Génération de chimères de coussinet gras des ganglions lymphatiques pour l’étude de l’origine des cellules stromales des ganglions lymphatiques

Summary

La génération de chimères de ganglion lymphatique/coussinet adipeux pour l’étude de l’origine des cellules stromales des ganglions lymphatiques est décrite. La méthode implique l’isolement des ganglions lymphatiques de souris nouveau-nées et de coussinets adipeux embryonnaires, la génération de coussinets adipeux chimériques et leur transfert sous la capsule rénale d’une souris hôte.

Abstract

Le stroma est un composant clé de la structure et de la fonction des ganglions lymphatiques. Cependant, on sait peu de choses sur son origine, sa composition cellulaire exacte et les mécanismes qui régissent sa formation. Les ganglions lymphatiques sont toujours encapsulés dans le tissu adipeux et nous avons récemment démontré l’importance de cette relation pour la formation du stroma des ganglions lymphatiques. Les cellules précurseurs des adipocytes migrent dans le ganglion lymphatique au cours de son développement et, lors de l’engagement du récepteur de la lymphotoxine b, interrompent l’adipogenèse et se différencient en cellules stromales lymphoïdes (Bénézech et al.¹⁴). Sur la base du potentiel de stroma lymphoïde du tissu adipeux, nous présentons une méthode utilisant une chimère de ganglion lymphatique/coussinet adipeux qui permet le traçage de la lignée des précurseurs des cellules stromales des ganglions lymphatiques. Nous montrons comment isoler les ganglions lymphatiques du nouveau-né et le tissu adipeux embryonnaire EYFP⁺ et fabriquer une chimère de coussinet adipeux LN/ EYFP⁺. Après transfert sous la capsule rénale d’une souris hôte, le ganglion lymphatique incorpore des cellules précurseurs locales du tissu adipeux et termine sa formation. L’analyse de la descendance des cellules du coussinet adipeux EYFP⁺ dans les ganglions lymphatiques résultants peut être effectuée par analyse cytométrique en flux des ganglions lymphatiques digérés par voie enzymatique ou par analyse par immunofluorescence des cryosections de ganglions lymphatiques. En utilisant des coussinets adipeux provenant de différents modèles de souris knock-out, cette méthode fournira un moyen efficace d’analyser l’origine des différentes populations de cellules stromales des ganglions lymphatiques.

Introduction

Les ganglions lymphatiques (LN) sont des organes clés du système immunitaire situés à des endroits stratégiques du corps, le long du réseau vasculaire lymphatique. Ils permettent la filtration des antigènes et des agents pathogènes et fournissent un site pour la présentation de l’antigène aux lymphocytes et l’induction de réponses immunitaires adaptatives. Le stroma, qui forme la structure de base du LN et orchestre le mouvement des différents participants hématopoïétiques de la réponse immunitaire adaptative, est central au fonctionnement de ces organes. Différentes populations de cellules stromales fournissent des indices essentiels et spécifiques pour les mouvements, la localisation, la survie, la prolifération et la maturation de la composante hématopoïétique du système immunitaire^1-3. Les cellules stromales LN adultes se divisent en trois catégories : les cellules endothéliales sanguines, les cellules endothéliales lymphatiques et les fibroblastes. Ces trois catégories englobent des populations hétérogènes. Les populations fibroblastiques contiennent des cellules réticulaires fibroblastiques (FRC), des cellules dendritiques folliculaires (FDC), des cellules réticulaires marginales (MRC), tandis que les fibroblastes formant la capsule, la moelle épinière et d’autres cellules qui ne sont pas encore identifiées^1-5. Les origines et les mécanismes régissant la maturation des différentes populations de cellules stromales LN sont incertains, et l’absence de marqueurs spécifiques permettant la cartographie du devenir de populations spécifiques de cellules stromales LN rend leur étude particulièrement difficile. Cependant, une compréhension complète de l’ontogenèse des cellules stromales LN est nécessaire à la compréhension des réponses immunitaires adaptatives, des mécanismes contribuant à la tolérance et est à la base du développement des LN artificiels.

Jusqu’à présent, l’étude de l’origine et du développement des cellules stromales LN s’est principalement limitée à l’évaluation directe du développement de LN chez les embryons et les nouveau-nés chez les souris de type sauvage et différentes souches^{de souris knock-out 6-9}. Ces approches sont limitées par la létalité embryonnaire et périnatale de certaines souches de souris porteuses de délétions dans des gènes importants pour le développement de LN. De plus, certains des gènes essentiels au développement du tissu lymphoïde sont également impliqués dans un large éventail de processus biologiques, comme c’est le cas pour RANK^10-11 ou NF-κB2¹². Pour résoudre ces problèmes, l’isolement et la transplantation de LN embryonnaires sous la capsule rénale d’une souris hôte ont été effectués^12-13. Cette technique permet, par exemple, le transfert de LN embryonnaires génétiquement modifiés dans un environnement de type sauvage pour évaluer le développement des organes et le recrutement et l’organisation des cellules hôtes. Cependant, la croissance du LN embryonnaire greffé sous la capsule rénale d’un hôte adulte est altérée, limitant ainsi l’utilisation de cette technique.

LNs et les dépôts de graisse sont anatomiquement étroitement associés et se développent simultanément au cours de l’embryogenèse. Nous avons récemment démontré que l’association LN/tissu adipeux joue un rôle crucial dans la fourniture de progéniteurs de cellules stromales pour les LN. En particulier, la signalisation par le LTβR contrôle le destin des cellules précurseurs des adipocytes en bloquant l’adipogenèse et en favorisant plutôt la maturation vers un phénotype¹⁴ des cellules stromales LN. Nous décrivons ici une méthode basée sur la génération de chimères de coussinets de graisse LN permettant le traçage des cellules dérivées du tissu adipeux dans le LN en développement. Cette méthode sera utile pour déterminer la contribution des tissus adipeux à différentes populations de cellules stromales LN et, combinée à l’utilisation de tissus issus de souches de souris génétiquement modifiées, permettra de mieux comprendre les mécanismes contrôlant la différenciation des différents sous-ensembles de cellules stromales LN.

Protocol

Les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions SPF dans l’unité de services biomédicaux de l’Université de Birmingham conformément aux réglementations du ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni et du comité d’éthique local. Toutes les procédures décrites dans ce protocole sont couvertes par une licence de projet approuvée à la fois par le comité d’éthique local et le ministère de l’Intérieur.

1. Isolement des LN nouveau-nés

1. Sacrifiez les souris nouveau-nées par luxation cervicale.
2. Sectionnez la tête et ouvrez le corps avec des ciseaux du haut de la région thoracique vers le bas de la région abdominale et retirez soigneusement tous les viscères (cœur, poumons, foie, intestin, rein, vessie) de la cavité abdominale.
3. Transvaser le corps dans une boîte de Pétri de 90 mm contenant du milieu RF10 (RPMI1640 milieu complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 100 U/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine). À partir de cette étape, les tissus seront conservés dans des conditions stériles et manipulés dans une hotte de culture de tissus.
4. Transférez le corps dans une nouvelle boîte de Pétri de 90 mm contenant du RF10.
5. Sous le microscope à dissection, détachez soigneusement le péritoine de la peau dans la région inguinale. Le LN inguinal est situé à l’intersection de trois vaisseaux sanguins dans le coussinet adipeux.
6. Retirez délicatement le LN. Assurez-vous que tout le tissu adipeux est enlevé. Transférez le LN dans une boîte de Pétri de 50 mm contenant un support RF10. Gardez les mouchoirs sur de la glace tout en poursuivant la procédure.

2. Isolation des coussinets adipeux E18.5

1. Pour générer des embryons de souris au jour 18,5 de la gestation (E18.5), établissez des grossesses programmées en plaçant une souris femelle et une souris mâle par cage pendant la nuit. Séparez les souris le matin et vérifiez s’il n’y a pas de bouchons vaginaux (jour de gestation E0.5).
   1. Euthanasier les femelles bouchées au 18,5e jour de la grossesse par luxation cervicale.
   2. Retirez les embryons et placez-les dans une boîte de Pétri de 90 mm contenant du RF10.
2. À partir de cette étape, les tissus doivent être manipulés à l’aide d’une technique stérile dans le capot de culture tissulaire. Sous le microscope de dissection, sectionnez la tête, ouvrez les embryons avec des ciseaux de la région thoracique jusqu’au bas de la région abdominale et retirez soigneusement tous les viscères (cœur, poumons, foie, intestin, rein, vessie) de la cavité corporelle.
3. Nettoyez le corps de tous les tissus viscéraux restants et lavez-le au PBS pour éliminer toute trace de sang qui pourrait rendre la dissection plus difficile.
4. Transférez les corps propres dans une boîte de Pétri fraîche de 90 mm contenant du RF10.
5. Détachez soigneusement le péritoine de la peau dans la région inguinale. Le LN inguinal est situé à l’intersection de trois vaisseaux sanguins dans le coussinet adipeux.
6. Retirez délicatement le LN et jetez-le. Il est très important d’enlever complètement le LN pour s’assurer que le coussinet adipeux utilisé pour les chimères n’est pas contaminé par des cellules stromales lymphoïdes.
7. Retirez le coussinet adipeux inguinal et transférez-le dans une boîte de Pétri de 50 mm contenant un média RF10. Gardez les mouchoirs sur de la glace tout en poursuivant la procédure.

3. Génération de la chimère LN-fat Pad

1. Préparer le système de culture d’organes in vitro ¹⁵.
   1. Préparation des éponges et des filtres : Cela peut être fait à l’avance et les éponges et les filtres peuvent être conservés stériles dans une boîte de Pétri dans la hotte de culture.
      1. Coupez le Vulkan Underwrap en 1-1,5 cm² morceaux
      2. Faites bouillir les éponges pendant 2 heures dans de l’eau distillée.
      3. Laissez sécher les éponges pendant quelques heures dans la hotte de culture cellulaire.
      4. Faites bouillir les filtres pendant 20 min.
      5. Laissez sécher les filtres pendant quelques heures dans la hotte de culture cellulaire.
   2. Préparez un milieu DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 10 mM de HEPES, 1 solution d’acides aminés non essentiels MEM, 50 mM de 2-Mercaptoéthanol, 100 U/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine et 2 mM de L-Glutamine.
   3. Ajouter 2 ml de média dans une boîte de Pétri de 50 mm.
   4. Disposez une éponge au fond de la boîte de Pétri. Mouillez les deux côtés de l’éponge en les immergeant dans le support.
   5. Placez un filtre sur l’éponge. Le filtre est positionné à l’interface liquide-air.
2. Sous le microscope de dissection, réassociez soigneusement un LN nouveau-né à un coussinet adipeux embryonnaire.
3. Placez la chimère du tampon LN-fat sur le filtre.
4. Transférez la boîte de Pétri dans une boîte en plastique rectangulaire avec quelques trous sur le couvercle et contenant de l’eau au fond pour assurer l’humidité.
5. Fermez le couvercle de la boîte avec du ruban adhésif. Laissez les deux trous du couvercle ouverts.
6. Transférez la boîte dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO₂. Laissez la boîte s’équilibrer pendant 2 heures, avant de sceller les trous du couvercle avec du ruban adhésif.
7. Incuber les tissus pendant au moins 2 jours pour permettre au LN de se fixer au coussinet adipeux et d’être transférable sous la capsule rénale.

4. Transfert de la chimère du tampon de graisse LN sous la capsule rénale de souris hôtes

1. Récupérez les chimères du tampon LN-fat du filtre et transférez-les sous la capsule rénale de souris hôtes. La méthode de transfert par capsule rénale a déjà été décrite ¹⁶.

5. Isolation des LN transférées

1. Après 3-4 semaines sous la capsule rénale, les chimères des coussinets de graisse LN sont prêtes à être récoltées. Euthanasier les souris hôtes en suivant les directives approuvées.
2. Retirez le rein des souris hôtes.
3. Sous le microscope de dissection, isolez la chimère du tampon LN-graisse et disséquez le LN.

6. Digestion enzymatique des LN transférés pour l’analyse par cytométrie en flux

1. Faites une incision dans le LN avec de petits ciseaux pour permettre aux enzymes de pénétrer dans l’organe et faciliter la digestion.
2. Placer un LN dans 1,5 ml d’Eppendorf contenant 600 μl de tampon de digestion (RPMI 1 % FCS, 2,5 mg/ml de collagénase D, 100 μg/ml de DNase I).
3. Incuber pendant 30 min à 37 °C sur un bloc thermique agitant. Pipette de haut en bas pour aider à la dissociation des tissus toutes les 10 min.
4. Ajoutez 6 μl d’EDTA 0,5 M dans le tube et pipetez de haut en bas pour terminer la dissociation des tissus.
5. Centrifugeuse pendant 5 min à 490 x g.
6. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans la solution de coloration (PBS, 0,1 % BSA, 5 % de sérum de rat et 5 % de sérum de souris) contenant la combinaison d’anticorps primaires.
7. Incuber 30 min sur glace.
8. Laver deux fois en PBS
9. Incuber avec des anticorps secondaires pendant 20 minutes si nécessaire.
10. Laver 2x dans du PBS.
11. Analyser sur cytomètre en flux.

7. Analyse des LN transférés par immunofluorescence

1. Fixation pour la conservation de l’EYFP pendant le processus de congélation et de cryosections : Placez le LN dans une solution de PBS, 4 % de PFA et 10 % de saccharose et laissez agir 3-4 heures.
2. Mettez une seule petite goutte de composé O.C.T. froid sur un petit morceau de papier d’aluminium. Évitez les bulles d’air. Placez soigneusement le LN sans aucun liquide au milieu de la goutte.
3. Congelez l’organe en plaçant la feuille d’aluminium sur de la glace sèche.
4. Découpez des sections de 8 à 10 μm sur des lames de verre adhésives supplémentaires à l’aide d’un cryostat. Laissez sécher les lames pendant 2 heures avant de les stocker à -20 °C.
5. Les procédures de coloration peuvent varier en fonction des anticorps primaires utilisés et peuvent être optimisées à partir du protocole suivant. Colorer les sections avec une solution de coloration (PBS, 1 % BSA) contenant la combinaison d’anticorps primaires.
6. Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humidifiée.
7. Laver deux fois dans du PBS pendant 5 min
8. Incuber avec des anticorps secondaires pendant 1 heure.
9. Laver deux fois au PBS pendant 5 min.
10. Montez les diapositives dans un support de montage contenant du DAPI.
11. Capturez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence ou confocal.

Results

Trois semaines après la transplantation, la chimère LN/coussinet adipeux est récupérée du rein. La chimère est maintenant très similaire à un LN normal dans son propre coussinet adipeux, et le LN est visible au centre du tissu adipeux (Figure 1). Si le LN ne peut pas être identifié, il est possible qu'il ait été perdu lors de la transplantation sur le rein. Lors de l’évaluation du rôle de gènes potentiellement importants dans le développement des LN, les LN récupérés peuvent rester très petits et plus di...

Discussion

Dans cet article, nous avons présenté une méthode pour doser et quantifier la contribution des cellules progénitrices du tissu adipeux aux LN en développement et deux techniques qui permettent l’analyse de leur descendance. La dissection des coussinets adipeux embryonnaires et des LN nouveau-nés est délicate et nécessite des compétences manuelles acquises par beaucoup de pratique avant la génération de la chimère réelle des coussinets graisseux LN. Pour contrôler la qualité des dissections, une analyse cytométrique en fl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
50 mm Boîte de Pétri Sterilin	Appleton Woods	SC265
Boîte de Pétri Sterilin 90 mm	Appleton Woods	SC260
Lames adhésives	Surgipath	00202
Anti-souris CD31 eFluor 450	eBioscience	48-0311
Anti-souris CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
Anti-souris CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
Anti-souris IgM Rhodamine Rouge	Stratech	715-296-020-JIR
Anti-souris Podoplanin PE/Cy7	Biolegend	127411
Anti-souris Podoplanin purifié	eBioscience	14-5381
Collagénase D	Roche
DMEM Medium	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Dumont #5 Forceps Inox Biologie	FST	11252-20	Pince extra fine pour dissections embryonnaires et néonatales
Solution EDTA 0.5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogenesis
Sérum fœtal bovin	Sigma	F9665
Ciseaux à iris fins trempés droits 11 cm	FST	14090-11	Petits ciseaux pour la dissection
HEPES solution	Sigma	H0887
Filtres à membrane isopore 0.8 &mu ; m ATTP	Millipore	ATTPO 1300
L-Glutamine solution	Sigma	G7513
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)	Sigma	M7145
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Pénicilline-Streptomycine	Sigma	P4458
Boîte en plastique avec couvercle	Watkins and Doncaster	E6052	Boîte à sandwich pour la culture d’organes in vitro. Percez deux trous dans le couvercle pour permettre l’échange gazeux dans l’incubateur CO2.
RPMI 1640 Medium	Sigma	R0883
Éponges Vulkan Underwrap	Patterson Medical	004383
Stereomicroscope	Leica	LEICA MZ95	Microscope de dissection avec zoom
Thermomixer	Eppendorf	5436
Vectashield Medium avec DAPI	Vector Laboratories	H-1200