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Article de méthode

Concevoir protéines de soie soie Matériaux alliage pour applications biomédicales

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DOI :

10.3791/50891

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13 août 2014

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1Department of Physics and Astronomy, Rowan University, 2Department of Biomedical and Translational Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Sciences, Cooper Medical School of Rowan University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Rowan University

Dans cet article

Résumé

Le mélange est une approche efficace pour générer des biomatériaux avec un large éventail de propriétés et caractéristiques combinées. En prévision des interactions moléculaires entre les différentes protéines de soie naturelle, de nouvelles plates-formes en alliage de protéines de soie de soie avec la résilience accordable mécanique, réponse électrique, transparence optique, au traitement chimique, la biodégradabilité, ou la stabilité thermique peuvent être conçus.

Résumé

Les protéines fibreuses afficher différentes séquences et des structures qui ont été utilisés pour diverses applications dans le domaine biomédical, tels que les biocapteurs, la nanomédecine, la régénération des tissus, et la délivrance de médicaments. Matériaux sur la base des interactions à l'échelle moléculaire entre ces protéines Conception permettra de générer de nouveaux biomatériaux multifonctionnel en alliage de protéines avec des propriétés accordables. De tels systèmes de matériaux d'alliage offrent également des avantages par rapport aux polymères synthétiques traditionnelles en raison de la biodégradabilité des matériaux, de biocompatibilité, et sa tenue dans le corps. Cet article a utilisé les mélanges de protéines de soie sauvage de tussah (Antheraea de pernyi) et domestique mûrier soie (Bombyx mori), par exemple, de fournir des protocoles utiles sur ces sujets, y compris la façon de prédire les interactions protéine-protéine par des méthodes de calcul, la façon de produire un alliage de protéines solutions, comment vérifier les systèmes d'alliage par analyse thermique, et la façon de fabriquer des matériaux d'alliage variablesy compris les matériaux optiques à réseaux de diffraction, des matériaux à des circuits électriques, des revêtements et des matériaux pharmaceutiques pour la libération du médicament et de la livraison. Ces méthodes peuvent fournir des informations importantes pour la conception des biomatériaux multifonctions de nouvelle génération basé sur différents alliages de protéines.

Introduction

La nature a créé des stratégies pour générer des matrices biologiques accordables et multifonctions utilisant un nombre limité de protéines structurales. Par exemple, élastines et les collagènes sont toujours utilisés ensemble in vivo pour fournir les forces réglables et fonctions requises pour les tissus spécifiques 1,2. La clé de cette stratégie est le mélange. Mélange consiste à mélanger des protéines ayant des rapports spécifiques et une approche technologique pour produire des systèmes de matériaux simples avec accordable et propriétés variées 3-5. En comparaison avec les stratégies d'ingénierie de synthèse 6,7, le mélange peut également améliorer l'uniformité de la matière et la capacité de traiter la matière en raison de la facilité d'utilisation 8-16. Par conséquent, la conception de matériaux multifonctionnels, biocompatibles alliage de protéine est un domaine émergent de la recherche médicale. Cette technologie fournira également la connaissance systématique de l'impact des matrices de protéines naturelles sur les fonctions cellulaires et tissulaires, tant en vitro et in vivo 10,17. En optimisant les interfaces moléculaires entre les protéines différentes, les alliages à base de protéines peuvent englober une gamme de fonctions physiques, telles que la stabilité thermique à des températures différentes, l'élasticité de soutenir divers tissus, la sensibilité électrique dans les organes variables, et les propriétés optiques de la cornée la régénération des tissus 3, 18-27. Le résultat de ces études fournira une nouvelle plate-forme de protéines-matériaux dans le domaine des sciences biomédicales en rapport direct avec la réparation des tissus accordables et le traitement des maladies et d'autres conduisent à des dispositifs d'implants biodégradables où leurs caractéristiques thérapeutiques et diagnostiques nouvelles peuvent être envisagées 3.

Beaucoup de protéines structurales naturelles ont des propriétés physiques et bioactifs critiques qui peuvent être exploités comme des candidats pour les matrices de biomatériaux. Soies de différentes espèces de vers, les kératines de poils et laines, élastines et les collagènes de différents tissus, etdiverses protéines végétales sont quelques-unes des protéines structurales les plus couramment utilisés pour la conception de matériaux à base de protéines variables (Figure 1) 18-27. En général, ces protéines peuvent former des structures moléculaires secondaires (par exemple, des feuillets bêta, ou de soies bobines enroulées pour les kératines) en raison de leurs répétitives des séquences d'acides aminés primaires uniques 3,28-35. Ces caractéristiques favorisent la formation de structures macroscopiques auto-assemblés avec des fonctions uniques à des interfaces biologiques incitant leur utilité en tant que ressource précieuse de matières de biopolymère. Ici, deux types de protéines structurales ont été utilisés (protéine A de soie tussah sauvage et la protéine B de pantouflard soie du mûrier, par exemple) pour démontrer les protocoles généraux de la production de divers biomatériaux en alliage de protéines. Les protocoles comprennent démontré partie 1: les prédictions d'interactions protéiques et des simulations, partie 2: la production de solutions d'alliages de protéines, et la partie 3: la fabrication d'un alliage de protéineset des systèmes pour des applications optiques, électriques et pharmaceutiques.

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Figure 1: Les matières premières de différentes protéines de structure qui sont couramment utilisés dans notre laboratoire pour la conception de matériaux à base de protéines, y compris les soies à partir de différentes espèces de vers, les kératines de poils, la laine et les élastines de différents tissus, et diverses protéines végétales.

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Protocole

1 Prévision des interactions des protéines

  1. L'analyse bioinformatique des molécules protéiques
    1. Visitez le Centre national pour le site d'information de biotechnologie (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), et rechercher les noms de protéines qui seront utilisées pour l'étude de l'alliage. Remarque: Pour cet exemple, deux protéines ont été utilisés: la protéine A, qui est la nature fibroïne de soie tussah, et la protéine B, qui est l'intérieur de la fibroïne de soie du mûrier. Pour la protéine A, les séquences d'acides aminés peuvent être trouvés dans "fibroïne [Antheraea pernyi] GenBank: AAC32606.1" (Antheraea pernyi sont les Chinois (Chêne) Tussah Moth). Pour protéine B, les séquences d'acides aminés peuvent être trouvées dans "précurseur de la fibroïne de la chaîne lourde [Bombyx mori] NCBI séquence de référence: NP_001106733.1" et "précurseur de la chaîne légère de fibroïne [Bombyx mori] NCBI Reference Sequence: NP_001037488.1" ensemble (Bombyx mori est le ver à soie domestiqué du mûrier).
    2. Sélectionnez et save les séquences d'acides aminés de la protéine A et la protéine B de la base de données.
    3. Visitez le site Web ExPASy (le portail de bioinformatique SIB) (www.expasy.org) ou utiliser un autre logiciel commercial pour calculer les bioinformatique de base de données de protéines en fonction de leurs séquences, y compris, mais sans s'y limiter, la charge totale par molécule, indice d'hydrophobie de la molécule, la courbe de titrage des molécules à différentes valeurs de pH, etc Cette information sera utilisée comme éléments de base pour la simulation numérique des interactions entre protéines, et vous aidera à comprendre si ces deux protéines ont des interactions fortes. [Remarque: Cette étape n'est pas pour prédire précisément tous les détails de l'interaction de la protéine comme ceux utilisés dans de petits peptides ou des protéines sciences fonctionnelle. Le but de cette section est seulement pour éviter la production d'un mélange de protéines avec des séparations de macrophase évidentes qui ne peuvent être appelées un matériau «alliage». Par conséquent, l'estimation pourrait être approximative, mais ee système d'alliage de la protéine peut être vérifiée par une méthode expérimentale décrite dans l'étape 3.1 en utilisant l'analyse thermique précis].
  2. Simulation numérique de système en alliage de protéines
    Ci-dessous est décrit un procédé pour simuler le système d'alliage de la protéine. Un programme de simulation est écrit en langage de programmation C qui peut être utilisé sur un système informatique unique ou multiprocesseur. Un treillis-ressort-masse (LSM) modèle a été utilisé pour simuler l'alliage protéines 36-39. Le modèle LSM donne une description simple de la force nette sur une masse lorsqu'il est attaché à un ressort et on peut résoudre l'équation de la force de comprendre le mouvement pour chaque masse. Un algorithme simple du programme pour modéliser le système d'alliage de la protéine à l'aide du modèle de LSM est donnée comme suit:
    1. Représenter une seule protéine en tant que particules à gros grains qui a une masse de m.
    2. Utilisez un Hooke ou un ressort de néo-Hooke pour représenter une liaison 38,39. En reliant un nombre fini de particules avec des ressorts, une boîte make un domaine sous-alliage qui représente un bloc de construction stable de l'alliage protéines. Pour représenter les différents types d'obligations dans le intra-lien, utiliser différentes constantes de ressort / rigidité.
    3. Modéliser le système d'alliage de la protéine comme un matériau constitué de sous-alliages dûment réticulés. Encore une fois ici raideurs différentes ont été utilisées pour représenter les différents liens entre les interconnexions des sous-alliages.
    4. Modéliser la rupture de la liaison et le processus de réforme par un modèle de Bell 40,41, à travers lequel des liaisons faibles sont autorisés à être réformé, mais des liens forts ne peuvent pas réformer une fois qu'ils sont brisés. Lorsque le système est suffisamment souligné (à la fois sur les liens intra-et inter-suballoy suballoy), les obligations peuvent être brisées et réformés.
    5. Afin d'étudier les effets de déformation de l'alliage protéines quand ils sont stressés, appliquer des forces externes au système. Distribuer ces forces égales à chaque particule lors de la résolution de l'équation de la force (lois de Newton).
    6. Pour modéliser les interactionsentre la solution (tels que les molécules d'eau) et les protéines, appliquer une force de traction ou une force de friction supplémentaire pour chaque particule.
    7. Résoudre l'équation pour chaque particule avec les actions de chaque force (la force du lien, la force extérieure, et la force de frottement printemps) vigueur.
    8. Calculer et extraire les positions des particules de protéines en fonction du temps.
    9. Calculer les quantités physiques qui caractérisent les alliages des protéines à partir des positions des particules.
    10. Changer la rigidité de liaison dans le programme de comprendre les interactions entre protéines différentes. (La raideur de la liaison moyenne est calculée à partir du module des matières protéiques d'Young. Module de différents matériaux protéiques fibreuses de Young peut être obtenue soit par Universal Test de traction 18, ou directement à partir de littératures précédentes 2-4,18).

2 La production de protéines Solutions alliage

La soie sauvage tussah (protéine A) et de la soie de mûrier domestique (protéine B) sont choisis ici comme un exemple de système d'alliage de protéines. Ce protocole présente d'abord la façon d'obtenir la solution la soie tussah sauvage (protéine A).

  1. Couper des cocons de soie tussah sauvages premières ou des fibres à un poids de 3 g.
  2. Mesure 3 g de dicarbonate de sodium ou le carbonate de sodium (Remarque: Si l'on utilise le carbonate de sodium, le poids moléculaire des chaînes protéiques réduit au cours du processus d'ébullition 42).
  3. Remplir un bécher de 2 L de verre avec de l'eau distillée (H 2 O). Ensuite, placez le récipient en verre sur une scène chaude, couvrez d'une feuille d'aluminium, et porter à ébullition.
  4. Retirez le couvercle de papier d'aluminium et ajouter le bicarbonate de sodium mesurée lentement dans l'eau bouillante, ce qui lui permet de se dissoudre totalement. (Note: Le rôle de bicarbonate de sodium est le "savon" pour nettoyer les protéines solubles de séricine et d'autres impuretés attachées à la surface des fibres de soie sauvage cas d'utilisation d'OTH.er fibres protéiques de nature, s'il vous plaît sélectionner agents chimiques correspondantes selon la littérature).
  5. Ajouter les fibres protéiques premières (fibres de soie sauvage) dans l'eau bouillante et laisser bouillir pendant 2-3 heures (Note:. L'heure d'ébullition a un impact critique sur le poids moléculaire de chaînes de protéines 26,43 Il faut choisir un moment approprié selon de la littérature ou en effectuant des expériences de contrôle 26,43. la température d'ébullition puisse également être ajusté pour influer sur le poids moléculaire des chaînes protéiques 26,43,44).
  6. Après la cuisson, retirer soigneusement les fibres protéiques avec une spatule de la solution et les presser pour enlever l'excès d'eau. (ATTENTION: Les fibres sont très chauds!)
  7. Ensuite, plonger les fibres dans un bécher de 2 L avec de l'eau distillée froide et on lave les fibres à deux reprises pendant 30 min chacun pour éliminer complètement les résidus impurs de la surface de la fibre. Sécher les fibres dans une hotte de laboratoire pendant au moins 12 heures.
  8. Faire fondre 45,784 g de nit de calciumtaux (Ca (NO 3) 2) dans un bêcher en verre pour former un liquide à 65 ° C pour dissoudre les fibres de protéine de soie sauvage. (Remarque: Si vous utilisez d'autres fibres protéiques naturel, sélectionnez un correspondant de solvant pour dissoudre les protéines Ici, vous pouvez également utiliser 9,3 M LiSCN ou LiBr solution, ou une solution de phosphate de 85% pour la dissolution de différentes fibres de soie..)
  9. Combiner les fibres et le solvant dans un rapport de 1 g de fibres dans 10 ml de solvant. Permettre aux fibres de se dissoudre à 95 ° C pendant 5 à 12 h. (Note: Le temps de dissolution dépend du poids moléculaire des protéines 26,43-45)
  10. En utilisant des seringues, injecter la solution sauvage de soie en 12 ml cassettes de dialyse (maximum 1000 MW que la taille de coupure) ou tubes de dialyse scellés (maximum 1000 MW que la taille de coupure) et dialyser contre 2 L d'eau distillée. (Remarque: L'injection est plus efficace si le maintien de la solution à 35 ° C, sinon la viscosité de la solution de protéine va considérablement augmenter à la température ambiante). Changez l'eau distillée pour enlever fréquemment Ca (NO 3) 2 solvants dans la solution (après 30 min, 2 h, 6 h, puis toutes les 12 heures pendant 3 jours. Au total, il y aura environ 8 changements d'eau).
  11. Après 3 jours, recueillir les solutions de protéines à partir des cassettes de dialyse ou tube et le placer dans 13.000 tubes classé tours.
  12. Centrifuger les solutions pendant 1 heure à 3500 tours par minute à 4 ° C pour éliminer les dépôts 3x. Après chaque course centrifugeuse, retirez rapidement le surnageant dans de nouveaux tubes. Stocker les solutions finales dans un réfrigérateur à 4 ° C.
  13. Verser 5 ml de solution de protéine sur un polydiméthylsiloxane (PDMS) substrat ou un autre substrat hydrophobe plat et laissez-le sécher complètement (cela prend généralement plus de 12 heures). Peser le film de protéine restant solide et calculer la concentration finale de la solution, en pourcentage en poids (% p / v) = Poids mesuré (en mg) ÷ 5 (en ml) ÷ 10.
  14. Recueillir une autre fibre de protéine naturelle sélectionné (dans ce CASe, de la soie de mûrier domestiqué a été utilisée comme protéine B), et répéter processus ci-dessus avec un "savon" approprié et en dissolvant du solvant, jusqu'à ce que la solution finale de l'eau de la protéine avec la concentration mesurée est obtenue. [Note: Si les matières protéiques sont sous la forme de poudre, utiliser des tubes ou des membranes poreuses appropriées pour maintenir les échantillons pendant le processus de «savonnage». Si la protéine a déjà été purifié, passez directement à l'étape 2.8 pour dissoudre la poudre. Si la protéine a déjà été purifiée et est soluble dans l'eau, faire sa solution aqueuse avec une concentration souhaité puis passez à l'étape 2.15 ci-dessous pour faire des solutions de protéines de fusion.]
  15. Diluer lentement la solution de protéine A (solution de soie sauvage ici) dans l'eau distillée à 4 ° C pour former une protéine de 1,0% en poids d'une solution aqueuse. Faire le même processus pour la protéine B (soie domestiqué ici).
  16. Incorporer graduellement la protéine 1% en poids Une solution avec une solution de protéines de B à 4 ° C en utilisant une pipette pour éviter protein agrégation pendant le mélange. (Note 1: Ne pas utiliser un instrument de vortex pour mélanger les protéines car certaines protéines (par exemple, les soies) seront former des hydrogels pendant la vibration 46,47 Note 2:. Si possible, utiliser des dispositifs supplémentaires pour contrôler le taux de mélange et la taille de mélange décision Assurez-vous de les mélanger aussi lente que possible afin d'éviter l'agrégation. Ne pas pipeter rapidement la solution pendant le mélange).
  17. Les solutions finales de mélange doivent avoir un rapport de masse spécifiée ou un rapport molaire de la protéine A: Protéine B. En règle générale, les mélanger avec un rapport massique de 90:10, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90 pour obtenir un large éventail de solutions d'alliage. Utiliser des solutions de protéine A et la protéine B purs comme témoins. Pour un mélange en solution avec un rapport molaire de la protéine A: B = R Protein: (100-R). Calculer le rapport en volume de mélange (sur la base d'une même solution 1% en poids) par: A Volume: Volume B = R · (MW A): (R-100) · (PO de B).
  18. Jeter immédiatement les solutions définitives à PDMS substrats pour former des films ou d'autres desimatériaux ci a été conçu. (Remarque: Ne pas stocker solutions en alliage de protéines de haute concentration pendant une longue période Plus agrégats peuvent se former plus tard en raison des interactions protéine-protéine dans l'eau.). Si nécessaire, diluer les solutions de mélange avec de l'eau distillée exempte d'ions et les conserver dans un réfrigérateur C à 4 ° C pour éviter l'agrégation des protéines supplémentaires dans les solutions.

3. fabrication de protéines variable Matériaux alliage

  1. Confirmez alliage prévision par analyse thermique 3,9,31-35
    1. Préparer substrats PDMS et nettoyez-les en les trempant dans de l'eau distillée.
    2. Jetez les solutions de protéines de fusion avec différents rapports de mélange sur les PDMS substrats.
    3. Sécher les solutions pendant au moins 12 heures dans une hotte chimique avec le débit d'air jusqu'à ce que les films sont formés (Note: utiliser le même volume pour des solutions différentes de sorte que l'épaisseur des films peut être fixé).
    4. Retirez les films d'alliage de protéines à partir de PDMS substrats et les placer sur la vaisselle propre.
    5. Peser nombreux calorimétrie différentielle à balayage (DSC) casseroles en aluminium et des couvercles pour étude DSC. Faites correspondre les casseroles et couvercles paires d'avoir un poids total égal (poids de récipient et la masse de couvercle correspond à un poids constant). Par exemple, voici un poids total de couvercle et un panoramique 22,50 mg ont été utilisées, et huit ensembles de couvercle et de panoramique des combinaisons avec ce poids total ont été préparés.
    6. Encapsuler 6 mg chaque type de protéine séchée se fond dans les casseroles de DSC en aluminium et les sceller avec leurs couvercles assortis dans les processus 3.1.5. Sceller un récipient vide et le couvercle paire à être utilisé avec l'échantillon de référence de sorte que seule la capacité thermique des échantillons se sera enregistrée lors de l'analyse thermique (Note: Le DSC comparer la capacité de chaleur de la poêle de référence + couvercle contre que de l'échantillon + casserole + couvercle. raison des poids égaux, la capacité des casseroles et des couvercles de chaleur de fond sera comptabilisée pour ne laisser que la capacité thermique de l'échantillon dans la casserole).
    7. Mettez références scellés et des casseroles échantillons dans un appareil de DSC, avecsec purgé à l'écoulement de gaz d'azote de 50 ml / min et équipé d'un système de refroidissement réfrigéré. Avant les mesures d'échantillons, l'instrument de DSC doit d'abord être étalonné avec de l'indium et du saphir pour l'écoulement de chaleur et de température, respectivement.
    8. Pré-exécuter la DSC à une vitesse de chauffage de 2 ° C / min à 150 ° C, puis maintenir à cette température pendant 15 min pour éliminer toutes les molécules d'eau restant dans les échantillons (typiquement de l'ordre de 3 à 10% du poids total). Refroidir rapidement vers le bas (10 K / min) à 25 ° C.
    9. Exécuter à nouveau la DSC à une vitesse de chauffage de 2 ° C / min à 300 ° C, ou jusqu'à ce que le pic de la dégradation des mélanges de protéines apparaissent 34. Noter les capacités calorifiques de l'échantillon de protéine à différentes températures lors de ce processus. Refroidir le DSC et changer l'ancien échantillon à un nouvel échantillon avec un rapport de mélange différent.
    10. Calculer et tracer la capacité thermique contre les courbes de température pour chaque échantillon protéine de fusion en utilisant le logiciel DSC 31-35.
    11. Juger de la miscibility de mélanges de protéines par la méthode suivante (voir la figure 4 thermique et la figure 5), et si les deux protéines sont totalement miscibles, ils peuvent être appelés «alliages de protéines". Sinon, le terme "protéine composite" serait un nom approprié selon les théories descriptives polymères 48,49):
      1. Les protéines individuelles A et B devraient avoir individu température de transition vitreuse, T g (A) et T g (B) (voir les courbes vertes et bleues de la figure 5) 3,48;
      2. Cette température de transition vitreuse est généralement intermédiaire entre ceux des deux composants de protéine, T g (A) et Tg (B) (voir Figure 5) 3,48;
      3. Séparation de phase non miscible, on obtient des mélanges si les deux T g (A) et Tg (B) apparaissent à leur position d'origine (figure 5), et à chaque étape de la T ghauteur en proportion de la composition, les deux protéines sont complètement non miscible à 3,48.
      4. Semi-miscible composite type de mélange aura une très large transition vitreuse, ou peut encore avoir deux transitions vitreuses, mais chacun a migré plus proche de l'autre par rapport à des composants de protéine pure, T g (A) et Tg (B) ( voir figure 5). Dans ce cas, il peut y avoir des structures de phase micro-hétérogènes formés entre les deux composants de la protéine, et la composition peut varier d'un endroit à l'autre.
    12. Si (3.1.11.1) est le cas représenté sur la DSC, et il peut être confirmé que la protéine AB est un système d'alliage, puis passer à fabriquer des matériaux d'alliage de protéines.
  2. Fabrication de matériaux optiques par Alliages de protéines
    1. Produire (dans le laboratoire de fabrication) ou acheter une surface topographique conçu pour la coulée. Dans cet exemple spécifique, un verre à quatre motifs de diffraction a été utilisé (figure 4Optique).
    2. Placez le verre avec des motifs de diffraction dans un plat, et assurez-vous que la surface à motif est confronté à la hausse.
    3. Fais solution PDMS uniformément sur ​​la surface du verre, et couvre entièrement les motifs de surface (PDMS La solution est réalisée par la mise en pot et la solution de catalyseur dans un mélange 9: 1 le rapport de mélange selon le mode d'instruction 23,44).
    4. Placer la cuvette de coulée dans un four à 65 ° C pendant au moins 2 heures, tandis que sur une surface plane. La solution PDMS doit sécher dans un substrat solide au cours de ce processus.
    5. Retirer substrat PDMS de verre. Les diagrammes de diffraction doivent maintenant être transférées à la surface du PDMS.
    6. Découper les moules PDMS avec des motifs de diffraction à l'aide d'un poinçon approprié.
    7. Baisse des solutions en alliage de protéines sur les surfaces de PDMS avec des motifs de diffraction, et les sécher pendant au moins 12 heures pour obtenir des films avec des motifs de diffraction.
    8. Pour obtenir les matériaux en alliage de protéines insolubles, placer l'ensemble de pry compris des films, des moules dans un PDMS C étuve sous vide à 60 ° (25 kPa) avec un plat d'eau sur le fond de la chambre. Pomper l'air dans le four, et laisser les vapeurs d'eau des échantillons de recuit pendant au moins 2 h. (Ce processus est appelé à température contrôlée de la vapeur d'eau recuit 45. Comparaison avec la méthode de méthanol largement utilisé, il peut générer similaire teneur en bêta-feuille dans les matériaux de soie 45). Couper le vide et de décoller le film insoluble dans l'eau du substrat PDMS en utilisant une pince. Pour cet exemple, sauvages alliages de soie soie domestiqué sont utilisés.
    9. Testez la qualité de diagrammes de diffraction sur des films en les comparant avec les modèles originaux sur la vitre (par exemple, recueillir des images SEM pour les détails à petite échelle, de recueillir des motifs de diffraction de laser pour la qualité de schéma général).
  3. Fabrication de circuits électriques sur les protéines Alliages Matériaux
    1. Pour fabriquer un motif de circuit électrique sur un substrat de verre, d'abord CLEAna lame de verre en utilisant une dégraissage au solvant tel que Alconox dans un bain à ultrasons pendant 5 min, suivie de 5 min dans de l'acétone, suivi par 5 min dans du methanol. Le méthanol est utilisé en dernier car il s'évapore plus lentement que l'acétone peut donc être arrachée du substrat plutôt que le séchage et laissent des traces.
    2. Sonnez de la lame de verre à sec en utilisant de l'azote gazeux sec qui est généré par l'évaporation de 180 L Dewar d'azote liquide.
    3. Introduire les matériaux de substrat dans la chambre de dépôt. (Ces lignes directrices sont associés à un système de pulvérisation, mais d'autres techniques de dépôt puissent être utilisées.) Si la chambre est conçue avec un sas de chargement, le vide dans la chambre de dépôt ne soit pas sensiblement affectée. Évacuer le sas à une pression de 30 mTorr.
    4. Ouvrez la vanne d'arrêt entre le sas et la chambre de dépôt principal et introduire le substrat dans la chambre.
    5. Allumer le gaz Ar et du régulateur de pression et de réguler la pression désirée à l'deposition pression. Des pressions plus élevées donnent l'énergie pulvérisé atomes inférieurs métalliques et de films plus uniformes, mais des pressions plus faibles donnent de meilleurs adhérant films déposés plus rapidement. La gamme de pressions est généralement compris entre 3 et 60 mTorr mTorr, avec 20 mTorr fonctionne bien.
    6. Les métaux sont ensuite projetés sur un obturateur qui protège le substrat de revêtement en utilisant une puissance RF de 100 W. Un circuit d'accord est nécessaire pour diriger l'énergie RF de la cible métallique. Courant continu pourrait être utilisé à la place de RF pour cibles métalliques. Afin d'éliminer les couches d'oxyde et de contaminants à partir de la cible, de pré-pulvérisation pendant plusieurs minutes.
    7. Ouvrez le volet et pulvériser le métal sur le substrat. La vitesse de dépôt pour la configuration décrite est d'environ 10 nm par minute. Ce taux dépend de la distance, de la pression, la force de l'aimant de travail à la cathode du magnétron, l'épaisseur de la cible et le métal pulvérisé. Ajuster le temps de dépôt pour obtenir l'épaisseur souhaitée.
    8. Retirer la lame de verre revêtue de lachambre.
    9. Utilisation d'un métier à filer, tourner d'un revêtement de résine photosensible sur la surface du film. Beaucoup de resists peuvent être utilisés. Dans ce cas, on a utilisé photorésist positif.
    10. Après le résist est filé sur le film, cuisson douce à 90 ° C pendant 5 minutes pour sécher la résine.
    11. Placer un masque de contact avec une image de l'appareil fermement contre la résistance. Une source de lumière UV est utilisé pour exposer la résine photosensible. L'exposition est de 10 secondes, mais varie en fonction de l'intensité de la source de lumière et la résine utilisée.
    12. Placer le film dans le révélateur de résine photosensible jusqu'à ce que l'image projetée apparaît. Les lavages de développement loin du résistent qui a été exposé à la lumière UV qui provoquent la rupture des liaisons polymères. Immédiatement après l'image apparaît, plonger le film dans de l'eau DI pour arrêter le développeur de travailler sur la résine photosensible non exposée.
    13. Soufflez les films secs avec de l'azote sec.
    14. Placez les films dans un four à 120 ° C pendant 15 min pour "cuire dur" la photorésister.
    15. Après les films refroidir, placez-les dans une solution de gravure jusqu'à ce que le métal n'est pas protégé par la résine photosensible décolle. Trempez-les dans l'eau pour arrêter la gravure.
    16. Rincer avec de l'acétone pour enlever la résine photosensible durcie.
    17. Rincer avec du méthanol et sécher avec de l'azote sec.
    18. Une fois les verres à couches sont prêts, déposer des solutions différentes en alliage de protéines sur les surfaces de verre, et les sécher pendant au moins 12 heures pour obtenir des films d'alliage de protéines sur les verres. (Il est suggéré d'abord concentrer les solutions d'alliage à 5% en poids pour obtenir des films d'alliage d'épaisseur de la protéine.)
    19. En raison des interactions hydrophobes, hydrophiles, les films métalliques minces sont transférées à partir des surfaces de verre à l'alliage de protéine fixée pellicule surfaces 51. Décoller les films d'alliage de protéine avec les motifs métalliques minces à partir des substrats en verre à l'aide de forceps.
    20. Pour obtenir des matériaux d'alliage de protéines insolubles, placer les films secs dans un four sous vide C à 60 ° (25 kPa) et une awater plat sur le fond de la chambre. Pomper l'air dans le four, et laisser les vapeurs d'eau des échantillons de recuit pendant au moins 2 h. Couper le vide et de décoller le film insoluble dans l'eau du substrat en utilisant une pince.
    21. Testez les qualités électriques de motifs métalliques sur des films d'alliage de protéines telles que la résistance électrique et de les comparer aux modèles originaux sur la vitre.
  4. Fabrication de matériaux pharmaceutiques par des alliages de protéines
    1. Pour fabriquer un alliage de protéines films avec des composés pharmaceutiques, d'abord préparer un substrat de PDMS comme décrit dans l'étape 3.2. Nettoyer le substrat PDMS formé par de l'eau distillée.
    2. Dissoudre ou disperser les composés pharmaceutiques dans une solution aqueuse. Utiliser les ultrasons ou vortex pour mélanger de façon homogène les composés pharmaceutiques à l'eau. Si les composés ne sont pas solubles dans l'eau, disperser les poudres avec une distribution homogène dans l'eau distillée exempte d'ions.
    3. Calculer le ratio masse désiréede composés à des alliages de protéines par: volume de solution de composé x pourcentage en poids de solution de composé: volume de solution de protéine alliage x pourcentage en poids de la solution de composé (ici la solution d'alliage 1% en poids a été utilisé). Choisir un rapport pour obtenir un film ayant une densité de composé désiré dans le film d'alliage de protéine.
    4. Mélangez lentement la solution du composé avec la solution d'alliage de protéines en suivant les mêmes instructions de la section 2 processus 2.16. (Remarque: Pour éviter la gélification, ne ultrasonicate ou vortex la solution pendant le mélange).
    5. Verser un volume calculé du mélange sur le substrat de PDMS et la sécher au moins 12 heures dans une hotte chimique pour obtenir un film d'alliage contenant une proportion de protéines conçu de composés pharmaceutiques.
    6. Physiquement réticulé du film en suivant la même instruction à la section 3.2 processus 3.2.8. Un exemple de films d'alliage avec des médicaments insolubles du modèle de faible densité (LD) ou un haut (HD) de densité pourrait être vu sur la Figure 4 Chimie.

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Résultats

Interactions protéine-protéine typique (par exemple, entre la protéine A et la protéine B) peuvent contenir charge charge (électrostatiques) attractions, la formation de liaisons hydrogène, interactions hydrophobes-hydrophiles, ainsi que dipôle, solvant, contre-ion, et les effets entropiques entre le spécifique domaines de ces deux protéines (Figure 2) 3. Par conséquent, fondamentalement, nous pouvons prédire les effets de ces interactions par des simulations informatiques.

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Discussion

L'une des procédures les plus critiques dans la production de système de protéine "alliage" est de vérifier la miscibilité de mélanges de protéines. Dans le cas contraire, il est seulement un système de composite de mélange de la protéine ou protéine non miscible sans propriétés stables et réglables. Procédé d'analyse thermique expérimental peut être utilisé à cette fin et pour confirmer les propriétés de l'alliage. Les interactions protéine-protéine peuvent être considérées selon le modèle de rése...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Les auteurs remercient la Rowan University pour le soutien de cette recherche. XH aussi grâce Dr David L. Kaplan à l'Université Tufts et le NIH P41 Tissue Resource Center Engineering (TERC) pour les formations techniques précédentes.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Calorimètres différentiels à balayage (DSC)TA Instruments, New Castle, DE, États-Unis
N/AVous pouvez utiliser n’importe quel type de DSC avec un logiciel pour calculer la capacité thermique.
Système de pulvérisation sous vide SS30T  ;T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USAN/AAvec des pièces sur mesure, vous pouvez utiliser n’importe quel type de système de pulvérisation pour revêtir.
Four à vide VWR 1415M VWRInternational, Bridgeport, NJ, États-Unis n/aVous pouvez utiliser n’importe quel type de four à vide pour réticuler physiquement les échantillons.

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