Photostimulation par balayage laser de circuits du cerveau antérieur ciblés optogénétiquement

Résumé

Nous décrivons une méthode pour caractériser la topographie fonctionnelle et les propriétés synaptiques des circuits du cerveau antérieur en utilisant une approche optogénétique pour photostimuler les populations neuronales in vitro.

Résumé

Le cerveau antérieur sensoriel est composé de types de cellules étroitement liées, dont les propriétés fonctionnelles n’ont pas encore été entièrement élucidées. La compréhension des interactions de ces circuits cérébraux antérieurs a été facilitée récemment par le développement de méthodes optogénétiques pour la modulation de l’activité neuronale par la lumière. Ici, nous décrivons un protocole pour examiner l’organisation fonctionnelle des circuits du cerveau antérieur in vitro en utilisant la photostimulation par balayage laser de la channelrhodopsine, exprimée optogénétiquement via la transfection à médiation virale. Cette approche exploite également l’utilité de la recombinaison cre-lox chez les souris transgéniques pour cibler l’expression dans des types de cellules neuronales spécifiques. Après la transfection, les neurones sont physiologiquement enregistrés dans des préparations de coupes à l’aide d’un patch clamp de cellules entières pour mesurer leurs réponses évoquées à la photostimulation par balayage laser des fibres exprimant la channelrhodopsine. Cette approche permet d’évaluer la topographie fonctionnelle et les propriétés synaptiques. Des corrélats morphologiques peuvent être obtenus en imageant l’expression neuroanatomique des fibres exprimant la channelrhodopsine à l’aide de la microscopie confocale de la tranche vivante ou du tissu post-fixé. Ces méthodes permettent des investigations fonctionnelles des circuits du cerveau antérieur qui s’étendent à des approches plus conventionnelles.

Introduction

Le circuit élaboré du cerveau antérieur des mammifères pose un défi expérimental pour disséquer les rôles fonctionnels de ses composants entrelacés. Le démêlage de ces relations a été récemment facilité par le développement de méthodes optogénétiques permettant d’exciter et d’inhiber spécifiquement les populations neuronales et leurs projections^1-3. Ces approches utilisent l’expression génétiquement contrôlée des canaux membranaires sensibles à la lumière^4-6. Il convient de noter en particulier que la channelrhodopsine, un canal ionique photodébilisé, dépolarise les membranes neuronales à la suite d’une stimulation optique, entraînant une excitation du neurone exprimant et de ses projections^4,7. À l’inverse, l’halorhodopine, une pompe à chlorure photocommandée, hyperpolarise la membrane, inhibant ainsi la projection ciblée^6,8,9. Plusieurs variantes de ces opsines ont été conçues, de multiples vecteurs ont été produits pour la transfection et l’expression dans les populations neuronales d’intérêt, et des lignées de souris transgéniques ont été modifiées pour exprimer constitutivement ces opsines ou qui permettent le contrôle de leur expression par l’intermédiaire de cre-lox^1,2,10,11.

L’utilité de ces méthodes et matériaux optogénétiques a révolutionné les neurosciences expérimentales modernes, permettant de disséquer le rôle de circuits neuronaux spécifiques dans la physiologie et le comportement de l’organisme^12-15. En particulier, ces méthodes peuvent être puissamment appliquées à la dissection fonctionnelle des circuits cérébraux à l’aide de préparations de coupes in vitro ^16-20. Dans ce contexte, l’un des principaux avantages de cette méthode est la possibilité de caractériser la physiologie de projections à longue portée qui sont difficiles, voire impossibles, à conserver dans une tranche épaisse, comme les connexions commissurales entre les hémisphères corticaux cérébraux¹⁶. De plus, cette technologie permet des manipulations impossibles avec d’autres méthodes, telles que l’inhibition sélective des projections avec une précision temporelle fine à l’aide de l’halorhodopsine^6,8,9. De plus, l’expression spécifique de ces opsines permet aux composants isolés d’un circuit neuronal d’être stimulés ou inhibés de manière sélective^1,2,11,15,21. En tant que tels, ces nouveaux outils optogénétiques permettent l’analyse sans précédent des contributions neuronales à la physiologie et au comportement.

Ici, nous décrivons un protocole d’expression de la channelrhodopsine dans le cerveau de la souris à l’aide de vecteurs viraux adéno-associés (AAV)^1,2. La transfection spécifique de populations neuronales ciblées peut être réalisée à l'aide de ce protocole, avec le choix approprié de constructions promotrices ou de souris transgéniques qui expriment la Cre-recombinase dans les neurones ciblés d'intérêt et une construction virale « floxée »^1,11,15,21 (Figure 1). À titre d’exemples, nous examinons les projections corticocorticales entre le cortex visuel primaire (V1) et le cortex visuel secondaire (V2) et nous étudions également la projection corticothalamique de couche 6 du cortex somatorsensoriel primaire (S1) vers le noyau médial ventropostérieur (VPm). Nous combinons cette expression spécifique avec la photostimulation par balayage laser in vitro pour évaluer la physiologie synaptique et la topographie fonctionnelle. La configuration présentée ici permet un positionnement spatial précis et un contrôle des lieux de photostimulation. Enfin, nous décrivons la visualisation des motifs d’expression à l’aide de la microscopie confocale.

Protocole

1. Chirurgie et injections

1. Anesthésier les souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale (aiguille de 22 à 25 g recommandée) de kétamine (100 à 120 mg/kg) et de xylazine (7,5 à 16 mg/kg).
   1. Évaluez la sédation à l’aide de fortes pincements des orteils jusqu’à ce qu’aucune réponse ne soit obtenue. Pour toutes les procédures animales décrites, modifiez-les pour suivre les directives locales de l’IACUC si nécessaire.
2. Placez les souris sous sédation dans un appareil stéréotaxique en fixant la tête et les oreilles dans leurs supports respectifs.
   1. Lubrifiez les yeux avant de placer l’animal dans le dispositif stéréotaxique avec une pommade ophtalmique stérile.
3. Rasez le cuir chevelu avec un rasoir et stérilisez la zone avec des cotons-tiges de bétadine.
4. À l’aide d’un scalpel, coupez une incision médiane et réfléchissez la peau et les muscles sous-jacents au-dessus de la zone à injecter.
5. Faites pivoter une lame de scalpel comme un trépan pour effectuer une craniotomie au-dessus de la région à exposer. Vous pouvez également utiliser un petit foret attaché à un Dremel pour effectuer la craniotomie.
   1. Pour effectuer la craniotomie, placez la lame du scalpel ou le foret sur la surface du crâne et tournez lentement jusqu’à ce qu’une quantité suffisante d’os ait été excavée pour révéler la pie-mère en dessous.
   2. Une fois l’excavation initiale effectuée, agrandissez la craniotomie à l’aide de pinces fines pour retirer soigneusement l’os des bords.
6. Remplissez une seringue de 1 μl avec la solution virale à injecter (UNC Vector Core).
   1. Pour améliorer l’efficacité de la transfection, préparer une solution virale avec 4 μg/ml de polybrène.
7. Abaissez l’aiguille dans la zone à injecter et perférez sous pression 200 nl de solution contenant le virus à l’aide d’un pousse-seringue.
   1. Laissez la seringue reposer pendant 10 minutes avant de retirer l’aiguille.
8. Suturez la peau avec du nylon monofilament non résorbable et couvrez l’incision avec une pommade antibiotique.
   1. Les sutures doivent être retirées après 7 à 10 jours.
9. Injecter de la buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg) pour l’analgésie postopératoire.
10. Laisser les animaux se rétablir après l’opération pendant 14 à 21 jours pour permettre une expression adéquate de la rhodopsine de canal.

2. Préparation des tranches

1. Après la période de récupération, anesthésier profondément l’animal avec une anesthésie à l’isoflurane, comme en témoigne l’absence de réflexe de retrait lorsque la patte arrière et/ou les orteils sont fermement pincés.
2. Disséquer le cerveau par décapitation suivie de coupures médianes et frontales du crâne.
3. Séparez le crâne de la ligne médiane pour exposer le cerveau.
4. Retirez soigneusement le cerveau à l’aide d’une spatule fine pour séparer les nerfs crâniens de la base du cerveau.
5. Placez rapidement le cerveau disséqué dans un petit bécher de 100 ml contenant du liquide céphalo-rachidien artificiel réfrigéré et glacé (ACSF ; en mM : 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂, 2 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 25 glucose).
6. Retirez le cerveau de l’ACSF et placez-le sur une lame de microscope recouverte de papier filtre pré-humidifié avec de l’ACSF.
7. Faites une coupe bloquante du cerveau dans l’orientation souhaitée à l’aide d’une lame de rasoir propre.
8. Fixez la surface bloquée du cerveau à l’étape de coupe à l’aide d’une colle adhésive instantanée.
9. Transférer l’étape dans une chambre de coupe vibrante (conservée au congélateur jusqu’à ce qu’elle soit prête à être coupée).
10. Versez l’ACSF glacé dans la chambre de coupe.
11. Coupez des sections de cerveau à 400-500 μm à l’aide d’une trancheuse à tissus vibrants.
12. Transférez les tranches de cerveau dans une chambre de rétention contenant de l’ACSF oxygéné et incubez à 30 °C pendant au moins 1 heure avant l’expérience.

3. Enregistrement physiologique

1. Après la période d’incubation, transférez une tranche dans une chambre d’enregistrement sur une platine de microscope modifiée.
2. Fixez la tranche dans le bain pendant l’expérience à l’aide de quelques fils de filaments de nylon attachés à un porte-tranche de fil de platine.
3. Perfuser constamment la tranche avec de l’ACSF.
4. Tirer les pipettes d’enregistrement jusqu’à une résistance de pointe de 3 à 6 MΩ lorsqu’elles sont remplies d’une solution intracellulaire contenant les éléments suivants (en mM) : 127 K-gluconate, 3 KCl, 1 MgCl₂, 0,07 CaCl₂, 10 HEPES, 2 Na_2-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. La solution intracellulaire doit avoir un pH de 7,3, ajusté avec du KOH ou de l’acide gluconique et une osmolalité de 280-290 mOsm.
5. À l’aide d’une configuration standard d’enregistrement de cellules entières visualisées, placez la pipette d’enregistrement près du neurone à enregistrer tout en appliquant une pression positive^22,23.
6. Relâchez la pression positive tout en appliquant l’aspiration pour former le joint Gigaohm.
7. Appliquez une brève aspiration pour briser la membrane et former un enregistrement de configuration de cellule entière.
8. Enregistrez les réponses des neurones dans une pince de tension ou de courant.

4. Photostimulation par balayage laser

1. Logiciel et matériel d’acquisition de données de démarrage, décrits dans les rapports précédents^23-29.
   Remarque : Nous avons utilisé à la fois les programmes d’acquisition Tidelwave²⁵ et, plus récemment, Ephus²⁶, écrits dans Matlab et développés par le laboratoire de Karel Svboda chez Janelia Farms³⁰. Pour une description complète de la photostimulation par balayage laser chez Ephus, voir Suter et al.²⁶ et le guide étape par étape³⁰.
   Remarque : La configuration décrite dans cet article est dérivée de celle décrite par Shepherd (2012)²³. Le faisceau laser est guidé par un système de miroirs à faisceau ouvert vers l’orifice supérieur du microscope à travers la lentille de l’objectif sur la tranche (Figure 2).
2. Déviez une petite partie du laser sur une photodiode à l’aide d’une lamelle de microscope placée dans la trajectoire du laser et utilisez le courant de sortie de cette photodiode pour surveiller l’intensité du laser pendant les expériences.
   1. Étalonnez le courant de sortie de la photodiode enregistré dans le logiciel en fonction de la puissance laser mesurée au niveau du plan focal arrière de l’objectif à l’aide d’un wattmètre lors de la configuration de l’équipement²³.
3. Contrôlez la puissance du laser en tournant une roue à densité neutre variable. La puissance laser utilisée a varié entre 25 et 70 mW (dans le plan focal arrière) dans nos expériences.
4. Réglez la durée et le moment de la stimulation laser en modifiant les paramètres d’impulsion du laser et de l’obturateur. La stimulation laser dure généralement 2 ms.
5. Capturez l'image de la région à stimuler à l'aide de la fonction « Grab Video ».
6. Sélectionnez la grille de stimulation en fonction des dimensions souhaitées. Nous utilisons généralement un réseau de stimulation de 16 x 16 avec un espacement de 80 μm entre les rangées et les colonnes adjacentes.
7. Superposez la grille de mappage avec l’image acquise et ajustez le décalage x, y et en degrés à l’emplacement et à l’orientation souhaités.
8. Activez la fonction 'Map' pour lancer la stimulation et l'acquisition de données.
9. Après l'acquisition des réponses évoquées par photostimulation, effectuer l'analyse des données cartographiées à l'aide du programme d'analyse cartographique hors ligne de Tidelwave²⁵ ou du programme « MapAnalysis » d'Ephus²⁶.

5. Imagerie de tranche fixe

1. Après les enregistrements, transférer la tranche de cerveau à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans 0,01 M PBS (pH 7,4) pendant la nuit à 4 ºC.
2. Transférez la tranche dans 30 % de saccharose dans 4 % de PFA/0,01 M PBS pendant une nuit à 4 ºC.
3. Découper des sections de 50 μm à l’aide d’un cryostat et collecter dans du PBS de 0,01 m.
4. Rincer deux fois les sections dans 0,01 M PBS à température ambiante.
5. Montez les sections et la lamelle dans un support anti-décoloration approprié.
6. Transférez les coupes dans le microscope confocal.
7. Concentrez-vous sur le retour sur investissement à l’aide de la lumière blanche.
8. Choisissez la longueur d’onde, la taille de l’image et la répétition pour l’acquisition de l’image. Pour YFP, nous utilisons 514 nm (Ex)/527 nm (Em).

Résultats

La photostimulation par balayage laser des projections entre l’aire visuelle primaire (V1) et l’aire visuelle secondaire (V2) chez la souris a été réalisée à la suite d’injections de pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP dans V1 d’une souris Balb/C (Figure 3). Le promoteur CaMKIIa dans cette construction virale entraîne l’expression spécifique de la channelrhodopsine-EYFP dans les neurones glutamatergiques excitateurs^1,15. Après préparation de coupes pour l’enregistrement physiologique, l’expression des fibres de channelrhodopsine-EYFP, c’est-à-dire l’épifluorescence de l’EYFP conjugué, a été observée traversant de V1 à V2 (Figure 3A). De plus, les fibres corticothalamiques dans le noyau géniculé latéral (LGN) ont également été observées (Figure 3A). Des enregistrements de patch clamp de cellules entières d’un neurone dans V2 ont révélé des EPSC induites à la suite d’une photostimulation par balayage laser de fibres exprimant la channelrhodopsine-EYFP dans les couches inférieures de V2 (Figure 3B).

Dans un autre exemple, la photostimulation par balayage laser des projections corticothalamiques de la couche 6 du cortex somatosensoriel primaire (S1) vers le noyau ventropostérieur (VP) a été réalisée à l’aide de ce protocole. Ici, nous avons utilisé une approche Cre-Lox pour cibler spécifiquement l’expression de la channelrhodopsine dans les neurones de la couche 6 et les projections corticothalamiques d’intérêt. Explicitement, nous avons injecté pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA dans S1 de B6. Souris Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd (Figures 1 et 4). Cette souche de souris transgénique exprime la Cre-recombinase spécifiquement dans les neurones corticothalamiques de la couche 6²¹, et entraîne donc l'expression de ChR-YFP uniquement dans ces neurones après transfection par la construction AAV « floxée ». Après préparation des tranches, des fibres de channelrhodopsine-EYFP ont été observées dans les neurones de la couche 6 et des fibres projetées vers la couche 4 et VP (Figures 4A et 4B). L’enregistrement physiologique d’un neurone VPm à l’aide d’un patch clamp de cellule entière a révélé que des EPSC pouvaient être déclenchées à la suite d’une photostimulation à balayage laser près du neurone enregistré (figures 4C et 4D).

La morphologie des fibres marquées a été évaluée plus facilement suite à des enregistrements physiologiques. Ici, nous avons réséqué des préparations de coupes (50 μm) avec expression de channelrhodopsine-EYFP dans des neurones corticothalamiques de couche 6 (Figure 5). Cela a révélé un motif fin de fibres marquées traversant de la couche 6 à la couche 4, où elles se terminaient et arborisaient largement (Figure 5A). De plus, des fibres corticothalamiques ont été observées pénétrant dans la substance blanche en se dirigeant vers le thalamus (Figures 5A et 5B).

Graphique 1. Illustration schématique de l’expression ciblée de la channelrhodopsine via une approche Cre-Lox. Des souris transgéniques exprimant la Cre-recombinase dans les populations neuronales d'intérêt sont injectées avec un virus « floxé » codant pour la channelrhodopsine fusionnée à une protéine fluorescente, telle que YFP. Après la transfection, seuls les neurones avec la Cre-recombinase exprimeront la channelrhodopsine-EYFP. Cliquez ici pour agrandir l’image.

Graphique 2. Illustration schématique de la configuration de la photostimulation. (A) Schéma de la configuration de photostimulation à balayage laser. Le faisceau laser est guidé successivement à travers un système de faisceau ouvert jusqu’à un obturateur et un filtre à densité neutre (N.D.). Une lamelle réfléchissant une partie du faisceau vers une photodiode connectée à un amplificateur pour les mesures de puissance laser. Les galvanomètres à miroir sont utilisés pour positionner le faisceau laser à travers une lentille de balayage, qui guide le faisceau à travers un port latéral sur le dessus du microscope. Le faisceau est ensuite réfléchi vers le bas à travers la lentille de l’objectif jusqu’à la préparation de la tranche à l’aide d’un miroir dichroïque. Pour plus de détails, voir Lam et Sherman²³ et Shepherd²⁹. (B) Exemple de la grille de photostimulation pour l’expérience représentative illustrée à la figure 3. La grille de stimulation 16 x 16 est superposée sur une photomicrographie de la préparation de la tranche. Une étoile rouge indique l’emplacement d’un neurone enregistré à l’aide d’un patch clamp de cellules entières. La position du faisceau laser est guidée vers chacune des 256 positions de la grille de stimulation par le positionnement informatisé des galvanomètres à miroir. Les positions laser des 5 premiers sites de stimulation sont représentées sur la figure. Les réponses du neurone enregistré à la photostimulation à chacun des sites sont illustrées à la figure 3. Cliquez ici pour agrandir l’image.

Graphique 3. Photostimulation par balayage laser des projections corticocorticales du cortex visuel primaire (V1) au cortex visuel secondaire (V2) chez la souris. (A) Image épifluorescente de la préparation de la tranche montrant les fibres de channelrhodopsine-EYFP de V1 à V2 et dans le noyau géniculé latéral (LGN). L’expression spécifique de la channelrhodopsine-EYFP dans les neurones glutamatergiques excitateurs est déterminée par une construction virale contenant le promoteur CaMKIIa. (B) Courants postsynaptiques excitateurs (EPSC) induits à partir d’un neurone en V2 à la suite d’une photostimulation par balayage laser. L’étoile rouge indique le site d’enregistrement. Barres d’échelle : (A) 500 μm, (B) 200 pA, 100 msec. Cliquez ici pour agrandir l’image.

Graphique 4. Photostimulation par balayage laser des projections corticothalamiques du cortex somatosensoriel primaire (S1) au noyau ventropostérieur (VP) chez la souris. (A) Image épifluorescente de la préparation de la tranche montrant les fibres de channelrhodopsine-EYFP dans S1. (B) Image épifluorescente de fibres marquées en VP. (C) Courants postsynaptiques excitateurs (EPSC) induits à partir d’un neurone VP à la suite d’une photostimulation à balayage laser. (D) Graphique des EPSC moyens. L’étoile rouge indique le site d’enregistrement. Les traces encadrées en (C) correspondent aux valeurs encadrées en (D). Barres d’échelle : (A) 250 μm, (B) 250 μm, (C) 100 pA, 100 msec. Cliquez ici pour agrandir l’image.

Figure 5. Imagerie des neurones de la couche 6 exprimant la channelrhodopsine-EYFP dans le cortex somatosensoriel primaire (S1) de la souris. (A-B) Neurones marqués dans la couche 6 et fibres projetées vers la couche 4 et la substance blanche. Barres d’échelle : (A) 250 μm, (B) 250 μm. Cliquez ici pour agrandir l’image.

Discussion

Le protocole décrit détaille une approche pour l’évaluation in vitro de la topographie fonctionnelle et de la physiologie des circuits neuronaux, qui ne se limite pas à l’étude des circuits du cerveau antérieur, c’est-à-dire ceux du thalamus et du cortex. Plusieurs constructions virales pour la transfection optogénétique ont été mises à la disposition de la communauté scientifique et peuvent être facilement obtenues à partir du Vector Core de l’UNC. Pour une description des constructions virales facilement disponibles, consultez le UNC Vector Core³¹, la page de ressources en optogénétique du laboratoire Deisseroth de l’Université de Stanford³² et le laboratoire de neurobiologie synthétique Boyden du MIT³³. Des variantes de ces opsines ont été développées par ces laboratoires et permettent de disposer d’un large éventail de modes pour contrôler l’excitabilité neuronale^1,2. L’obtention de ces vecteurs à partir du noyau vectoriel de l’UNC nécessite un accord de transfert de matériel de la part des laboratoires d’origine. Dans ce protocole, nous notons que l’ajout de polybrène améliore l’efficacité de la transfection. De plus, une autre variable influençant l’expression est la période de récupération post-chirurgicale, dont on note qu’une période d’au moins 14 jours est suffisante pour obtenir une expression robuste dans les voies du cerveau antérieur des souris.

Pour la transfection ciblée de groupes neuronaux spécifiques, plusieurs lignées de souris transgéniques Cre ont été développées, qui peuvent être utilisées en combinaison avec des constructions virales à cadre de lecture ouvert inversé « floxé » qui ont été développées¹¹. Plusieurs souches pertinentes pour la recherche en neurosciences sont disponibles par l’intermédiaire des Mutant Mouse Regional Resource Centers³⁴. Des atlas des profils d’expression de la Cre-recombinase dans ces lignées transgéniques sont proposés dans la base de données GENSAT³⁵. De plus, Jackson Labs propose plusieurs souches transgéniques Cre, ainsi que d’autres qui expriment constitutivement des opsines dans des groupes neuronaux spécifiques. Une étape critique de l’utilisation de ces lignées de souris est de prendre en compte le temps nécessaire à l’obtention et à l’établissement d’une colonie de reproduction, qui peut varier en fonction de la souche d’intérêt.

Pour la photostimulation, nous avons utilisé et adapté la configuration développée par le Shepherd Lab de l’Université Northwestern, décrite dans un protocole récent²⁹. Bien qu’optimisée pour le décannage du glutamate, cette configuration se prête également à la photostimulation de la channelrhodopsine sans modification. Cette configuration permet un contrôle spatial précis et un positionnement des loci de photostimulation, ce qui permet une évaluation de la topographie fonctionnelle de l’innervation de la channelrhodopsine des neurones enregistrés. Bien que le contrôle spatial soit amélioré avec cette méthode de photostimulation, son coût est plus prohibitif que les méthodes utilisant un éclairage de champ basé sur des LED²⁰. De plus, la non-uniformité du tissu cérébral est une limitation de l’optogénétique, ou de toute technique impliquant une manipulation de la lumière. Dans la pratique, cependant, il s’agit rarement d’un facteur, car les résultats sont interprétés principalement de manière qualitative. Dans le cas où une comparaison plus quantitative entre les régions du cerveau est nécessaire, on peut toujours utiliser l’intensité lumineuse maximale pour obtenir des réponses « saturées ».

De plus, nous avons utilisé les logiciels Tidelwave et Ephus écrits dans Matlab pour contrôler la photostimulation à balayage laser et l’acquisition de données^25,26. Cependant, il est recommandé à ceux qui mettent en place un système similaire d’utiliser le logiciel Ephus²⁶, plus récent, qui bénéficie d’un support disponible via le site de développement de Janelia Farms³⁰. Une étape clé consiste à choisir lequel de ces progiciels utiliser, car leurs exigences matérielles diffèrent légèrement. De plus, les programmes d’analyse cartographique sont adaptés à leurs programmes respectifs d’acquisition de données.

Plusieurs de ces étapes peuvent être modifiées pour s'adapter à la configuration particulière du praticien. Les injections de solutions virales peuvent être effectuées à l’aide de mécanismes d’administration autres qu’une seringue, par exemple des pipettes en verre capillaire tirées à des diamètres d’extrémité de ~40 μm fonctionnent également bien. Pour les chirurgies, un support de tête non stéréotaxique peut être substitué si ces coordonnées ne sont pas nécessaires pour guider les injections. De plus, les compositions d’ACSF et de solutions intracellulaires peuvent être modifiées en fonction des exigences expérimentales particulières, par exemple en remplaçant une solution intracellulaire de césium ou à haute teneur en chlorure pour isoler les courants inhibiteurs. De plus, une alternative à l’imagerie des motifs d’expression dans des coupes fixes peut également être réalisée dans la tranche vivante sur un banc d’imagerie approprié avec un système de perfusion par bain.

En résumé, ce protocole permettra au praticien de caractériser la topographie fonctionnelle et la physiologie synaptique des projections in vitro, ce qui peut ne pas être possible avec des méthodes standard, par ex. caractériser des projections à longue portée qui ne peuvent pas être conservées dans une tranche. Le protocole de transfection décrit peut être appliqué aux expériences optogénétiques in vivo ^1-3,12,14, puisque le mécanisme d’administration est le même. Enfin, bien que ce protocole décrit la transfection de souris, de nombreux vecteurs viraux disponibles peuvent être utilisés pour transfecter et exprimer théoriquement ces opsines dans un large éventail d’espèces de mammifères, permettant ainsi une myriade d’études comparatives et spécifiques à l’espèce^1-3.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Polybrene	Santa Cruz Biotech	SC134220
Paraformaldéhyde 32 % solution	EMS	15714
VECTASHIELD	Vector Labs	H-1400
AAV Constructions virales	UNC Vector Core	NA
Souris casque stéréotaxique	Stoelting	51730
Injecteur Nanocool	Harvard Appareil	703040
Laser UV : 355 nm, Nd :YVO4 ; 1 W ;	DPSS Lasers, Inc	3500
Galvonomètres	Cambridge Scanning	6210
miroirs	Cambridge Scanning	6m2003S-A
mount	Cambridge Scanning	6102103L
câble	Cambridge Scanning	6010-19-120
driver/controller	Cambridge Scanning	67121-1
Obturateur - Revêtement ZM (compatible UV)	Uniblitz	L23-ZM2
Contrôleur d’obturateur	Uniblitz	VMM-D1
Amplificateur de courant	Stanford Research Systems	SR570
6713 carte	National Instruments	777741-01
2110 boîte de dérivation	National Instruments	777643-01
PCI-MIO-16E-4	National Instruments	777383-01
BNC-2090	National Instruments	777270-01
Câbles	National Instruments	184749-01
MATLAB	Mathworks
TCS SP2	Leica Microsystems