à l'échantillon.
3. Allumez le flux d'air sur le tapis roulant sphérique.
4. Pour la tête de fixation sous le microscope, anesthésier brièvement l'animal avec de l'isoflurane à réduire le stress. Placez l'animal dans un récipient de l'isoflurane et attendre les arrêts d'animaux en mouvement (environ 10 secondes). Retirer l'animal et immédiatement la tête fixer sous le microscope.
5. Positionner le système d'affichage visuel le plus près possible de l'animal afin de permettre l'accès au reste de l'animal. Le contact visuel moins l'animal a avec l'expérimentateur, le moins stressé l'animal sera au cours de la phase initiale de l'expérience.
6. Assurez-vous que la fenêtre implant crânien est exempt de poussière et de la saleté. Nettoyer à l'eausi nécessaire.
7. Appliquer le gel échographique claire milieu d'immersion entre la fenêtre crânienne et objectif immersion dans l'eau. Cela résout les problèmes de lenteur dégradation de l'image due à l'évaporation de l'eau ou des fuites et réduit le besoin de monter un cône sur la barre de la tête pour retenir l'eau. Remarque: Centrifugeuse le gel avant utilisation pour enlever toutes les bulles d'air, et de prendre soin de ne pas créer d'air des bulles lors de l'application du gel. Des bulles d'air peuvent gravement nuire à la qualité de l'image.
8. Enrouler un morceau de ruban adhésif noir autour de la barre objectif et la tête pour protection contre la lumière.
9. Déplacez le domaine de l'environnement virtuel à sa position finale et ajuster la caméra vidéo pour le suivi des élèves.
10. Régler le système d'occultation laser pour correspondre à l'amplitude de balayage utilisé lors de l'expérience.
11. Commencer l'enregistrement des données.

Résultats

La qualité de l'image en deux photons imagerie calcique de populations de cellules marquées avec un GECI dépend largement de la qualité de la fenêtre implant crânien. Deux semaines après l'injection du virus de la fenêtre crânienne doivent être inspectés pour plus de clarté. Il devrait y avoir aucun tissu de granulation ou de la repousse osseuse visible (Figure 1A). En outre, le motif de vaisseaux sanguins superficiels devrait rester inchangé et les limites du système vasculaire doit être nettement défi...

Discussion

La clé du succès de comportement imagerie à deux photons est la stabilité de la préparation de deux façons:

1. Au cours de la fenêtre de jours après l'implantation, les réponses inflammatoires du tissu peut conduire à l'amélioration de la formation du tissu de granulation et du cartilage qui va gêner ou même empêcher l'imagerie.
2. Pendant l'expérience, le cerveau doit être suffisamment stable pour éviter les artefacts de mouvement de corrompre neuronal signal de fluorescence de l'ac...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lamelles de recouvrement (diamètre = 3-5 mm)	Implant de fenêtre	de Menzel
InSight DeepSee laser Microscope	Spectra-Physics		Scanner
12 kHz Scanner de résonance	Cambridge Technology	G1-003-30026
Microscope Galvomètre	Cambridge Technology	G6215H
Microscope Numériseur	National Instruments	NI 5772	microscope
FPGA	Microscope National Instruments	PXIe 7965R
Carte d’acquisition	Microscope National Instruments	PCIe 6363
Filtre d’émission 525/50	Microscope Semrock	FF03-525/50-25
Capteur piézo-électrique z-drive	Physikinstrumente	P-726.1CD
Contrôleur de microscope pour microscope piézo-électrique entraînement	Microscope Physikinstrumente	E665 LVPZT
Objectif 16X, 0.8NA	Microscope Nikon	CFI75
Amplificateur de courant	Microscope Femto	DHPCA-100
Tube photomultiplicateur	Microscope	Hamamatsu
Caméra USB sans filtre IR	ImageSuivi
de la source DMK22BUC03 de la pupilleObjectif 50 mm	ImagingSource	M5018-MP	Suivi de la pupille
Bagues d’adaptation macro	ImagingSource	LAexSet	Suivi de la pupille
Souris d’ordinateur optique	Logitech	G500	Suivi de mouvement
Boule en polystyrène 20 cm	, par ex. idee-shop.de	08797.00.15	environnement
virtuel Projecteur LED	Samsung	SP-F10M	virtual environnement
Carte d’acquisition	National Instruments	Environnement virtuel NI 6009
Moteur		www.panda3d.org	environnement virtuel
Bibliothèque Numpy pour Python		www.scipy.org	environnement virtuel
Scipy bibliothèque pour Python		www.scipy.org	environnement virtuel
NI-DAQmx driver	National Instruments	www.ni.com	environnement virtuel
Gel d’échographie	Dahlhausen	5701.0342.10	imagerie