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Étirer dans le cerveau cellules endothéliales microvasculaires (CEND) comme

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DOI :

10.3791/50928

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26 octobre 2013

 ,  , 
1Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie, Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg, 2Department of Medicinal Chemistry, Faculty of Life Sciences, University of Vienna

Dans cet article

Résumé

In vitro modèles de lésions cérébrales traumatiques sont développés pour reproduire la déformation du cerveau in vivo. Blessure Stretch-induite a été utilisée pour les astrocytes, neurones, cellules gliales, aortiques et des cellules endothéliales cérébrales. Toutefois, notre système utilise une barrière hémato-encéphalique (BHE) du modèle qui possède des propriétés constituant un modèle légitime du Bureau d'établir un modèle de TBI in vitro.

Résumé

En raison de l'incident de mortalité provoquée par une lésion cérébrale traumatique (TBI), les méthodes qui permettraient de mieux appréhender les mécanismes sous-jacents impliqués dans celui-ci sont utiles pour le traitement. Il ya à la fois in vivo et des méthodes in vitro disponibles à cet effet. In vivo modèles peuvent simuler un traumatisme crânien réel tel qu'il se présente au cours de TBI. Cependant, les techniques in vivo ne peuvent être exploités pour des études au niveau de la physiologie cellulaire. Par conséquent, les méthodes in vitro sont plus avantageux à cet effet, car ils fournissent un accès plus facile aux cellules et le milieu extracellulaire pour la manipulation.

Notre protocole présente un modèle in vitro de TBI avec des blessures d'étirement dans les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales en. Il utilise la pression appliquée sur les cellules cultivées dans des puits à fond souple. La pression appliquée peut être facilement contrôlé et peut produire des blessures allant de faible à sévère. Le murincerveau cellules endothéliales microvasculaires (CEND) générés dans notre laboratoire est un modèle bien adapté pour la barrière hémato-encéphalique (BHE) offrant ainsi un avantage à d'autres systèmes qui utilisent une technique similaire. En outre, en raison de la simplicité de la méthode, expérimentales set-ups sont facilement dupliqués. Ainsi, ce modèle peut être utilisé dans l'étude des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans TBI au Bureau.

Introduction

Une lésion cérébrale traumatique (TBI) est l'une des principales causes de décès dans le monde. Environ 10 millions de personnes sont touchées chaque année par TBI qui en fait un problème sanitaire et médicale 1. Pour cette raison, diverses in vivo et des modèles in vitro de TBI ont été mis en place et développé pour étudier les mécanismes 2,3,4. Une meilleure compréhension de TBI peut aider à améliorer le traitement des patients et de diminuer la mortalité, la morbidité et les coûts.

De nombreux modèles de lésion cérébrale qui utilisent à la fois in vivo et in vitro méthodes existent. Dans les modèles in vivo pourrait imiter l'événement réel de blessure à la tête. Toutefois, en raison de la complexité de la situation in vivo, l'accessibilité au tissu d'intérêt devient limité 2. Pour comprendre la réponse physiologique des cellules individuelles à la suite de la blessure infligée, il est important que les cellules sont isolées à partir des effets systémiques quipeuvent inhiber ou de modifier leur réponse individuelle 5. Pour cette raison, des modèles cellulaires de traumatisme offrent des avantages précieux sur des modèles animaux que l'environnement mécanique des cellules peut être contrôlée avec précision 6.

Dans les systèmes in vitro qui emploient l'utilisation de charge mécanique de cellules ou de tissus afin de déterminer des altérations induites par un tel procédé de blessures ont été développés. Par exemple, une méthode pour étudier l'effet des dommages mécaniques aux cellules a été établi pour les astrocytes, neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales aortiques 7,8,9. Le modèle de traumatisme vitro établi pour l'étude des rongeurs et réactivité des astrocytes homme de 10 employés un dispositif de contrôle de pression identique à ce que nous utilisons pour notre modèle. La même méthode a été appliquée à induire des lésions par étirement dans les cellules du cerveau de souris microvaisseaux endothéliales (bEnd3) 11 et les neurones corticaux 12,13 ainsi que, endoth cérébraleElial cellules de porcelets nouveau-nés 14. Dispositif déforme le fond du puits de culture produisant de ce fait un dommage mécanique d'étirement 10. Il inflige des blessures sur des cellules en culture par application d'une pression d'air au-dessus des cellules. Cette pression peut dévier la membrane sur laquelle les cellules sont de plus en plus, de ce fait l'étirement des cellules. Divers degrés d'étirement (c.-à «faible», modérée "ou" sévère ") peuvent être obtenus en réglant la durée d'impulsion de pression de l'air et de l'intensité en conséquence. Cette méthode de blessure tronçon induite a été corrélée à une blessure traumatique in vivo 7. Plus , cette méthode permet de blessures pour le contrôle précis de l'environnement extracellulaire et peut facilement être reproduit.

Bien qu'une approche similaire a été utilisée pour de nombreux autres types de cellules du cerveau, y compris bEnd3, notre modèle est un avantage en ce qu'elle rend l'utilisation du cerveau des cellules endothéliales microvasculaires murins (CEND) générédans notre laboratoire. Cette lignée cellulaire est un modèle bien adapté de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Dans des cultures cellulaires in vitro utilisés comme modèles BBB doit posséder des caractéristiques qui leur permettraient de servir comme écran de perméabilité. Un critère important pour un modèle cellulaire in vitro pour être un prédicteur de la perméabilité de la BHE est qu'il doit posséder l'architecture des cellules physiologiquement réaliste 15. Même si les cellules bEnd3 afficher distinctif broche morphologie de type épidermoïde de la culture 16, ils présentent un comportement irrégulier morphogénétique in vitro où ils forment des cavités kystiques plutôt que sur les structures tubulaires réguliers en fibrine gels 17. En outre, lorsque les cellules ont été injectées à des souris embryonnaires et néonatale, ils induits tumeurs à croissance rapide mortelles pour les souris embryonnaires, mais pas chez les souris nouveau-nés et les jeunes. Il est donc suggéré qu'un ou plusieurs processus qui régissent normale de croissance endothélial, la migration et la différenciation ont été modifiés ou éliminanted dans cette lignée cellulaire 18. D'autre part, morphologiques, évaluation immunocytochimique des mesures de flux endothéliales et l'expression du marqueur du Bureau, bioélectrique et paracellulaire démontrer que notre Bureau CEND modèle est en effet un modèle adapté du Bureau 19.

endothélium du cerveau in vivo est caractérisé par une perméabilité extrêmement serré avec résistance électrique trans-endothéliale (TEER) allant de 2000-5000 Qcm2. Pour les études de cerveau propriétés de barrière aux microvasculature aux produits pharmaceutiques, restrictif paracellulaire et l'étanchéité des cellules devraient être envisagées. Dans la plupart des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (BCEC), ce n'est pas conservée comme les cellules présentent TEER allant de 50 à 100 Qcm2 20. Le cerveau endothéliale bEnd3 de lignée cellulaire immortalisée génère des valeurs de TEER de pas plus de 60 Qcm 2 15. En revanche différenciation des cellules CEND avec un milieu contenant du sérum réduit affichageTEER valeurs allant de 300 à 500 Qcm2 19,21.

À ce jour, des modèles in vitro de blessures étirement dans les cellules endothéliales du cerveau cultivées sont rares. Par conséquent, un modèle in vitro pour un traumatisme à cause de blessures d'étirement en utilisant des cellules endothéliales cérébrales culture qui agissent en tant que modèle de la BHE mai s'avérer utile. Dans ce protocole, nous présentons un modèle in vitro qui pourraient imiter l'impact réel que les cellules du cerveau, les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau spécifiquement du Bureau, reçoivent au cours de TBI. Le principal avantage de ce modèle est que le montant des dommages appliquée aux cellules ainsi que le milieu extracellulaire peut être facilement contrôlé de manière précise qui permet la reproductibilité facile de montage expérimental.

Protocole

1. Ensemencement des cellules endothéliales en plaques à puits

  1. Cultiver le cerveau des cellules endothéliales microvasculaires murins (CEND) en T75 flacon de culture, changer le milieu (DMEM contenant 10% de FCS, 50 U / ml de pénicilline / streptomycine, 1% de L-glutamine) deux fois par semaine, jusqu'à la confluence est atteinte. (Pour la génération et l'immortalisation des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales, s'il vous plaît voir Burek et al, 2012;. Förster et al, 2005 21,19.).
  2. Laver les cellules avec un tampon phosphate salin (PBS). Retirez le PBS et trypsiniser les cellules avec 2 ml de solution chaude de trypsine-EDTA.
  3. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que la couche de cellules est dispersé.
  4. Ajouter milieu de culture 8 ml dans les cellules. Appuyez sur le flacon plusieurs fois pour détacher les cellules.
  5. Voir les cellules sous le microscope afin d'assurer un détachement complet du flacon.
  6. Moyen pipette avec des cellules individuelles de haut en bas. Agiter le flacon pour mélanger le suspensi cellulairesur.
  7. Prenez 20 pi de la suspension cellulaire, mis dans un hémocytomètre et compter le nombre de cellules.
  8. Déterminer la densité de cellules et de semences 20.000 cellules / cm 2 dans le puits.
  9. Transférer la suspension cellulaire dans collagen1 préenduites plaques de culture 6 puits à fond souple (57,75 cm 2) dans un volume total de 3 ml / puits. Chaque puits a une superficie de 9,62 cm 2.
  10. Cultiver les cellules à 37 ° C pendant une semaine jusqu'à confluence. Changer le milieu de culture deux fois par semaine.

2. La différenciation cellulaire avant l'accident Stretch-induite

  1. Changer le milieu de culture des cellules avec un milieu de différenciation (DMEM contenant 1% de sérum de veau foetal dépourvu de sérum dépouillé (ssFCS), 50 U / ml de pénicilline / streptomycine).
  2. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 24 heures.

3. Blessure Stretch-induite des cellules endothéliales

  1. Allumez le dispositif de commande de la lésion des cellules.
  2. Définissez le délai à 50 msec.
  3. Régler la pression du régulateur à 15 psi et appuyez sur le déclencheur plusieurs fois jusqu'à ce que la pression maximale recommandée est stable.
  4. Régler la pression du régulateur à la valeur désirée. Utiliser le tableau 1 comme un guide pour générer différents degrés de blessures d'étirement.
  5. Placer la plaque de culture à fond souple 6 puits (57,75 cm 2) dans le support de plateau. Assurez-vous que le sélecteur est bien réglé à la taille bien correct (ie grand bien).
  6. Placez l'adaptateur fermement au-dessus du puits. Tenir la prise fermement en place avec une main pendant que l'autre main appuie sur le déclencheur.
  7. Notez la pression maximale générée.
  8. Mettre immédiatement la plaque arrière dans le 37 ° C incubateur pour la durée souhaitée ou utiliser immédiatement pour réussir expériences ou d'évaluation.

4. Évaluation du préjudice extensible par Essai de fixation du colorant

  1. Immédiatement après que les cellules étaient strgravée (étape 3.7), ajouter 30 ul d'une solution à 1 mg / ml de la viabilité tache qui agit comme un marqueur de cytotoxicité (voir le tableau complémentaire des matériels et équipements) dans le milieu de culture cellulaire (Note: 10 pl de la solution de colorant doit être utilisé pour chaque ml de milieu de culture cellulaire).
  2. Lors de l'ajout du colorant dans les cellules, voir immédiatement sous un microscope à fluorescence.

5. Évaluation du préjudice extensible par lactate déshydrogénase (LDH) de presse

  1. Immédiatement après l'étirement des cellules (étape 3.7), supprimer 200 ul de milieu de culture cellulaire à partir du puits. Faites de même pour chaque point de post-blessure fois que vous souhaitez inclure dans votre enquête sur la libération de LDH (ie par exemple 30 min, 1 h, 2 h, etc.)
  2. Centrifuger le milieu de culture cellulaire au réglage le plus élevé d'une micro-centrifugeuse pendant 5 min pour enlever les débris de cellules. Retirer le surnageant et l'utiliser pour les étapes suivantes.
  3. Une fois que vous hAve a terminé l'étape 5.1 et ont pris les échantillons nécessaires vous aimeriez avoir des différents points dans le temps que vous souhaitez étudier, la lyse des cellules en utilisant la solution de lyse inclus dans le kit test LDH (s'il vous plaît voir le tableau complémentaire des matériels et équipements).
  4. Mettez 100 pi de milieu de dosage inclus dans l'essai kitto chaque puits d'une plaque de 96 puits fourni dans le kit.
  5. Mettez 100 pi de milieu de culture cellulaire dépourvu de cellules dans deux puits parallèles d'une plaque de 96 puits inclus dans le kit de dosage.
  6. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 30 min.
  7. Lire l'absorbance à 492 nm.

Résultats

Les cellules cultivées sur du collagène I préencolle plaques de culture à fond de 6 puits flexibles (57,75 cm 2) ont été soumis à divers degrés de blessures d'étirement en utilisant le dispositif tendeur de la cellule. Après la soumission des cellules à des blessures, ils ont été examinés au microscope pour les effets de la lésion induite par étirage à la morphologie des cellules. Il a été observé que plus grand degré d'étirement est appliquée aux cellules un degré plus élevé de distorsion de la cellule pourrait également être observées (Figure 1). Comme le montre la figure 1A, les cellules témoins qui n'étaient pas soumis à des blessures apparaissent des cellules endothéliales vasculaires cérébraux que de forme régulière (CEND) sans aucune indication de gonflement des cellules ou de distorsion. Quand blessure tronçon a été appliquée (figures 1B-D), la déformation a pu être observée au microscope optique. Après l'étirement des cellules sévèrement avec un pic de pression entre 3.5-4.5 psi, les cellules CEND apparus nettement rétractés, gonflés et déformés avec pas espaces intercellulaires capables. En outre, l'absorption de la viabilité tache (concentration finale 100 nM) a aussi augmenté le degré de lésion d'étirement a augmenté (figure 2). La viabilité colorer utilisé est un colorant imperméant aux cellules saines qui devient perméat lorsque l'intégrité de la membrane plasmique des cellules est compromise. Le colorant a été exclue de la plupart des cellules de contrôle, par conséquent, seulement quelques-uns des cellules ont été colorées (figure 2A) par rapport aux cellules allongées (figures 2B-D). Plus cellules fluoresce vert avec un degré accru de blessures d'étirement.

Comme un marqueur biochimique de la blessure, la libération de lactate déshydrogénase (LDH) enzyme a également été examinée conformément aux instructions du fabricant. Figure 3 montre qu'une blessure extensible cellulaire croissante provoquée augmentant la libération de LDH.

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Figure 1. Examen de la microscopie optique des cellules normales vs blessé. (A) monocouche de cellules confluentes non étiré normale istightly emballé et allongée. Lorsque les cellules ont été étirés en appliquant une impulsion de pression maximale de 1,8 à 2,0 psi (c.-bas stretch), ils apparaissent moins compacte, les espaces indiqués par des flèches (B). Lorsque les cellules ont été modérément blessés avec une impulsion de pression maximale 2,5-3,0, certains d'entre eux semblaient gonflés et déformés (C). Les cellules deviennent rentrés avec le bout sévère de 3,5-4,5 psi, comme indiqué par la flèche (D). Un grossissement de 100X. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 2. Fluorescence examen microscopique des cellules normales vs blessé cellules traitées avec la viabilité 2h tache après une blessure A: cellules non étirées contrôle BD: cellules allongées (B - faible, C - modéré, D - sévère).... Un grossissement de 100X. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 3. Déshydrogénase (LDH) libération de l'enzyme lactate dans le surnageant après une blessure extensible. LDH libérée dans le milieu de culture a été mesurée à différents intervalles de temps après étirement blessure induite. LDH a été exprimée en pour cent de la LDH libérable totale (LDH dans les médias plus des cellules). Les valeurs sont ± SEM. Le n pour chaque point de temps est de 5, à l'exception du 0 h Valeur soumis à un étirement sévère où n = 3. LDH par les cellules qui ont été soumis à un étirement faible et modérée ne diffère pas sensiblement de celle des témoins non étirées et de l'autre. Les cellules qui ont été sévèrement tendues publié une quantité nettement plus importante de la LDH par rapport à tous les autres échantillons, à l'exception de l'échantillon modérément tendu à 1 h. (P <0,05, un facteur ANOVA, méthode Holm-Sidak). Cliquez ici pour agrandir l'image .

Tableau 1. Guide pour générer divers degrés de blessures étirement.

La pression du régulateur La pression maximale Gravité des blessures
15 psi 1.2-1.5 psi
20-25 psi 1,8-2,0 psi Faible
30-35 psi 2.5-3.0 psi Modéré
40-50 psi 3.5-4.5 psi Sévère
60 psi 4,8-6,0 psi > Severe

Discussion

Les effets des blessures mécaniques in vitro ont été étudiés et les méthodes ont été établies pour les astrocytes, neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales aortiques 8, 9, 22. Il est, cependant, à ce jour, toujours pas connue modèle in vitro de blessures étirement dans les cellules endothéliales cérébrales en culture in. Des modèles cellulaires de traumatisme offrent des avantages précieux sur des modèles animaux que l'environnement mécanique des cellules peut être contrôlée avec précision 6. Par conséquent, un modèle in vitro pour un traumatisme à cause de blessures d'étirement en utilisant des cellules du cerveau endothéliales cultivées dans cet acte comme modèle de la barrière hémato-encéphalique (BHE) comme quoi notre protocole présentes peuvent s'avérer utiles.

Ce protocole utilise des cellules CEND, un modèle du Bureau établi dans notre laboratoire. Depuis Bureau répartition est souvent documentée chez les patients ayant subi un TCC et TBI est souvent liée à la perturbation du Bureau qui peut entraîner la formation de l'œdème 23, 24, la méthode presuvre ici peut notamment être utilisé dans la réalisation d'études BBB par rapport au TBI.

Dans ce modèle, il est important de prendre soin de combien de gravité de la blessure d'étirement est appliquée aux cellules. Dans la mesure où les cellules sont blessées en tout cas, et avec ce niveau de pression est appliquée, la gravité des blessures qui peuvent influer sur les cellules endothéliales diffère pas beaucoup de beaucoup d'autres types de cellules. Cellules endothéliales aortiques sont plus résistants à étirer blessures que les astrocytes ou cellules gliales mixtes 9. En outre, ils réparent plus rapidement après une blessure par rapport aux autres types de cellules. Par conséquent, pour les cellules endothéliales du cerveau, en particulier des cellules CEND, une plus grande quantité de blessures d'étirement est nécessaire pour produire un degré élevé de blessure. On pourrait atteindre le degré de blessure souhaité en appliquant la pression correspondant indiqué dans le tableau 1. Pour les cellules CEND, cependant, des blessures graves est préféré en raison de leur résistance à la traction. Les analyses effectuées ont montré LDHque, lorsque le degré d'étirage augmente, plus la LDH est sécrétée dans le surnageant. En revanche, les cellules qui ont été donnés une faible quantité de blessures d'étirement produit LDH dans un montant similaire aux cellules témoins. Comme mentionné dans le protocole, il faut veiller à ce que la quantité appropriée de milieu est utilisé depuis une augmentation ou une diminution de la quantité de milieu peuvent entraîner des différences dans la pression maximale appliquée aux puits. Par exemple, un puits contenant 5 ml de liquide enregistre une pression maximale dans la moyenne de 4,0 psi pendant un puits vide enregistre une moyenne de 3,8 psi quand 45 psi pression est appliquée. Par conséquent, il est préférable de pousser plusieurs fois le déclenchement sur un contrôle et à veiller à ce que la pression maximale qui sera généré correspond à la quantité désirée.

Dans nos expériences, nous avons utilisé une viabilité tache de déterminer l'effet de l'étirement de la perméabilité de la membrane cellulaire. L'optique des plaques de culture souple à fond, nous avons utilisé nous permet de view Les cellules colorées directement sous le microscope. Toutefois, lorsque l'on veut réaliser des études de immunomarquage directement après l'étirement des blessures, des difficultés peuvent survenir. Tout d'abord, la taille et l'épaisseur de la plaque peuvent poser un problème avec certaines plateformes d'observation au microscope. Deuxièmement, l'optique de la membrane souple du puits peuvent être un obstacle à une visualisation claire.

Malgré les limites mentionnées ci-dessus, cependant, la procédure décrite peut être utilisée comme un modèle d'une blessure mécanique in vitro du Bureau. Une lésion cérébrale traumatique (TBI) comporte deux volets, à savoir, l'ischémie et les traumatismes. L'ischémie peut survenir à la suite de blessures secondaires TBI dans les cas où il ya perte de sang grave entraînant une pression artérielle basse ou à la suite d'un oedème cérébral limitant l'apport d'oxygène au cerveau. Il est considéré comme un retard, des dommages non mécaniques représentant des processus pathologiques consécutifs lancés au moment de la blessure 25. La survenue d'une hypoxieprès avoir grave lésion cérébrale traumatique est fréquente 26. la privation de glucose d'oxygène (OGD) est la méthode actuellement utilisée pour modéliser l'ischémie in vitro. Ainsi, en soumettant les cellules à OGD comme une insulte secondaire par rapport aux cellules après étirement peut imiter l'incidence des TBI suivie par l'ischémie. Ainsi, pour améliorer notre actuel modèle in vitro de TBI et le modèle le plus près possible d'une réelle TBI comme cela se produit in vivo, dans l'avenir, nous allons aussi utiliser OGD en combinaison avec des blessures d'étirement.

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Cette recherche a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) sous le numéro subvention FO 315/4- et l'Union européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) sous convention de subvention n ° HEALTH-F2-2009-241778 à CF.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
contrôleur de lésions cellulaires II, Virginie, États-Unis.
Plaque de culture Bioflex - Collagène de type IFlexcell, Dunn LabortechnikBF - 3001C  ;
Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796  ;
Sérum de veau fœtal (SCF)Laboratoires PAAA15110-1333concentration finale 10 %, inactivé par la chaleur (30 min à 56 ° ; C)
L-glutamineBiochrom AGK0282Stockage : &le ; -15 ° ; C
MEM VitamineBiochrom AGK0373Stockage : &le ; -15 ° ; C
Na-pyruvateBiochrom AGL0473  ;
Acides aminés non essentiels (NEA)Biochrom AGK0293Stockage à 4 ° ; C
Péniciline/StreptomycineBiochrom AGA2212Stockage : &le ; -15 ° ; C
Sérum de veau fœtal, dénudé de charbon de bois (ssFCS)Life Technologies12676-011  ;
Solution trypsine-EDTALaboratoires PAAL11-004Stockage : &le ; -15 ° ; C
Image-iT DEAD GreenLife TechnologiesI10291Stockage : &le ; -15 ° ; C, protégé de la lumière Kit de détection de
cytotoxicité PLUS (LDH)  ;Roche4744926001Stockage : &le ; -15 ° ; L
Conception et fabrication personnalisées du

Références

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