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Article de méthode

Enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-AFM unique molécule Spectroscopie de Force

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DOI :

10.3791/50950

⸱

20 décembre 2013

 ,  ,  , 
1Lehrstuhl für Angewandte Physik and Center for Nanoscience, Ludwig-Maximilians-Universität

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les cellulosomes sont des complexes multienzymatiques conçus pour digérer la cellulose. Le SMFS basé sur l’AFM a été utilisé pour étudier les propriétés mécaniques et la configuration de repliement des assemblages de protéines associées au cellulosome. Nous présentons un flux de travail complet pour l’immobilisation des protéines, l’acquisition de données et l’analyse de données afin d’étudier les interactions des complexes récepteurs-ligands individuels impliqués dans l’assemblage des cellulosomes.

Résumé

Les cellulosomes sont des complexes multienzymatiques discrets utilisés par un sous-ensemble de bactéries anaérobies et de champignons pour digérer les substrats lignocellulosiques. L’assemblage des enzymes sur la protéine d’échafaudage non catalytique est dirigé par des interactions entre une famille de paires récepteur-ligand apparentées comprenant des modules de cohésine et de dockerine en interaction. La liaison extrêmement forte entre les modules de cohésine et de dockerine entraîne des constantes de dissociation dans la gamme picomolaire faible à nanomolaire, ce qui peut entraver la précision des mesures hors taux avec les méthodes de masse conventionnelles. La spectroscopie de force à molécule unique (SMFS) avec le microscope à force atomique mesure la réponse des biomolécules individuelles à la force et, contrairement à d’autres méthodes de manipulation de molécules uniques (c’est-à-dire les pinces optiques), est optimale pour étudier les interactions récepteur-ligand de haute affinité en raison de sa capacité à sonder le régime de force élevée (>120 pN). Nous présentons ici notre protocole complet pour l’étude des assemblages de protéines cellulosomiques au niveau de la molécule unique. À l’aide d’une topologie protéique dérivée du cellulosome natif, nous avons travaillé avec des protéines de fusion enzyme-dockerine et module de liaison aux glucides-cohésine (CBM-cohésine), chacune avec un groupe thiol libre accessible sur un résidu de cystéine modifié. Nous présentons notre protocole d’immobilisation de surface spécifique au site, ainsi que notre procédure de mesure et d’analyse de données pour obtenir des paramètres de liaison détaillés pour le complexe de haute affinité. Nous montrons comment quantifier les forces de dépliage d’un seul sous-domaine, les forces de rupture complexes, les taux de décalage cinétique et les largeurs potentielles du puits de liaison. L’application réussie de ces méthodes dans la caractérisation de l’interaction cohésine-dockerine responsable de l’assemblage de complexes cellulolytiques multidomaines est décrite plus en détail.

Introduction

Les cellulosomes sont de grands complexes multienzymatiques présents à la surface de bactéries cellulolytiques anaérobies (par exemple C. thermocellum) qui ont évolué pour dépolymériser efficacement la lignocellulose de la paroi cellulaire végétale en oligosaccharides solubles1. Un attribut central des cellulosomes est l’interaction cohésine-dockerine de haute affinité. Dans le paradigme le plus important, un module dockerin de type I de 60 à 75 acides aminés hautement conservé est affiché à l’extrémité C-terminale des différentes enzymes bactériennes. Le module dockerin dirige l'assemblage de combinaisons synergiques d'enzymes sur la protéine d'échafaudage non catalytique (« scaffoldin »), qui comprend une polyprotéine de domaines de cohésine spécifiques du module dockerin de type I. À des niveaux plus élevés, l’architecture des cellulosomes peut devenir très complexe, incorporant des paires alternatives de cohésine et de dockerine (par exemple de type II, de type III) qui ancrent les structures à la surface de la cellule et permettent l’assemblage de structures ramifiées contenant plusieurs échafaudages2. Les différents types de cohésine-dockerine, bien qu’ayant des structures apparentées, présentent des spécificités de liaison différentielles supprimant la réactivité croisée avec des échaffoldines involontaires ou des composants d’autres espèces bactériennes productrices de cellulosomes. Bien que les approches bioinformatiques aient réussi à identifier des milliers de composants cellulosomales uniques au niveau génétique, relativement peu de structures protéiques sont connues, et les mécanismes à l’œuvre dans la détermination de la spécificité cohésine-dockerine restent un domaine actif de la recherche en biologie structurale.

Depuis l’invention du microscope à force atomique (AFM) par Binnig et al.3, divers modes de fonctionnement AFM ont été développés et continuellement améliorés, notamment l’imagerie sans contact, l’imagerie en mode oscillation4 et la spectroscopie de force à molécule unique (SMFS)5,6. SMFS est devenu une technique largement utilisée pour sonder directement les protéinesindividuelles 7-11, les acides nucléiques12-15 et les polymères synthétiques16-19. Dans une expérience SMFS typique visant à étudier la liaison récepteur-ligand20,21, une pointe en porte-à-faux AFM est modifiée avec l’un des partenaires de liaison, tandis qu’une surface de verre plate est modifiée avec le partenaire de liaison complémentaire. Le cantilever modifié est mis en contact avec la surface, ce qui permet aux partenaires de se lier. La base du porte-à-faux est ensuite retirée à vitesse constante et la force est mesurée à l’aide de la méthode de déviation optique du levier. Les traces de données force-distance résultantes présentent des pics en dents de scie si la liaison était établie. Dans les cas où les partenaires de liaison sont fusionnés à plusieurs domaines protéiques, chaque pic de la trace force-distance peut être corrélé au déploiement d’un seul domaine protéique ou d’un sous-domaine replié, tandis que le dernier pic correspond à la rupture de l’interface de liaison protéique. Les positions spécifiques des éléments résistants à la force peuvent être utilisées comme une empreinte digitale pour identifier les différents domaines protéiques d’intérêt. Cette méthode peut être utilisée pour interroger les acides aminés importants impliqués dans le repliement et la stabilisation des protéines. De nombreux modèles ont été rapportés dans la littérature pour traiter le comportement caractéristique d’extension de la force observé dans les expériences SMFS. Les modèles les plus couramment utilisés comprennent la chaîne à articulation libre (FJC) modèle22, la chaîne à vis sans fin (WLC) modèle18,23-25 et la chaîne à rotation libre (FRC) modèle25,26.

Dans nos travaux précédents11, nous avons utilisé la spectroscopie de force à molécule unique pour étudier l’interaction des modules de cohésine et de dockerine. Ici, nous présentons un protocole expérimental pour la fonctionnalisation de la surface du verre et du cantilever avec des constructions protéiques enzymatiques-dockerine et CBM-cohésine. Nous présentons également un protocole SMFS basé sur AFM comprenant des procédures d’acquisition et d’analyse de données. Le protocole décrit peut facilement être généralisé à d’autres systèmes moléculaires, et devrait s’avérer particulièrement utile aux chercheurs intéressés par les paires de ligands de récepteurs de haute affinité.

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Protocole

Un schéma de la géométrie de traction utilisée dans cette étude pour analyser l'interaction cohesine-dockerine est présenté dans la figure 1A. Le protocole d'immobilisation des protéines décrit ici pour la fonctionnalisation du levier et du verre de couverture est une version modifiée de la méthode publiée précédemment27. Les protéines ont été exprimées à partir de vecteurs plasmidiques dans E. coli selon des méthodes classiques. Les protéines ont été conçues avec un groupe thiol accessible au solvant, utilisé conjointement avec une chimie maleimide pour fixer la protéine, via une liaison thioéther stable, à la surface du verre de couverture et du levier. Les résidus de cystéine introduits dans les protéines de fusion CBM-cohesine et xylanase-dockerine se trouvaient du côté N-terminal des protéines, à distance de l'interface de liaison cohesine-dockerine11. Une vue d'ensemble détaillée des liaisons chimiques utilisées pour l'immobilisation des protéines est présentée dans la figure 1B.

1. Préparation de l'échantillon

  1. Tampons
    1. Préparer le tampon Tris salin supplémenté en calcium (TBS) : 25 mM TRIS, 75 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7,2
    2. Préparer le tampon borate de sodium : 50 mM Na2B4O7, pH 8,5
      Le schéma de flux du processus montrant les étapes de préparation des échantillons est présenté dans la Figure 2.
      Lors de la manipulation des leviers et des lamelles, l'utilisation de pinces autobloquantes est recommandée.
  2. Aminosilanisation des lamelles (environ 1,5 h)
    1. Placer la lamelle (diamètre 24 mm, épaisseur 0,5 mm) dans un support en PTFE.
    2. Sonication de la lamelle dans un mélange éthanol : eau ultrapure (1:1, v/v) pendant 15 min.
    3. Rincer la lamelle avec de l’eau ultrapure.
    4. Plonger la lamelle dans une solution piranha (1:1 H2SO4 (concentré) : H2O2 (30 %) (v/v)) pendant 30 min, puis rincer abondamment avec de l’eau ultrapure. Sécher la lamelle sous un flux doux d’azote (N2). Attention : la solution piranha est extrêmement corrosive. Une protection oculaire et cutanée est obligatoire.
    5. Immerger la lamelle dans un mélange 45:5:1 éthanol : eau ultrapure : 3-aminopropyl diméthyl éthoxysilane (v/v). Placer sur un agitateur à température ambiante (RT) pendant 60 min (environ 50 tr/min).
    6. Immerger la lamelle successivement dans l’éthanol et l’eau ultrapure (2 fois chacun). Sécher la lamelle sous un flux doux d’azote (N2).
    7. Faire cuire la lamelle au four (80 °C pendant 30 min).
    8. Les lamelles silanisées peuvent être conservées sous argon jusqu’à 6 semaines.
  3. Aminosilanisation des leviers (environ 1,5 h)
    REMARQUE : Le protocole décrit pour la fonctionnalisation des pointes convient aux pointes de levier en silicium.
    1. Placer les leviers sur une lame de verre propre. Traiter avec un rayonnement UV-ozone pendant 15 min.
    2. Immerger les leviers pendant 3 min dans un mélange 1:1 éthanol : 3-aminopropyl diméthyl éthoxysilane (v/v), avec une quantité catalytique (0,25 %, v/v) d’eau ultrapure.
    3. Rincer les leviers avec agitation douce successivement pendant 60 s dans des béchers contenant du toluène, de l’éthanol et de l’eau ultrapure. Sécher soigneusement les leviers sur du papier filtre entre chaque rinçage.
    4. Placer les leviers sur une lame de verre propre et faire cuire (80 °C pendant 30 min).
  4. Réduction des ponts disulfure des protéines (environ 3 h)
    Toutes les solutions doivent être préparées pour obtenir environ 30 µl de protéine diluée par levier et 20 µl de protéine diluée par lamelle. Les solutions protéiques doivent être mélangées avec le gel réducteur de disulfures Tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) dans un rapport de 1:2 (v/v).
    1. Préparer des aliquotes de billes réductrices de disulfures TCEP dans des microtubes. Il est recommandé de couper les embouts de micropipette avec des ciseaux pour élargir le diamètre de l’orifice lors du pipetage de la suspension de billes TCEP.
    2. Rincer la suspension de billes TCEP avec 1 ml de tampon TBS, puis centrifuger à 850 rcf pendant 3 min.
    3. Retirer soigneusement et jeter le surnageant à l’aide d’une micropipette.
    4. Répéter les étapes 1.4.2 à 1.4.3 deux fois.
    5. Ajouter la solution protéique concentrée (1-10 mg/ml) aux billes TCEP (1:2 protéine : suspension de billes TCEP (v/v)) et mélanger délicatement en agitant avec l’embout de micropipette. Éviter d’introduire des bulles d’air.
    6. Placer le mélange de suspension protéine/billes TCEP sur un agitateur rotatif pendant 2,5 h.
  5. PEGylation des lamelles et des leviers (environ 1,5 h)
    1. Avant la modification avec les agents de liaison NHS-PEG-maléimide, faire tremper les leviers et les lamelles aminosilanisés dans du tampon borate de sodium (pH 8,5) pendant 45 min afin de déprotoner les groupes amine primaires présents à la surface.
    2. S’assurer que la poudre de NHS-PEG-maléimide est portée à température ambiante (RT) avant d’ouvrir le flacon et de peser la quantité appropriée pour une solution à 25 mM. Le NHS-PEG-maléimide non utilisé doit être conservé sous argon à -20 °C. Environ 30 µl de solution polymère par levier, et 90 µl pour 2 lamelles (assemblées en sandwich) sont nécessaires.
    3. Après pesée du NHS-PEG-maléimide 5 kDa, ajouter le tampon borate de sodium et vortexer pour obtenir une solution à 25 mM.
      Remarque : La solution doit être utilisée aussi rapidement que possible en raison de la demi-vie extrêmement courte du NHS à pH 8,5. Le vortexage et le transfert du liquide sur les leviers/lamelles doivent être effectués en 1 à 2 min maximum.
    4. Incuber les leviers dans des gouttelettes de 30 µl de solution de NHS-PEG-maléimide dans une boîte de Pétri. Pour les lamelles, déposer 90 µl de solution de NHS-PEG-maléimide sur une lamelle unique, puis poser une seconde lamelle par-dessus, formant ainsi un sandwich avec la solution de NHS-PEG-maléimide au milieu.
    5. Incuber les leviers/lamelles avec la solution de NHS-PEG-maléimide dans une atmosphère saturée en humidité à température ambiante (RT) pendant 1 h.
  6. Conjugaison des protéines (environ 2 h)
    Critique : Minimiser l’exposition des leviers et des lamelles PEGylés à l’air.
    1. Centrifuger les solutions de protéines réduites avec les billes TCEP à 100 rcf pendant 1 min et récupérer le surnageant.
    2. Diluer la solution protéique avec du TBS. Viser une concentration protéique durant la conjugaison de surface comprise entre 0,5 et 2 mg/ml. Réserver les solutions protéiques réduites et diluées quelques minutes pendant le rinçage des leviers et des lamelles.
    3. Rincer les leviers et les lamelles dans trois béchers successifs contenant de l’eau ultrapure.
    4. Éliminer soigneusement le liquide résiduel des lamelles en touchant délicatement les bords avec du papier filtre sous un flux doux d’azote (N2). Retirer soigneusement le liquide résiduel des leviers en les touchant avec du papier filtre. Appliquer immédiatement la solution protéique diluée.
    5. Monter les lamelles dans un porte-échantillon approprié compatible avec l’instrument de microscopie à force atomique (AFM).
    6. Incuber les lamelles et les leviers PEGylés avec leurs solutions protéiques respectives diluées à température ambiante (RT) pendant 1 à 2 h.
    7. Rincer les leviers dans trois béchers successifs contenant du TBS pour éliminer les protéines non liées. Rincer les lamelles au moins 10 fois à l’aide d’une pipette.
    8. Conserver les leviers et les lamelles dans du TBS avant la mesure.

2. Acquisition des données

Dans ce travail, un microscope à force atomique (AFM) sur mesure28 commandé par un contrôleur MFP-3D d'Asylum Research et un logiciel Igor Pro personnalisé a été utilisé. La déflexion de la poutre est mesurée par la méthode de déflexion du faisceau optique29. Les protocoles de préparation des échantillons et d'analyse des données fournis ici s'appliquent indépendamment du modèle exact d'AFM utilisé. Toutefois, le modèle d'AFM doit être adapté aux mesures en milieu liquide et permettre une plage de vitesses accessible sur le piézoélectrique en z d'environ 200 à 5 000 nm/s.

  1. Monter le levier fonctionnalisé et la surface en verre sur le microscope à force atomique (AFM). Pendant toute la procédure, la surface doit rester recouverte de tampon. Lors du montage du levier, minimiser l'exposition à l'air. Une fois le faisceau laser correctement ajusté, laisser le système s'équilibrer pendant au moins 30 min afin de réduire les effets de dérive, et réajuster si nécessaire.
  2. Enregistrer un spectre de bruit thermique avec le levier éloigné de la surface, c.-à-d. en l'absence d'effets d'amortissement.
  3. Utiliser une méthode peu invasive, comme l'approche acoustique, pour localiser la surface sans endommager la pointe du levier avant la mesure. Si possible, approcher manuellement la surface avec le levier et utiliser des écouteurs pour entendre le bruit thermique sur le signal de déflexion brut provenant du contrôleur AFM. Dès que le levier s'approche de la surface, un changement net du son devient audible.
    Remarque : La pointe du levier doit maintenant se trouver à 2-5 µm de la surface. La nature du changement sonore dépend du levier utilisé. La fréquence de résonance du levier utilisé dans ce travail est d'environ 25 kHz dans l'eau, au-dessus de la plage audible humaine. En raison des effets d'amortissement près de la surface, la résonance se déplace vers des fréquences plus basses, ramenant la résonance du levier dans la plage audible. Par conséquent, une augmentation apparente de la fréquence et de l'intensité sonore est perçue.
    Dans les cas où une sortie audio du signal de déflexion n'est pas disponible, la surface peut être approchée à l'aide du piézo-z tout en maintenant une rétroaction active sur le signal de déflexion. Dès que le signal de déflexion augmente d'une quantité définie en raison de l'indentation de la surface, l'approche est arrêtée.
  4. Déterminer la sensibilité inverse du levier optique (InvOLS), qui représente la distance de déplacement de la pointe (en nm) par volt de signal de déflexion. Pour cela, effectuer une indentation de la surface avec la pointe du levier. Une tension de consigne de déflexion correspondant à un déplacement de la pointe du levier d'environ 3 nm est recommandée.
  5. Déterminer la constante de raideur du levier en ajustant une fonction de réponse d'oscillateur harmonique simple au spectre de bruit thermique, selon le théorème d'équipartition30,31.
  6. Initialiser une routine expérimentale. Pour ce travail, le jeu suivant de paramètres de mesure a été utilisé : vitesse d'approche : 3 000 nm/s ; force d'indentation : 180 pN ; temps de maintien en surface : 10 ms ; vitesses de retrait : 0,2, 0,7, 2,0, 5,0 µm/s avec des fréquences d'échantillonnage respectives de 2 000, 5 000, 15 000, 20 000 Hz ; distance de retrait : 500 nm.
    Remarque : La fréquence d'échantillonnage ne doit pas être fixée à plus de 10 points/nm afin d'éviter le suréchantillonnage et de maintenir des tailles de données raisonnables.
  7. Après chaque courbe force-distance, activer les étages piézo-x et piézo-y pour exposer une nouvelle position de la surface à la pointe du levier à chaque courbe force-distance. Cette technique permet d'échantillonner une zone plus étendue de la surface du verre de couverture lors de mesures à long terme.
  8. Utiliser un réétalonnage périodique de l'étage de déflexion (c.-à-d. position de la photodiode) et de la hauteur du châssis piézo-z pendant les mesures à long terme, au cas où le signal de déflexion dériverait hors de la plage ou que le contact avec la surface serait perdu.
  9. À la fin de la série de mesures, effectuer une autre mesure d'InvOLS avec une force d'indentation nettement plus élevée que celle utilisée avant les mesures, afin d'obtenir une valeur d'InvOLS plus précise.
  10. Enregistrer un autre spectre de bruit thermique loin de la surface. Déterminer la constante de raideur à la fin de la série expérimentale.

3. Analyse des données

Le schéma de flux de la figure 3 illustre le processus d'analyse des données. Effectuez toutes les manipulations des données à l'aide d'un logiciel approprié tel qu'Igor Pro ou MATLAB. Convertissez d'abord le signal brut provenant du détecteur en unités de force, puis corrigez l'offset et la dérive. Ensuite, utilisez des modèles d'élasticité des biopolymères pour localiser les barrières énergétiques le long des voies de dépliage et identifier les sous-domaines protéiques. Enfin, déterminez les paramètres cinétiques et énergétiques de l'interaction récepteur-ligand.

  1. Conversion d'unités et corrections de données
    1. Multiplier le signal de déflexion brut (volts) par l'InvOLS (nm/volt) et la constante de raideur (pN/nm) afin de convertir la tension du détecteur en unités de force.
    2. Décaler les données de sorte que le cantilever non chargé ait une valeur de force égale à zéro pN, en calculant d'abord la moyenne des valeurs de force des 10 % finaux de la courbe force-distance (acquises le plus loin possible de la surface), puis en soustrayant cette moyenne de toutes les valeurs de force de la courbe de données.
    3. Décaler chaque courbe selon l'axe des x de sorte que la première intersection avec l'axe des distances se produise à une distance de 0 nm.
    4. L'InvOLS dépend de la position du spot laser sur le cantilever. Même de faibles dérives du système de lecture optique peuvent provoquer des variations notables de l'InvOLS lorsque la taille du cantilever est comparable à celle du spot laser. Corriger ce phénomène par analyse du bruit du signal de déflexion à force nulle. En supposant des conditions ambiantes constantes, le bruit du signal de déflexion est directement proportionnel à l'InvOLS.
      1. Mesurer la valeur efficace (RMS) de la déflexion (niveau de bruit sous force nulle) des 10 % finaux de chaque courbe force-distance.
      2. Tracer le bruit en fonction du numéro de courbe et appliquer un ajustement approprié. Généralement, un ajustement exponentiel de la forme Formule de décroissance exponentielle, N(n_i)=N_0 * e^(-kn_i), représentation mathématique. fonctionne le mieux, où N est le bruit, ni est le numéro de courbe, et N0 et k sont des paramètres d'ajustement. Un ajustement linéaire peut également convenir pour certains jeux de données.
      3. Déterminer un facteur d'échelle (SF) pour chaque courbe :

        Équation 1 :
        Équation d'équilibre statique ; (SF)=(N₀e^(-knᵢ)+C)/(N₀e^(-knₓ)+C) ; formule mathématique
        où ni est le numéro de courbe, nf est le numéro de la dernière courbe, et C est un décalage.
      4. Diviser ensuite toutes les valeurs de force de chaque courbe individuelle par le facteur d'échelle. Cette procédure met à l'échelle chaque courbe selon le rapport entre la valeur RMS du bruit de la courbe actuelle et celle de la dernière courbe, acquise juste avant la mesure de l'InvOLS.
      5. Effectuer une correction de déflexion pour transformer l'axe des distances (z) en extension moléculaire (z*). Cela tient compte de la flexion du cantilever sous l'effet de la force, qui réduit la distance entre l'extrémité du cantilever et l'échantillon par rapport à la valeur indiquée par la position du capteur z-piézo.

        Équation 2 :
        Équation d'équilibre statique, z* = z - F/k, formule ; calculs physiques, analyse de force
        où z est la position mesurée du capteur z, F la force agissant sur le cantilever et k la constante de raideur.
  2. Analyse de la longueur de contour
    La longueur de contour d'une protéine correspond à la longueur maximale étirée de la chaîne polypeptidique. L'état de repliement d'une protéine fait référence à sa géométrie et à sa distance extrémité-à-extrémité déterminée par sa structure secondaire et tertiaire. La longueur de contour d'une protéine est directement liée à son état de repliement9,25,32. La position des ruptures spécifiques dans les courbes force-extension varie considérablement en raison de la polydispersité des linkers PEG, ainsi que de paramètres externes tels que la température, les propriétés du tampon et les taux de chargement. Cela complique l'analyse directe des données, mais peut être contourné en transformant les données force-extension dans l'espace de la longueur de contour. Cette technique permet de faire des moyennes sur de très grands ensembles de données et d'utiliser la reconnaissance automatique de motifs pour identifier les événements caractéristiques de dépliage. Il devient ainsi possible de trier les courbes de force individuelles selon le type d'interaction observé. La procédure décrite précédemment25 est utilisée pour transformer les données force-extension dans l'espace de la longueur de contour.
    1. Résoudre le modèle WLC (Équation 3)23 pour la longueur de contour L à une longueur de persistance fixe p conduit à l'Équation 4, qui fournit la longueur de contour L(x,u). Ici, x est la distance et u=F*p/kBT, où kB est la constante de Boltzmann et T la température. Seules les solutions réelles peuvent être prises en compte. Des contraintes supplémentaires sont x, F>0, L>0, x>0 ;

      Équation 3 :
      Formule force-extension, F(x,L), équation de physique des polymères, illustre l'élasticité entropique.

      Équation 4 :
      Équilibre statique, L(x,u), formule complexe, schéma éducatif, interprétation d'expression analytique.
      où,
      Équation de fonction polynomiale \( g(u) \), analyse mathématique, calcul symbolique.
    2. Tracer les points de données transformés dans un graphique force en fonction de la longueur de contour. Appliquer un seuil de force d'environ 10 pN pour exclure le bruit. Les interactions non spécifiques peuvent être exclues en appliquant un filtre passe-haut de longueur. Construire un histogramme des longueurs de contour.
    3. Effectuer une corrélation croisée33 des histogrammes obtenus avec un histogramme modèle, puis décaler selon l'axe des x pour corriger la polydispersité du PEG. Utiliser les valeurs de corrélation obtenues pour mesurer la similarité entre les courbes individuelles. Ainsi, les courbes de données peuvent être classées en catégories prédéfinies afin de simplifier l'analyse ultérieure.
    4. Utiliser une technique similaire pour détecter des motifs répétés dans une seule courbe par autocorrélation, par exemple pour le dépliage multiple de domaines Ig.
    5. Trier manuellement les courbes afin d'étudier d'autres événements de dépliage.
  3. Analyse du taux de chargement
    Extraire des informations cinétiques et énergétiques sur la dissociation récepteur-ligand en appliquant des modèles appropriés au spectre de force, c'est-à-dire le graphique de la force de rupture en fonction du logarithme naturel du taux de chargement.
    1. Pour une vitesse de traction donnée, déterminer la force de rupture et le taux de chargement pour les événements de rupture d'intérêt :
      1. Effectuer un ajustement linéaire sur une courbe force-temps au voisinage de l'événement de rupture d'intérêt. Déterminer le taux de chargement à partir de la pente de l'ajustement linéaire au pic. Répéter cette procédure pour chaque courbe montrant l'événement de rupture d'intérêt.
      2. Déterminer la force de rupture la plus probable en appliquant un ajustement gaussien à un histogramme des forces de rupture. D'autres fonctions d'ajustement sont possibles.
      3. Déterminer le taux de chargement le plus probable.
    2. Répéter les étapes 3.3.3.1 à 3.3.3.3 pour toutes les vitesses de traction.
    3. Tracer les forces de rupture les plus probables en fonction du logarithme naturel des taux de chargement les plus probables afin d'obtenir le spectre de force.
    4. Appliquer un modèle théorique approprié au spectre de force pour extraire les paramètres cinétiques et énergétiques (Figure 4C). Dans de nombreux cas, le modèle linéaire de Bell-Evans20,34 peut être utilisé et fournira de bonnes estimations de koff, la constante de dissociation en l'absence de force, et Dx, la distance jusqu'à l'état de transition le long de la coordonnée de réaction, comme indiqué dans l'Équation 5.

      Équation 5 :
      Équation statique de force ⟨F⟩, k_B T/Δx, analyse de formule pour expériences de fluctuations thermiques

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Résultats

Nous avons utilisé la procédure décrite pour étudier une paire cohésine-dockerine de type I provenant de C. thermocellum. Après la liaison réussie de la paire cohésine-dockerine, les courbes force-distance enregistrées ont révélé des profils de pics caractéristiques. Une courbe typique est présentée dans la figure 4a. Chaque pic de la courbe représente le dépliement d'un sous-domaine protéique, le dernier pic correspondant à la dissociation du complexe récepteur-ligand.

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Discussion

Pour obtenir des données significatives à partir d’expériences de spectroscopie de force à molécule unique, il est crucial d’obtenir des géométries de traction bien définies et reproductibles. Le protocole utilisé ici aboutit à l’immobilisation spécifique au site de complexes protéiques dans une géométrie de traction définie.

Les porte-à-faux utilisés dans cette étude ont été choisis en raison de leur sensibilité à la force et de leur fréquence de résonance élevée dans l’eau. De plus, la petit...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Les auteurs remercient Hermann Gaub d’avoir bénéficié d’une subvention avancée du Conseil européen de la recherche. Michael A. Nash tient à remercier le soutien financier de Society in Science - The Branco Weiss Fellowship Program. Les auteurs remercient Edward A. Bayer, Yoav Barak et Daniel B. Fried de l’Institut Weizmann des sciences pour avoir généreusement fourni les protéines utilisées dans cette étude. Les auteurs remercient Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner et Stefan W. Stahl pour leurs discussions utiles.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3-Aminopropyl diméthyl éthoxysilaneABCR GmbHAB110423
5 kDa NHS-PEG-maleimideRapp Polymer13 5000-65-35
TCEP Gel réducteur de disulfureThermo Scientific, Pierce77712www.thermoscientific.com/pierce
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane
BioLever mini cantilevers en nitrure de siliciumOlympusBL-AC40TS-C2Lots souples
XYZ Actionneurs piézoélectriquesPhysik Instrumente GmbH
Infrared " large spectre" Laser IRSuperlum
MFP-3D Contrôleur AFMAsylum Research
Igor Pro 6.31WavemetricsAcquisition et analyse de données
Chlorure
sodium Chlorure
pH mètre
Borate
Pince à
Lunettes de protectionThermo Scientific, Menzel-Glä ; ser24 mm de diamètre, 0,5 mm d’épaisseur
Porte-échantillonsur mesure
Bain
ÉthanolPureté analytique
Acide sulfurique (concentré)pureté analytique
Peroxyde d’hydrogène (30 %)pureté analytique
Agitateur orbital
Pureté analytiquetoluène
Papier
Lames
Microtubes
Micropipettes
Centrifugeuseadaptée aux microtubes
Rotator
Boîtes
de Pétri Béchers
Microscope
dede calcium de sodiumépiler en PTFE sonicateurdu filtrede verre optique

Références

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